含高抗鎘污染菌株的生物有機肥料及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種含高抗鎘污染菌株的生物有機肥料，按重量份計由如下成分組成：核心菌劑4-6份；離子拮抗劑1-3份；精制有機肥料91-95份。本發(fā)明還提出所述含高抗鎘污染菌株的生物有機肥料的生產(chǎn)與應(yīng)用。本發(fā)明的核心菌劑中的微生物菌種是從鎘污染區(qū)的稻田魚池的污泥中特別篩選出來的優(yōu)勢菌株，功能強大，能迅速在土壤中定植生長并形成強大菌落，通過其生活繁衍作用,改變重金屬鎘在土壤中的化學(xué)形態(tài),使其固定、鈍化或解毒,降低其在土壤環(huán)境中的移動性和生物可利用性;該菌落還能直接吸附重金屬離子鎘Cd＋到微生物細(xì)胞璧或細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行代謝，加上離子拮抗劑和精制有機肥料的共同作用，達(dá)到對重金屬鎘的削減、凈化與固定。
【專利說明】含高抗鎘污染菌株的生物有機肥料及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)微生物應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及含有活性菌劑的生物有機肥料及其制 備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著工業(yè)化和農(nóng)業(yè)集約化經(jīng)濟的發(fā)展，我國耕地重金屬污染狀況越來越嚴(yán)重。20 世紀(jì)90年代初，我國鎘污染耕地面積達(dá)1. 3 X 104hm2,涉及11個省市的25個地區(qū)。據(jù)湖南 省重金屬污染專項調(diào)查和近年來的農(nóng)業(yè)環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測結(jié)果表明，湖南省被鎘污染的耕地面 積己占全省耕地總面積的23. 7，還有27%左右的農(nóng)田灌溉水和25%左右的農(nóng)田大氣受到了 不同程度的污染。為了減少水稻對鎘的吸收累積，目前國內(nèi)外主要研究了兩種方式：一是 將土壤中的鎘轉(zhuǎn)化為難溶態(tài)，即土壤中的活性態(tài)鎘被鈍化，從而使作物難以吸收；二是將 鎘從土壤中去除，即利用工程或生物的方法修復(fù)鎘污染土壤。后者因工程修復(fù)所需資金較 大，難以進(jìn)行大面積推廣。因此，研究如何降低和鈍化固定土壤中的鎘等重金屬的方法，具 有重大的現(xiàn)實意義。本發(fā)明的一種含高抗鎘污染菌株的生物有機肥料，其核心菌劑中的微 生物菌種是從鎘污染區(qū)稻田魚塘的污泥中特別篩選出來的優(yōu)勢菌株，功能強大，能迅速在 土壤中定植生長并形成強大菌落，通過其生活繁衍作用，改變重金屬鎘在土壤中的化學(xué)形 態(tài)，使其固定或解毒，降低其在土壤環(huán)境中的移動性和生物可利用性；該菌落還能直接吸 附重金屬離子鎘Cd +到微生物細(xì)胞璧或細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行代謝，加上本發(fā)明中加入的離子拮抗劑 和有機肥料的共同作用，達(dá)到對重金屬鎘的削減、凈化與固定。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 針對本領(lǐng)域的不足之處，實現(xiàn)對重金屬鎘的削減、凈化與固定并降低作物對重金 屬離子鎘Cd +的吸收累加，本發(fā)明提供了一種含高抗鎘污染菌株的生物有機肥料。
[0004] 本發(fā)明的另一目的是提供含高抗鎘污染菌株的生物有機肥料的制備方法和應(yīng)用。
