大批量藍(lán)藻樣品中葉綠素的快速高效提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種大批量藍(lán)藻樣品中葉綠素的快速高效提取方法，取OD680為1.0的銅綠微囊藻培養(yǎng)液離心后，收集銅綠微囊藻菌體；然后將菌體在沸水中分別處理3min，室溫下（25℃）自然冷卻后，加入4mL丙酮充分混勻，離心后得到的上清液即為葉綠素提取液。該方法能使藍(lán)藻葉綠素提取時(shí)間明顯減少，且操作方便，提取效果高。本發(fā)明應(yīng)用于多樣品大批量的藍(lán)藻葉綠素提取優(yōu)勢(shì)顯著。
【專利說(shuō)明】大批量藍(lán)藻樣品中葉綠素的快速高效提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，特別涉及一種大批量藍(lán)藻樣品中葉綠素的快速高效提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]葉綠素是存在于部分藍(lán)藻以及一切綠色植物等的一種天然、無(wú)毒、且具有一定生理功能的脂溶性天然色素，其產(chǎn)品用途廣泛，例如在食品、醫(yī)藥化工行業(yè)都具有廣泛的用途。作為脂溶性的色素，葉綠素不溶于水，可溶于丙酮、乙醇等有機(jī)溶劑中，因此以上試劑常作為提取葉綠素的有效溶劑。
[0003]藍(lán)藻是最早的光合放氧生物，是浮游藻類的一種，對(duì)地球表面從無(wú)氧的大氣環(huán)境變?yōu)橛醒醐h(huán)境起了巨大的作用。藍(lán)藻常以細(xì)胞群形式出現(xiàn)時(shí)才容易看見，也就是我們通常見到的“水華”。由于部分藍(lán)藻能夠產(chǎn)生具有毒性的次級(jí)代謝產(chǎn)物一藻毒素，因此對(duì)于由藍(lán)藻引起的水華的治理成為了目前環(huán)保界的一大課題，而在對(duì)藍(lán)藻的研究中，常以葉綠素含量作為衡量藍(lán)細(xì)胞生物量的指標(biāo)之一。
[0004]目前葉綠素的常用提取方法有:1.有機(jī)溶劑萃取法。該方法提取時(shí)間長(zhǎng)，提取效率低。2.吸附樹脂萃取法。整個(gè)過(guò)程包括有機(jī)溶劑提取，樹脂吸附以及洗脫濃縮等步驟，操作麻煩且總提取時(shí)間長(zhǎng)。3.超臨界CO2萃取法。該方法實(shí)驗(yàn)條件要求高，總提取時(shí)間長(zhǎng)。
4.超聲萃取法等。該方法 雖然葉綠素萃取效率高，但是不適合大批量樣品提取。由于以上各種方法操作過(guò)程中存在的種種不便，同時(shí)參考實(shí)驗(yàn)室葉綠素提取過(guò)程中切實(shí)存在的問(wèn)題，有必要對(duì)葉綠素的提取方法進(jìn)行改良。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種大批量藍(lán)藻樣品中葉綠素的快速聞效提取方法。
[0006]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:取OD68tl為1.0的銅綠微囊藻培養(yǎng)液5mL, 12000rpm離心5min,收集銅綠微囊藻菌體；將上述銅綠微囊藻菌體加入到含有ImL無(wú)菌水的離心管中，離心管在沸水中加熱3min，然后室溫下(25°C)自然冷卻后，向離心管中加入4mL丙酮充分混勻，12000rpm離心5min,收集上清液,即得到葉綠素提取液。
[0007]本發(fā)明的有益效果是:
藍(lán)藻葉綠素提取時(shí)間明顯減少。藍(lán)藻葉綠素作為衡量藍(lán)藻生物量的重要指標(biāo)之一，是水華治理效果的表征之一。本發(fā)明中葉綠素提取時(shí)間的減少主要體現(xiàn)在細(xì)胞壁破碎以及葉綠素的浸提過(guò)程中，尤其在多樣品葉綠素提取過(guò)程中時(shí)間減少效果更加明顯。
