一種葉酸靶向聚丁二炔顯色納米粒及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種葉酸靶向聚丁二炔顯色納米粒及其制備方法，所述葉酸靶向聚丁二炔顯色納米粒包括聚丁二炔納米粒，特別是，還包括形成在所述聚丁二炔納米粒表面與所述聚丁二炔納米粒通過化學(xué)鍵連接的葉酸分子。本發(fā)明的葉酸靶向聚丁二炔顯色納米粒在聚丁二炔納米粒的基礎(chǔ)上接入了葉酸分子，使得這種顯色納米粒即包含了聚丁二炔的變色功能，又保留了葉酸的靶向作用。
【專利說明】一種葉酸靶向聚丁二炔顯色納米粒及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種葉酸靶向聚丁二炔顯色納米粒及其制備方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 含有丁二炔（diacetylene，DA)結(jié)構(gòu)（-C e C-C e C-)的類脂在一定表面壓力 下疏水鏈會(huì)形成高度有序而緊密的排列，在254 nm的紫外光照射下通過拓?fù)渚酆闲纬伤{(lán) 色的聚丁二炔（polydiacetylene，PDA)結(jié)構(gòu)。這種聚丁二炔結(jié)構(gòu)隨著所處環(huán)境的溫度、 溶劑、pH、機(jī)械應(yīng)力及特異性結(jié)合的改變，其顏色都會(huì)發(fā)生藍(lán)色到紅色的變化，是生物傳 感器中的信號(hào)傳輸元件的理想材料。1969年Wegner對(duì)其進(jìn)行了首次報(bào)道，自此，聚丁二 炔成為各國(guó)科學(xué)家研究的熱點(diǎn)，對(duì)其制備、結(jié)構(gòu)、性質(zhì)、應(yīng)用等各個(gè)方面進(jìn)行了深入研究。 1993年D. H. Charyc等人利用化學(xué)方法在10，12 -二十五烷基二炔酸單體（10，12 -Pentacosadiynoic acid, PCDA)的羧基端修飾了流感病毒的特異性受體唾液酸，并將這種 修飾的含有丁二炔結(jié)構(gòu)的單體和未修飾的單體混合，制備聚合的變色LB膜，利用唾液酸與 流感病毒表面凝集素（hemagglutinin,HA)能夠特異性識(shí)別的原理來實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。研究顯示， 隨著流感病毒增加，聚丁二炔變色程度（CR%)也隨之增加，它們之間成正相關(guān)。
[0003] 脂質(zhì)體具有與生物體細(xì)胞相類似的結(jié)構(gòu)，因此有很好的細(xì)胞相容性。將脂質(zhì)類化 合物引入到囊泡，并在不會(huì)改變聚丁二炔結(jié)構(gòu)的顯色性和變色性的前提下，制備了聚丁二 炔/脂質(zhì)的混合囊泡，應(yīng)用于水溶液中活性多肽分子與脂質(zhì)膜作用的研究以及某些特殊藥 物的篩選。
[0004] 葉酸對(duì)葉酸受體具有高度的親和性，并且是細(xì)胞增殖時(shí)堿基合成所必須的維生 素，很多研究發(fā)現(xiàn)葉酸受體在多種惡性腫瘤細(xì)胞表面高水平表達(dá)。葉酸靶向納米載體轉(zhuǎn)基 因治療腫瘤成為近年來國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明目的在于提供一種既有聚丁二炔的色變功能，又有 葉酸的靶向作用的葉酸靶向聚丁二炔顯色納米粒。
[0006] 本發(fā)明同時(shí)還提供一種葉酸靶向聚丁二炔顯色納米粒的制備方法，該制備方法工 藝簡(jiǎn)單、性質(zhì)穩(wěn)定且成本低。
[0007] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下： 一種葉酸靶向聚丁二炔顯色納米粒，包括聚丁二炔納米粒，所述葉酸靶向聚丁二炔顯 色納米粒還包括形成在所述聚丁二炔納米粒表面與所述聚丁二炔納米粒通過化學(xué)鍵連接 的葉酸分子。
[0008] 所述聚丁二炔納米粒由含有丁二炔結(jié)構(gòu)的單體和磷脂分子的混合物，在254 nm的 紫外光照射下通過拓?fù)渚酆闲纬伞?br> [0009] 所述含有丁二炔結(jié)構(gòu)的單體具有羧基，包括所有能呈現(xiàn)藍(lán)色-紅色變化的單體， 如10，12-二十五二炔酸（PCDA)，但并不局限于它。