[0005] 實現(xiàn)本發(fā)明上述目的的具體技術(shù)方案為： 一種含高抗鎘污染菌株的生物有機肥料，按其重量份計由如下成分組成：核心菌劑 4-6份；離子拮抗劑1-3份；精制有機肥料91-95份。優(yōu)選地，其組成成分為：核心菌劑5份； 離子拮抗劑2份；精制有機肥料93份。
[0006] 其中，所述核心菌劑是將高抗鎘污染的沼澤紅假單胞菌-RP3在無菌條件下 依次進(jìn)行斜面培養(yǎng)、搖床培養(yǎng)、發(fā)酵罐培養(yǎng)后，將得到的發(fā)酵液經(jīng)過濃縮干燥得到孢子 粉，然后將孢子粉與酶活物質(zhì)和膨潤土按照1:1:8的重量比例混配而成，有效活菌數(shù) 40.(T60.0X 108Cfu/g。其中所述的微生物菌種是從鎘污染區(qū)的污泥中特別篩選出來的優(yōu) 勢菌株，即為沼澤紅假單胞菌-RP3 ;所述酶活物質(zhì)為蛋白粉和活性酶，其是按照蛋白粉：活 性酶為300:1~100:1的重量比例均勻混合制成，所述活性酶是從紅小豆青莢中提取的活性 酶。提取的方法為：首先將大豆上等好的青莢進(jìn)行植物組織細(xì)胞的破碎。采用磷酸緩沖液 (pH值6. 0)按照料液比1 :5混合于器皿中，得到的混合液進(jìn)行過濾（過濾2~3次），除掉固 體雜質(zhì)，得到酶的粗提取液。然后對得到的粗提取液58°C水浴加熱，10分鐘后取出器皿，靜 置5分鐘(切忌過長)，器皿底部沉淀出大豆青夾中含有固體雜質(zhì)蛋白質(zhì)，取上清液于另一器 皿中，用硫酸銨進(jìn)行沉淀（pH值5. 8)。最后用磷酸緩沖液（pH值5. 7)對沉淀溶解得到的酶 液進(jìn)行分離純化。
[0007] 所述核心菌劑中的沼澤紅假單胞菌-RP3是由如下方法分離培養(yǎng)制得： 菌株的分離和培養(yǎng)：用Van Nile富集培養(yǎng)基對采自南京郊外水塘的污泥進(jìn)行厭氧光 照培養(yǎng)，5~10 d后取微紅培養(yǎng)物接種于第2瓶富集培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)2~3次后用 Van Nile分離，用培養(yǎng)基進(jìn)行多次劃線分離，獲得多株光合細(xì)菌菌株，用富集培養(yǎng)基富集 培養(yǎng)，然后進(jìn)行菌株鑒定，并從中選育出具有高抗鎘污染的優(yōu)勢菌株，命名為沼澤紅假單胞 菌-RP3。該優(yōu)勢菌株功能強大，能迅速在土壤中定植生長并形成強大菌落，通過其生活繁衍 作用，改變重金屬鎘在土壤中的化學(xué)形態(tài)，使其固定或解毒，降低其在土壤環(huán)境中的移動 性和生物可利用性；該菌落還能直接吸附重金屬離子鎘Cd +到微生物細(xì)胞璧或細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行 代謝，達(dá)到對重金屬鎘的削減、凈化與固定。
[0008] 沼澤紅假單胞菌-RP3分離所用富集培養(yǎng)基成分為：NaH2P04 5. 5 mg/L，蘋果酸 1.5 mg/L，乙酸納 2 mg/L，NaOH 2 mg/L，NH4CI 1 mg/L，MgCl2 0.25 mg/L，CaCl2 0.05 mg/ L，酵母膏1 mg/L，微量元素1 ml，pH 7. 0 ;所用VanNiel紫色非硫細(xì)菌用分離培養(yǎng)基成分 為 NH4C1 1 g，丁二酸鈉 1 g，ΚΗ2Ρ04 0· 2 g，MgS04 · 7H20 0· 005 g，Na2C03 0· 2 g，酵母膏 〇. 1 g，復(fù)合無機鹽溶液1 mL，水1 000 mL，pH=7. 0。復(fù)合無機鹽溶液組成為：EDTA 0. 5 g，F(xiàn)eS04 · 7H20 0· 2 g，ZnS04 · 7H20 0· 01 g，硼酸 0· 03 g，MnCl2 · 4H20 0· 003 g，CaCl2 · 2H20 0.02 g，NiCl2.6H20 0.002 g，CuCl2.2H20 0.001 g，Na2Mo04.2H20 0.003 g，水 100 mL，HCl 調(diào) pH=3. 0。