[0008]操作方便，提取效果高。本發(fā)明首先通過(guò)對(duì)常用的超聲萃取法提取葉綠素法進(jìn)行優(yōu)化，以該優(yōu)化后的方法作為參照，與改良的沸水浴法提取葉綠素效果相比較得知，沸水浴法提取到的葉綠素的量高于優(yōu)化的超聲萃取法提取的葉綠素的量，而且在整個(gè)提取過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)條件要求簡(jiǎn)單，操作方法更加簡(jiǎn)捷。[0009]本發(fā)明應(yīng)用于多樣品大批量的藍(lán)藻葉綠素提取優(yōu)勢(shì)顯著。主要體現(xiàn)在多樣品葉綠素提取時(shí)使用沸水浴法破碎細(xì)胞壁，比起超聲法破碎細(xì)胞壁節(jié)省了大量的時(shí)間，而且由于沸水浴法可以多樣品同時(shí)操作，減少了細(xì)胞破碎時(shí)同批次各樣品間由于實(shí)驗(yàn)等待引起葉綠素光解而造成的實(shí)驗(yàn)誤差。因此本方法更加適用于多樣品藍(lán)藻葉綠素的同時(shí)提取。
[0010]具體步驟如下:
一種大批量藍(lán)藻樣品中葉綠素的快速高效提取方法，該方法具體為:取OD68tl為1.0的銅綠微囊藻培養(yǎng)液5mL, 12000rpm離心5min,收集銅綠微囊藻菌體；將上述銅綠微囊藻菌體加入到含有ImL無(wú)菌水的離心管中，離心管在沸水中加熱3min，然后室溫下(25°C)自然冷卻后，向離心管中加入4mL丙酮充分混勻，12000rpm離心5min，收集上清液，即得到葉綠素提取液。
[0011]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明。
[0012]對(duì)比實(shí)施例:常用的葉綠素的超聲萃取法
取5mL銅綠微囊藻培養(yǎng)液(OD68tl=L O), 12000rpm離心5min,收集菌體；將上述銅綠微囊藻菌體加入到含有ImL無(wú)菌水的離心管中，超聲波破碎細(xì)胞(10s, 1s),分別破碎45次即總時(shí)間為15min。細(xì)胞破碎后，向離心管中加入4mL丙酮，黑暗處室溫(25°C)靜置0.5h后，12000rpm離心5min。取各自上清測(cè)定OD75tl, OD663, OD645, OD63tl,通過(guò)以下公式計(jì)算出葉綠素含量 P (Chla) (μ g/L):
P (Chla) (μ g/L) =11.64X (OD663 — OD750) — 2.16X (OD645 — OD750) +0.1X (OD630 —
OD750)
通過(guò)計(jì)算得到通過(guò)該方法提取的葉綠素濃度為3.05 μ g/L。
[0013]實(shí)施例1
取OD68tl為1.0銅綠微囊藻培養(yǎng)液5mL, 12000rpm離心5min,收集銅綠微囊藻菌體；將上述銅綠微囊藻菌體分別加入到5根含有ImL無(wú)菌水的離心管中，5根離心管分別在沸水中加熱3min、5min、10min、15min、20min,然后室溫下(25°C)自然冷卻后，向5根離心管中分別加入4mL丙酮充分混勻，12000rpm離心5min，上清液即為葉綠素提取液。取各自上清測(cè)定OD750, OD663, OD645, OD63tl,通過(guò)公式計(jì)算出葉綠素含量 P (Chla) ( μ g/L):
P (Chla) (μ g/L) =11.64X (OD663 — OD750) — 2.16X (OD645 — OD750) +0.1X (OD630 —OD750)。
[0014]表1不同沸水浴處理時(shí)間后葉綠素提取量
【權(quán)利要求】
1.一種大批量藍(lán)藻樣品中葉綠素的快速高效提取方法，其特征在于，該方法具體為:取OD68tl為1.0的銅綠微囊藻培養(yǎng)液5mL, 12000rpm離心5min,收集銅綠微囊藻菌體；將上述銅綠微囊藻菌體加入到含有ImL無(wú)菌水的離心管中，離心管在沸水中加熱3min，然后室溫下(25°C )自然冷卻后，向離心管中加入4mL丙酮充分混勻，12000rpm離心5min，收集上清液，即得到葉綠素提 取液。
【文檔編號(hào)】C09B61/00GK104031053SQ201410289771
【公開日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年6月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月26日
【發(fā)明者】孫朋飛, 趙宇華, 王冠, 盧麗玲 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)