[0010] 所述磷脂分子并不僅限于合成磷脂，也不限于天然磷脂，較好為天然磷脂和合成 磷脂的混合物。
[0011] 所述磷脂分子可以選用二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿（DMPC)、二棕櫚酰-a磷脂酰膽堿 (DPPC)、大豆卵磷脂（PC)等。
[0012] 一種上述葉酸靶向聚丁二炔顯色納米粒的制備方法，該方法包括以下步驟： (1) 制備聚丁二炔納米粒溶液； (2) 取出一定量步驟（1)所述聚丁二炔納米粒溶液，在所述聚丁二炔納米粒溶液中加入 過量的1-乙基-3- (3-二甲基氨丙基）-碳化二亞胺（EDC)和過量的羥基琥珀酰亞胺（NHS)， 室溫避光振蕩1.5~3 h，然后加入葉酸，室溫振蕩16~18 h，反應(yīng)完成后，用純水透析23~25 h，制得葉酸靶向聚丁二炔顯色納米粒。
[0013] 步驟（1)中，所述聚丁二炔納米粒溶液的制備方法為：將含有丁二炔結(jié)構(gòu)的單體 和磷脂分子溶于有機(jī)溶劑中混合，然后除去所述有機(jī)溶劑，再加入去離子水，使得所述含 有丁二炔結(jié)構(gòu)的單體的濃度為0. 〇5~1 mmol/L，然后在70~76°C下，超聲分散:Tl5min，直至 溶液呈透明或半透明狀，用0. 8 μ m濾膜濾去未分散的組分，然后置于4°C下16~18 h，再放 置在室溫下，待所述溶液恢復(fù)到室溫后置于波長(zhǎng)為254 nm的紫外光下照射2~30 min，得到 藍(lán)色或深藍(lán)色的聚丁二炔納米粒的溶液。
[0014] 所述葉酸與所述含有丁二炔結(jié)構(gòu)的單體的摩爾比為1:2~1:10。
[0015] 上述步驟（1)中，所述磷脂分子與所述含有丁二炔結(jié)構(gòu)的單體的摩爾比并不局限 于一種特定的比例，而包括所有可能存在的比例，并不改變聚丁二炔的變色反應(yīng)。優(yōu)選摩爾 比為2:3。
[0016] 所述磷脂分子為天然磷脂和合成磷脂按摩爾比為1:1組成的混合物。
[0017] 上述步驟（2)中，所述1-乙基-3- (3-二甲基氨丙基）-碳化二亞胺（EDC)和所述 羥基琥珀酰亞胺（NHS)的摩爾比為1:1。
[0018] 本發(fā)明最后制得的葉酸靶向聚丁二炔顯色納米粒，采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其接 入葉酸的含量，測(cè)試選用286nm。
[0019] 由于上述技術(shù)方案的實(shí)施，本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)： 本發(fā)明的葉酸靶向聚丁二炔顯色納米粒在聚丁二炔的基礎(chǔ)上引入了形成磷脂雙分子 層的磷脂分子，并接入葉酸分子，使得這種納米粒即包含了聚丁二炔的色變功能，又保留了 葉酸的靶向作用。
[0020] 本發(fā)明的葉酸靶向聚丁二炔顯色納米粒具有顯色性和變色性。
[0021] 本發(fā)明的葉酸靶向聚丁二炔顯色納米粒性質(zhì)穩(wěn)定、可以在體外快速檢測(cè)腫瘤細(xì) 胞。
[0022] 本發(fā)明的制備方法簡(jiǎn)單易行，便于操作推廣。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1為本發(fā)明的葉酸靶向聚丁二炔顯色納米粒的結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2為實(shí)施例一的聚丁二炔納米粒的色變圖； 圖3為實(shí)施例一的聚丁二炔納米粒的紫外圖譜； 圖4為實(shí)施例一的聚丁二炔納米粒的粒徑圖。

【具體實(shí)施方式】
[0024] 在聚丁二炔顯色納米粒表面修飾葉酸分子，在外加紫外及葉酸雙重主動(dòng)靶向作用 下，將加強(qiáng)靶細(xì)胞對(duì)目的基因攝取。