[0009] 其中，所述離子拮抗劑是由硫酸鋅和鑰酸銨按9:1的重量比混合配制而成。99. 5% 硫酸鋅ZnS04 · 7H20是由廊坊鵬彩精細(xì)化工有限公司提供，鎘含量0. 00025% ;99. 8%鑰酸銨 (ΝΗ4)2Μ〇4013 ·2Η20中的鎘無檢出。由于Cd和Zn通常是伴隨而生的，具有相似的化學(xué)性質(zhì) 和地球化學(xué)行為，因而Zn具有拮抗Cd被植物吸收的特性，土壤中適宜的鎘鋅比，可以抑 制植物對Cd的吸收。因此，可以通過向Cd污染的土壤中加入適量Zn，調(diào)節(jié)鎘鋅比，減少 Cd在植物體內(nèi)富集。同樣，施用鑰酸銨也能夠減少鎘向植物體內(nèi)富集。
[0010] 其中，所述精制有機肥料為湖南新五豐股份公司養(yǎng)殖場豬糞經(jīng)生物發(fā)酵腐熟后， 科學(xué)加工而成，其有機質(zhì)含量> 45%，總養(yǎng)分> 5%。有機肥不僅可改善土壤理化性狀、提高 土壤肥力，而且影響重金屬在土壤中的形態(tài)及植物對它的吸收。向Cd污染的土壤中施入 有機肥，由于有機肥中大量官能團(tuán)的存在和具有較大的比表面積，可促進(jìn)土壤中重金屬離 子與其形成重金屬有機絡(luò)合物，增加土壤對重金屬的吸附能力，提高土壤對重金屬的緩沖 性，從而減少植物對其吸收，阻礙它進(jìn)入食物鏈。因此，在Cd污染土壤中施加有機肥是 一種十分有效的治理方法。
[0011] 本發(fā)明所述的含高抗鎘污染菌株的生物有機肥料的制備方法，其是將核心菌劑 4-6份，離子拮抗劑1-3份，精制有機肥料91-95份混合攪拌均勻制得。
[0012] 本發(fā)明所述的含高抗鎘污染菌株的生物有機肥料在農(nóng)作物生產(chǎn)中的應(yīng)用，在應(yīng)用 中，該含高抗鎘污染菌株的生物有機肥料為粉狀或顆粒狀劑型，在土地翻耕時拌細(xì)黃土或 摻入基肥中均勻撒施，平整土地，平均用量為750-1500kg/hm2。 本發(fā)明的有益效果在于： 1、本發(fā)明的微生物功能更強。該發(fā)明的核心菌劑中的微生物沼澤紅假單胞菌-RP3功 能強大，能迅速在土壤中定植生長并形成強大菌落，通過其生活繁衍作用，改變重金屬鎘 在土壤中的化學(xué)形態(tài)，使其固定、鈍化或解毒，降低其在土壤環(huán)境中的移動性和生物可利 用性；該菌落還能直接吸附重金屬離子鎘Cd +到微生物細(xì)胞璧或細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行代謝，達(dá)到對 重金屬鎘的削減、凈化與固定。
[0013] 2、本發(fā)明的含高抗鎘污染菌株的生物有機肥料技術(shù)處在國際領(lǐng)先前沿。優(yōu)勢作 用在于利用沼澤紅假單胞菌-RP3 (簡稱SRP3)直接吸附固化、鈍化以及代謝產(chǎn)生的S2-與 重金屬離子反應(yīng)生成難溶的硫化物沉淀而使重金屬離子鎘Cd+鈍化固化的雙重作用：高 價M+01)-低價M+H" ( Μ為重金屬離子，Η為原子氫)，SRP3菌一S042_+〇l) - S2_+H20， M2++S2_ -MS丨。因沼澤紅假單胞菌-RP3表面帶有一定的負(fù)電性，故對重金屬離子鎘Cd+有 較強的吸附性以及較強的生物禁絮凝作用，使重金屬硫化物得以很好地固化，難以移動，降 低了生物可利用性，減少了作物對重金屬離子鎘Cd+的吸收累加。
[0014] 3、本發(fā)明的核心菌劑制備方法先進(jìn)科學(xué)，實施操作性強，孢子數(shù)含量高，存活時間 長。加入酶活物質(zhì)能使孢子在土壤中迅速定植生長，大量繁殖。