[0025] 本發(fā)明的葉酸靶向聚丁二炔顯色納米粒，結(jié)構(gòu)如圖1所示，其通過疏水相互作用 以非共價(jià)鍵力的形式在聚丁二炔分子中加入一種或幾種不同的磷脂分子，形成磷脂雙分子 層，組裝成聚丁二炔混合納米粒，這種聚丁二炔納米?？梢酝ㄟ^化學(xué)鍵將葉酸分子連接到 該納米粒表面，利用其特異性結(jié)合的特點(diǎn)，使其產(chǎn)生快速的肉眼可見的明顯顏色變化。這類 葉酸靶向聚丁二炔顯色納米粒具有制備簡(jiǎn)單、成本低、快速檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，可以通過色變反應(yīng) 定性或定量檢測(cè)生物活性分子的存在，可廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)，如活性藥物篩選、臨床檢 驗(yàn)診斷等方面。
[0026] 下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行說明。
[0027] 實(shí)施例1 將10, 12-二十五二炔酸（PCDA)、二肉豆蘧酰磷脂酰膽堿（DMPC)、大豆卵磷脂（PC)以摩 爾比例3 : 1 : 1溶于氯仿中，真空干燥至恒重除去氯仿，再用一定量的去離子水溶解，調(diào) 整PCDA的濃度為1 mmol/L，在72 °C下，超聲分散10 min，直至溶液呈透明狀，保溫30 min， 冷卻至室溫后，用0.8 μπι濾膜濾去未分散的組分，溶液置于4 °C 16 h。待溶液恢復(fù)到室 溫后，將溶液置于波長(zhǎng)為254 nm的紫外光下照射30 min，通過紫外跟蹤變色(如圖2~3)，得 到藍(lán)色的聚丁二炔混合磷脂顯色顆粒，顆粒粒徑范圍為50 - 800 nm (如圖4)。其中，紫外 圖譜采用紫外-可見光譜儀測(cè)定，顆粒粒徑采用Malvern ZetasizerNano ZS測(cè)定。
[0028] 圖2顯示在紫外照射過程中，隨著照射時(shí)間的延長(zhǎng)，聚丁二炔顏色由無色變?yōu)闇\ 藍(lán)色，直至深藍(lán)色。圖3為對(duì)變色機(jī)理的解釋。
[0029] 取50 μ L PCDA/DMPC/PC(1 mmol/L)變色顆粒，加入6 μ L 4 mmol/L NHS和6 μ L 4 mmol/L EDC，室溫避光振蕩2 h，活化羧基端。加入葉酸，葉酸的加入量按葉酸與PCDA的 摩爾比為1:10加入，室溫振蕩17 h，反應(yīng)結(jié)束后，用純水透析24 h除去未反應(yīng)的葉酸，即得 葉酸靶向聚丁二炔顯色納米粒，接入葉酸的含量采用紫外分光光度計(jì)測(cè)定（286 nm)，測(cè)得 接入的葉酸含量為〇. 877 mg/L。
[0030] 實(shí)施例2 本實(shí)施例中相比實(shí)施例1，只改變?nèi)~酸的加入量，葉酸的加入量按葉酸與PCDA的摩爾 比為1:5加入，最后制得的葉酸靶向聚丁二炔顯色納米粒上的葉酸含量為2. 110 mg/L。
[0031] 實(shí)施例3 本實(shí)施例中相比實(shí)施例1，只改變?nèi)~酸的加入量，葉酸的加入量按葉酸與PCDA的摩爾 比為3:10加入，最后制得的葉酸靶向聚丁二炔顯色納米粒上的葉酸含量為2.642 mg/L。
[0032] 實(shí)施例4 本實(shí)施例中相比實(shí)施例1，只改變?nèi)~酸的加入量，葉酸的加入量按葉酸與PCDA的摩爾 比為1:2. 5加入，最后制得的葉酸靶向聚丁二炔顯色納米粒上的葉酸含量為3. 560 mg/L。
[0033] 綜上所述，本發(fā)明的葉酸靶向聚丁二炔顯色納米粒具有如下優(yōu)點(diǎn)： (1)本發(fā)明使用的天然磷脂以大豆卵磷脂(磷脂酰膽堿，PC)為主，來源于蛋黃和大豆， 成本低；本發(fā)明使用的合成磷脂具有與生物細(xì)胞相類似的結(jié)構(gòu)，因此有很好的生物相容性， 同時(shí)可以提1?納米粒的穩(wěn)定性。
[0034] ( 2 )制備的顯色納米粒通過摻雜含有丁二炔結(jié)構(gòu)的單體進(jìn)入兩親性的脂質(zhì)納米顆 粒小體，可以形成穩(wěn)定的微組裝結(jié)構(gòu)。這種微組裝結(jié)構(gòu)在溫度、溶劑、pH、機(jī)械應(yīng)力及交變磁 場(chǎng)等條件下，其顏色會(huì)發(fā)生藍(lán)色-紅色的變化。
[0035] (3)采用超聲分散法制備聚丁二炔納米粒，所制備出的納米粒粒徑均勻，分布范圍 窄，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