[0015] 4、本發(fā)明特別添加了離子拮抗劑硫酸鋅和鑰酸銨，由于Cd和Zn通常是伴隨而生 的，具有相似的化學(xué)性質(zhì)和地球化學(xué)行為，因而Zn具有拮抗Cd被植物吸收的特性，土壤 中適宜的鎘鋅比，可以抑制植物對Cd的吸收。因此，可以通過向Cd污染的土壤中加入適 量Zn，調(diào)節(jié)鎘鋅比，減少Cd在植物體內(nèi)富集。同樣，施用鑰酸銨也能夠減少鎘向植物體 內(nèi)富集。
[0016] 5、向Cd污染的土壤中施入本發(fā)明的有機肥料，由于有機肥中大量官能團(tuán)的存在 和具有較大的比表面積，可促進(jìn)土壤中重金屬離子與其形成重金屬有機絡(luò)合物，增加土壤 對重金屬的吸附能力，提高土壤對重金屬的緩沖性，從而減少植物對其吸收，阻礙它進(jìn)入 食物鏈。因此，在Cd污染土壤中施加有機肥是一種十分有效的治理方法。
[0017] 本發(fā)明的【具體實施方式】 結(jié)合以下實施例，對本發(fā)明的【具體實施方式】作詳細(xì)描述，進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容。但 僅僅只是用于說明本發(fā)明，而不是用來限制本發(fā)明的范圍。
[0018] 實施例1含高抗鎘污染菌株的生物有機肥料的構(gòu)成 按其重量份計由如下成分組成：核心菌劑5份；離子拮抗劑2份；精制有機肥料93份。
[0019] 所述核心菌劑是將高抗鎘污染的沼澤紅假單胞菌-RP3在無菌條件下依次進(jìn)行斜 面培養(yǎng)、搖床培養(yǎng)、發(fā)酵罐培養(yǎng)后，將得到的發(fā)酵液經(jīng)過濃縮干燥得到孢子粉，然后將孢子 粉與酶活物質(zhì)和膨潤土按照1:1:8的重量比例混配而成，有效活菌數(shù)50.0X 108cfu/g。 其中所述的微生物菌種是從株洲市天元區(qū)大塘坡的鎘污染區(qū)稻田魚池的污泥中特別 篩選出來的優(yōu)勢菌株，命名為沼澤紅假單胞菌-RP3 ;所述酶活物質(zhì)為蛋白粉和活性酶，其 是按照蛋白粉：活性酶為300:1~100:1的重量比例均勻混合制成，所述活性酶是從紅小豆 青莢中提取的活性酶。提取的方法為：首先將大豆上等好的青莢進(jìn)行植物組織細(xì)胞的破碎。 采用磷酸緩沖液（pH值6.0)按照料液比1 :5混合于器皿中，得到的混合液進(jìn)行過濾（過濾 2~3次），除掉固體雜質(zhì)，得到酶的粗提取液。然后對得到的粗提取液58°C水浴加熱，10分 鐘后取出器皿，靜置5分鐘(切忌過長)，器皿底部沉淀出大豆青夾中含有固體雜質(zhì)蛋白質(zhì)， 取上清液于另一器皿中，用硫酸銨進(jìn)行沉淀（pH值5. 8)。最后用磷酸緩沖液（pH值5. 7)對 沉淀溶解得到的酶液進(jìn)行分離純化。
[0020] 所述核心菌劑中的沼澤紅假單胞菌-RP3是由如下方法分離培養(yǎng)制得： 菌株的分離和培養(yǎng)：用Van Nile富集培養(yǎng)基對采自湖南省株洲市郊區(qū)水稻田水溝的 污泥進(jìn)行厭氧光照培養(yǎng)，5~10 d后取微紅培養(yǎng)物接種于第2瓶富集培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，重 復(fù)2~3次后用Van Nile分離，用培養(yǎng)基進(jìn)行多次劃線分離，獲得多株光合細(xì)菌菌株，用富集 培養(yǎng)基富集培養(yǎng)，然后進(jìn)行菌株鑒定，并從中選育出具有高抗鎘污染的優(yōu)勢菌株，命名為沼 澤紅假單胞菌-RP3。
[0021] 沼澤紅假單胞菌-RP3分離所用富集培養(yǎng)基成分為：NaH2P04 5. 5 mg/L，蘋果酸 1.5 mg/L，乙酸納 2 mg/L，NaOH 2 mg/L，NH4CI 1 mg/L，MgCl2 0.25 mg/L，CaCl2 0.05 mg/ L，酵母膏1 mg/L，微量元素1 ml，pH 7. 0 ;所用VanNiel紫色非硫細(xì)菌用分離培養(yǎng)基成分 為 NH4C1 1 g，丁二酸鈉 1 g，ΚΗ2Ρ04 0· 2 g，MgS04 · 7H20 0· 005 g，Na2C03 0· 2 g，酵母膏 〇. 1 g，復(fù)合無機鹽溶液1 mL，水1 000 mL，pH=7. 0。復(fù)合無機鹽溶液組成為：EDTA 0. 5 g，F(xiàn)eS04 · 7H20 0· 2 g，ZnS04 · 7H20 0· 01 g，硼酸 0· 03 g，MnCl2 · 4H20 0· 003 g，CaCl2 · 2H20 0.02 g，NiCl2.6H20 0.002 g，CuCl2.2H20 0.001 g，Na2Mo04.2H20 0.003 g，水 100 mL，HCl 調(diào) pH=3. 0。
[0022] 所述沼澤紅假單胞菌_RP3孢子粉由以下步驟制得： ① 斜面培養(yǎng)：將沼澤紅假單胞菌-RP3菌種在無菌條件下接種于斜面培養(yǎng)基上，在 29±1°C條件下培養(yǎng)40h ; ② 搖床培養(yǎng)：將上述步驟①培養(yǎng)的菌種在無菌條件下接種于液體培養(yǎng)基，在PH6. 8、溫 度為30°C條件下，140r/min搖床培養(yǎng)36h ; ③ 發(fā)酵罐培養(yǎng)：將上述步驟②培養(yǎng)的菌種在無菌條件下接種于發(fā)酵罐培養(yǎng)基，在pH 7.2、罐壓0.51^、溫度為301：、通風(fēng)量1:0.8條件下，培養(yǎng)5011后，菌數(shù)大于1.0\10171^， 80%菌體轉(zhuǎn)成芽孢時下罐，得到發(fā)酵液； ④ 將步驟③中得到的發(fā)酵液經(jīng)過濃縮干燥制備成孢子粉，然后將孢子粉與酶活物質(zhì)和 膨潤土按照1:1:8的重量比例混配而成，有效活菌數(shù)40. (Γ60. 0 X 108cfu/g。
[0023] 在上述混合孢子粉的制備中，步驟①中選用的斜面培養(yǎng)基的配方如下：成分為 NaH2P04 5.5 mg/L，蘋果酸 1.5 mg/L，乙酸鈉 2 mg/L，NaOH 2 mg/L，NH4Cl 1 mg/L，MgCl2 0.25 mg/L ,CaCl2 0. 05 mg/L，酵母膏1 mg/L，微量元素1 ml (微量元素溶液為氯化亞鐵、氯化 鈷、氯化鎳、氯化銅、氯化錳、氯化鋅、鑰酸鈉、五水亞硒酸鈉復(fù)合溶液)，pH 7. 0。
[0024] 上述步驟②中的液體培養(yǎng)基配方如下：葡萄糖10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、淀粉 l〇g、豆餅粉 5g、Κ2ΗΡ040· 5g、MgS040. 2g、水 1000mL。
[0025] 上述步驟③中的發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方如下：玉米粉26kg、豆餅粉16kg、硫酸銨4kg、 葡萄糖8kg、酵母粉2. 5kg、蛋白胨1. 7kg、加水至600kg。
[0026] 所述離子拮抗劑是由硫酸鋅和鑰酸銨按9:1的重量比混合配制而成。99. 5%硫 酸鋅ZnS04 · 7H20是由廊坊鵬彩精細(xì)化工有限公司提供，鎘含量0. 00025% ;99. 8%鑰酸銨 (ΝΗ4)2Μ〇4013 · 2H20中的鎘無檢出。
[0027] 所述精制有機肥料為湖南新五豐股份公司養(yǎng)殖場豬糞經(jīng)生物發(fā)酵腐熟后，科學(xué)加 工而成，其有機質(zhì)含量> 45%，總養(yǎng)分彡5%。
[0028] 將上述材料按照核心菌劑5份、離子拮抗劑2份、精制有機肥料93份的重量比例 充分混勻，制備得到本發(fā)明的含高抗鎘污染菌株的生物有機肥料。
[0029] 實施例2含高抗鎘污染菌株的生物有機肥料的構(gòu)成 按重量份計由如下成分組成：核心菌劑5份；離子拮抗劑1份；精制有機肥料94份。