[0036] (4)制備的聚丁二炔納米粒通過碳化二胺法接入葉酸分子，得到具有色靶向及葉 酸分子祀向的納米粒。
[0037] ( 5)本發(fā)明的制備方法簡(jiǎn)便易行，便于操作推廣。
[0038] 以上對(duì)本發(fā)明做了詳盡的描述，其目的在于讓熟悉此領(lǐng)域技術(shù)的人士能夠了解本 發(fā)明的內(nèi)容并加以實(shí)施，并不能以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍，且本發(fā)明不限于上述的實(shí)施 例，凡根據(jù)本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種葉酸靶向聚丁二炔顯色納米粒，包括聚丁二炔納米粒，其特征在于，還包括形成 在所述聚丁二炔納米粒表面與所述聚丁二炔納米粒通過化學(xué)鍵連接的葉酸分子。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的葉酸靶向聚丁二炔顯色納米粒，其特征在于，所述聚丁二炔 納米粒由含有丁二炔結(jié)構(gòu)的單體和磷脂分子的混合物，在254 nm的紫外光照射下通過拓?fù)?聚合形成。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的葉酸靶向聚丁二炔顯色納米粒，其特征在于，所述含有丁二 炔結(jié)構(gòu)的單體具有羧基。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的葉酸靶向聚丁二炔顯色納米粒，其特征在于，所述含有丁二 炔結(jié)構(gòu)的單體為10, 12-二十五二炔酸。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的葉酸靶向聚丁二炔顯色納米粒，其特征在于，所述磷脂分子 為合成磷脂和天然磷脂組成的混合物。
6. -種如權(quán)利要求1~5中任一項(xiàng)權(quán)利要求所述的葉酸靶向聚丁二炔顯色納米粒的制 備方法，其特征在于，所述制備方法包括以下步驟： (1) 制備聚丁二炔納米粒溶液； (2) 取出一定量步驟（1)所述聚丁二炔納米粒溶液，在所述聚丁二炔納米粒溶液中加入 過量的1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基）-碳化二亞胺和過量的羥基琥珀酰亞胺，室溫避光振 蕩1.5~3 h，然后加入葉酸，室溫振蕩16~18 h，反應(yīng)完成后，用純水透析23~25 h，制得葉酸 靶向聚丁二炔顯色納米粒。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟（1)中，所述聚丁二炔納米粒溶 液的制備方法為：將含有丁二炔結(jié)構(gòu)的單體和磷脂分子溶于有機(jī)溶劑中混合，再除去所述 有機(jī)溶劑，然后加入去離子水，使得所述含有丁二炔結(jié)構(gòu)的單體的濃度為〇. 〇5~1 mmol/L， 在70~76°C下，超聲分散3~15min，直至溶液呈透明或半透明狀，用0. 8 μ m濾膜濾去未分散 的組分，然后置于4°C下16~18 h，再放置在室溫下，待溶液恢復(fù)到室溫后置于波長(zhǎng)為254 nm 的紫外光下照射2~30 min，得到藍(lán)色或深藍(lán)色的聚丁二炔納米粒的溶液。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述葉酸與所述含有丁二炔結(jié)構(gòu)的 單體的摩爾比為1:2~1:10。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述磷脂分子與所述含有丁二炔結(jié) 構(gòu)的單體的摩爾比為2:3,所述磷脂分子為合成磷脂和天然磷脂按摩爾比為1:1組成的混 合物。
【文檔編號(hào)】C09K9/02GK104119629SQ201410337431
【公開日】2014年10月29日 申請(qǐng)日期:2014年7月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月16日
【發(fā)明者】劉 東, 鄭明彬, 黃桂賢 申請(qǐng)人:江蘇東博生物醫(yī)藥有限公司