[0030] 所述核心菌劑是將實施例1中的高抗鎘污染的沼澤紅假單胞菌-RP3在無菌條 件下依次進(jìn)行斜面培養(yǎng)、搖床培養(yǎng)、發(fā)酵罐培養(yǎng)后，將得到的發(fā)酵液經(jīng)過濃縮干燥得到孢 子粉，然后將孢子粉與酶活物質(zhì)和膨潤土按照1:1:8的重量比例混配而成，有效活菌數(shù) 55. 0X 108cfu/g。 其中所述的酶活物質(zhì)為蛋白粉和活性酶，其是按照蛋白粉：活性酶為300:1~100:1的 重量比例均勻混合制成，所述活性酶是從紅小豆青莢中提取的活性酶，提取方法同實施例 1〇
[0031] 所述核心菌劑中的沼澤紅假單胞菌-RP3是由如下方法分離培養(yǎng)制得： 菌株的分離和培養(yǎng)：用Van Nile富集培養(yǎng)基對采自湖南省株洲市郊區(qū)水稻田水溝的 污泥進(jìn)行厭氧光照培養(yǎng)，5~10 d后取微紅培養(yǎng)物接種于第2瓶富集培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，重 復(fù)2~3次后用Van Nile分離，用培養(yǎng)基進(jìn)行多次劃線分離，獲得多株光合細(xì)菌菌株，用富集 培養(yǎng)基富集培養(yǎng)，然后進(jìn)行菌株鑒定，并從中選育出具有高抗鎘污染的優(yōu)勢菌株，命名為沼 澤紅假單胞菌-RP3。
[0032] 沼澤紅假單胞菌-RP3分離所用富集培養(yǎng)基成分以及VanNiel紫色非硫細(xì)菌用分 離培養(yǎng)基成分與實施例1相同。
[0033] 所述沼澤紅假單胞菌-RP3孢子粉由以下步驟制得： ① 斜面培養(yǎng)：將沼澤紅假單胞菌-RP3菌種在無菌條件下接種于斜面培養(yǎng)基上，在 29±1°C條件下培養(yǎng)40h ; ② 搖床培養(yǎng)：將上述步驟①培養(yǎng)的菌種在無菌條件下接種于液體培養(yǎng)基，在PH6. 8、溫 度為30°C條件下，140r/min搖床培養(yǎng)36h ; ③ 發(fā)酵罐培養(yǎng)：將上述步驟②培養(yǎng)的菌種在無菌條件下接種于發(fā)酵罐培養(yǎng)基，在pH 7.2、罐壓0.51^、溫度為301：、通風(fēng)量1:0.8條件下，培養(yǎng)5011后，菌數(shù)大于1.0\10171^， 80%菌體轉(zhuǎn)成芽孢時下罐，得到發(fā)酵液； ④ 將步驟③中得到的發(fā)酵液經(jīng)過濃縮干燥制備成孢子粉，然后將孢子粉與酶活物質(zhì)和 膨潤土按照1:1:8的重量比例混配而成，有效活菌數(shù)40. (Γ60. 0 X 108cfu/g。
[0034] 在上述混合孢子粉的制備中，步驟①中選用的斜面培養(yǎng)基的配方如下：成分為 NaH2P04 5.5 mg/L，蘋果酸 1.5 mg/L，乙酸鈉 2 mg/L，NaOH 2 mg/L，NH4Cl 1 mg/L，MgCl2 0.25 mg/L ,CaCl2 0. 05 mg/L，酵母膏1 mg/L，微量元素1 ml (微量元素溶液為氯化亞鐵、氯化 鈷、氯化鎳、氯化銅、氯化錳、氯化鋅、鑰酸鈉、五水亞硒酸鈉復(fù)合溶液)，pH 7. 0。
[0035] 上述步驟②中的液體培養(yǎng)基配方如下：葡萄糖10g、牛肉膏5g、酵母粉5g、淀粉 l〇g、豆餅粉 5g、Κ2ΗΡ040· 5g、MgS040. 2g、水 1000mL。
[0036] 上述步驟③中的發(fā)酵罐培養(yǎng)基配方如下：玉米粉26kg、豆餅粉16kg、硫酸銨4kg、 葡萄糖8kg、酵母粉2. 5kg、蛋白胨1. 7kg、加水至600kg。
[0037] 所述離子拮抗劑是由硫酸鋅和鑰酸銨按9:1的重量比混合配制而成。99.5%硫 酸鋅ZnS0 4 · 7H20是由廊坊鵬彩精細(xì)化工有限公司提供，鎘含量0. 00025% ;99. 8%鑰酸銨 (ΝΗ4)2Μ〇4013 · 2H20中的鎘無檢出。
[0038] 所述精制有機肥料為湖南新五豐股份公司養(yǎng)殖場豬糞經(jīng)生物發(fā)酵腐熟后，科學(xué)加 工而成，其有機質(zhì)含量> 45%，總養(yǎng)分彡5%。
[0039] 將上述材料按照核心菌劑5份、離子拮抗劑1份、精制有機肥料94份的重量比例 充分混勻，制備得到本發(fā)明的含高抗鎘污染菌株的生物有機肥料。
[0040] 實施例3含高抗鎘污染菌株的生物有機肥料的構(gòu)成 按重量份計由如下成分組成：核心菌劑6份；離子拮抗劑3份；精制有機肥料91份。
[0041] 所述核心菌劑是將實施例1中的高抗鎘污染的沼澤紅假單胞菌-RP3在無菌條 件下依次進(jìn)行斜面培養(yǎng)、搖床培養(yǎng)、發(fā)酵罐培養(yǎng)后，將得到的發(fā)酵液經(jīng)過濃縮干燥得到孢 子粉，然后將孢子粉與酶活物質(zhì)和膨潤土按照1:1:8的重量比例混配而成，有效活菌數(shù) 40. 0?60. 0X 108cfu/g。 其中所述的酶活物質(zhì)為蛋白粉和活性酶，其是按照蛋白粉：活性酶為300:1~100:1的 重量比例均勻混合制成，所述活性酶是從紅小豆青莢中提取的活性酶。提取的方法同實施 例1。
[0042] 所述核心菌劑中的沼澤紅假單胞菌-RP3是由如下方法分離培養(yǎng)制得： 菌株的分離和培養(yǎng)：用Van Nile富集培養(yǎng)基對采自湖南省株洲市郊區(qū)水稻田水溝的 污泥進(jìn)行厭氧光照培養(yǎng)，5~10 d后取微紅培養(yǎng)物接種于第2瓶富集培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，重 復(fù)2~3次后用Van Nile分離，用培養(yǎng)基進(jìn)行多次劃線分離，獲得多株光合細(xì)菌菌株，用富集 培養(yǎng)基富集培養(yǎng)，然后進(jìn)行菌株鑒定，并從中選育出具有高抗鎘污染的優(yōu)勢菌株，命名為沼 澤紅假單胞菌-RP3。
[0043] 沼澤紅假單胞菌-RP3分離所用富集培養(yǎng)基成分以及VanNiel紫色非硫細(xì)菌用分 離培養(yǎng)基成分與實施例1相同。
[0044] 所述沼澤紅假單胞菌-RP3孢子粉的制取步驟和方法與實施例1相同。
[0045] 所述離子拮抗劑是由硫酸鋅和鑰酸銨按9:1的重量比混合配制而成。99. 5%硫 酸鋅ZnS04 · 7H20是由廊坊鵬彩精細(xì)化工有限公司提供，鎘含量0. 00025% ;99. 8%鑰酸銨 (ΝΗ4)2Μ〇4013 · 2H20中的鎘無檢出。
[0046] 所述精制有機肥料為湖南新五豐股份公司養(yǎng)殖場豬糞經(jīng)生物發(fā)酵腐熟后，科學(xué)加 工而成，其有機質(zhì)含量> 45%，總養(yǎng)分彡5%。
[0047] 將上述材料按照核心菌劑6份、離子拮抗劑3份、精制有機肥料91份的重量比例 充分混勻，制備得到本發(fā)明的含高抗鎘污染菌株的生物有機肥料。
[0048] 實驗例1本發(fā)明實施例1的含高抗鎘污染菌株的生物有機肥料盆栽試驗 1材料及方法 1. 1采用盆栽試驗，研究本發(fā)明對不同稻田土高抗鎘污染的效果。試驗設(shè)置2個處理， 每個處理重復(fù)三次，隨機區(qū)組排列。
[0049] 處理①：施用本發(fā)明實施例1的含高抗鎘污染菌株的生物有機肥料12. 15g/盆 (折合田間用量為1500kg/hm2); 處理②對照CK :不施用本發(fā)明實施例1的含高抗鎘污染菌株的生物有機肥料。
[0050] 1. 2試驗使用27cm X 30cm的白色塑料盆缽，裝盆前土壤經(jīng)風(fēng)干5目過篩，每盆裝土 層厚約20cm(kg)，同時在每盆上施用一定的氮、磷、鉀肥料，試驗期間各處理栽培管理措施 與田間管理一致。
[0051] 1. 3裝盆土壤分別采自湖南省株洲市天元區(qū)大塘坡村的潮泥田和黃牙塘村的黃泥 田，實驗前的檢測結(jié)果見下表1。
[0052] 表1供試土壤實驗前的檢測結(jié)果

【權(quán)利要求】
1. 一種含高抗鎘污染菌株的生物有機肥料，其特征在于，所述含高抗鎘污染菌株的生 物有機肥料按重量份計由如下成分組成：核心菌劑4-6份；離子拮抗劑1-3份；精制有機肥 料91-95份。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的含高抗鎘污染菌株的生物有機肥料，其特征在于，所述核心 菌劑是由高抗鎘污染菌種與酶活物質(zhì)和膨潤土按1:1:8的重量比例中混配而成，有效活菌 數(shù)40. (Γ60. OX 108cfu/g，其中所述的微生物菌種是從鎘污染區(qū)的污泥中特別篩選出來的 優(yōu)勢菌株，即為沼澤紅假單胞菌-RP3 ;所述酶活物質(zhì)為蛋白粉和活性酶，其是按照蛋白粉： 活性酶為300:1~100的重量比例均勻混合制成，所述活性酶是從紅小豆青莢中提取的活性 酶。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的含高抗鎘污染菌株的生物有機肥料，其特征在于，所述 離子拮抗劑是由硫酸鋅和鑰酸銨按9:1的重量比混合配制而成。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的含高抗鎘污染菌株的生物有機肥料，其特征在于，所述精 制有機肥料為養(yǎng)殖場豬糞經(jīng)生物發(fā)酵腐熟后，科學(xué)加工而成，其有機質(zhì)含量> 45%，總養(yǎng)分 彡5%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的含高抗鎘污染菌株的生物有機肥料，其特征在于，所述核心 菌劑中的沼澤紅假單胞菌-RP3是由如下方法分離培養(yǎng)制得： 菌株的分離和培養(yǎng)：用Van Nile富集培養(yǎng)基對采自南京郊外水塘的污泥進(jìn)行厭氧光 照培養(yǎng)，5~10 d后取微紅培養(yǎng)物接種于第2瓶富集培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，重復(fù)2~3次后用Van Nile分離，用培養(yǎng)基進(jìn)行多次劃線分離，獲得多株光合細(xì)菌菌株，并從中選育出具有高抗鎘 污染的菌株，命名為沼澤紅假單胞菌-RP3 ;用富集培養(yǎng)基富集培養(yǎng)，然后進(jìn)行菌株鑒定；富 集培養(yǎng)基成分為 NaH2P04 5.5 mg/L，蘋果酸 L5 mg/L，乙酸鈉 2 mg/L，NaOH 2 mg/L，NH4CI 1 mg/L，MgCl2 0.25 mg/L，CaCl2 0.05 mg/L，酵母膏 1 mg/L，微量元素 1 ml，pH 7.0;VanNiel 紫色非硫細(xì)菌用分離培養(yǎng)基成分為NH4C1 1 g，丁二酸鈉1 g，KH2P04 0. 2 g，MgS04*7H20 0· 005 g，Na2C03 0· 2 g，酵母膏 0· 1 g，復(fù)合無機鹽溶液 1 mL，水 1 000 mL，ρΗ=7· 0。
6. 權(quán)利要求1-5任一項所述的含高抗鎘污染菌株的生物有機肥料的配制以及在農(nóng)作 物生產(chǎn)中的應(yīng)用。
【文檔編號】C09K101/00GK104140824SQ201410382031
【公開日】2014年11月12日 申請日期:2014年8月6日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月6日
【發(fā)明者】唐毓杰, 胡九洲, 孟三宏, 劉海濤, 楊麗 申請人:湖南原生生物科技股份有限公司