一株活性嗜熱菌突變株及其在驅(qū)油方面的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明的目的是提供一株嗜熱微生物突變菌株及其應(yīng)用，本發(fā)明所提供的XS2-450(Geobacillus?sp.)是通過對出發(fā)菌株Geobacillus?sp.XS2進(jìn)行常壓室溫等離子體誘變得到的，其保藏編號為CGMCC?No.9430。本發(fā)明采用室溫常壓等離子體誘變方法獲得Geobacillus?sp.XS2-450，可大幅提高乳化劑的乳化活性，對甲苯，二甲苯的乳化活性高達(dá)100％；乳化穩(wěn)定性好，靜置30d仍能保持70-100％的乳化活性；菌株連續(xù)傳代20次后乳化活性無明顯下降。本技術(shù)發(fā)明對突變株Geobacillus?sp.XS2-450進(jìn)行了工業(yè)化放大生產(chǎn)，并應(yīng)用于油田單井吞吐中試，使長慶油田劉55-4油井產(chǎn)油量提高12倍，采出液含水量降低70％以上,表現(xiàn)出了重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和規(guī)?；瘧?yīng)用的潛力。
【專利說明】一株活性嗜熱菌突變株及其在驅(qū)油方面的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于活性微生物菌株的篩選和應(yīng)用【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株嗜熱微生物突 變菌株及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 表面活性劑是一類兩親分子的總稱，這類分子同時(shí)含親水和親油基團(tuán)，在很低濃 度下就能顯著降低溶劑表面張力或液-液界面張力或增加乳化體系的穩(wěn)定性。表面活性劑 有多種活性，如乳化，表面吸附，溶解性，潤濕性，發(fā)泡，去污等，廣泛應(yīng)用在皮革，化妝品，建 筑，石油工業(yè)，環(huán)境工程等領(lǐng)域。
[0003] 由生物產(chǎn)生的表面活性劑稱為生物表面活性劑（Biosurfactants)。生物表面活性 劑與化學(xué)表面活性劑相比，具有用量少、選擇性好、無毒、無污染、可降解等優(yōu)點(diǎn)。在環(huán)境治 理，微生物驅(qū)油等領(lǐng)域具有較大的應(yīng)用潛質(zhì)。生物表面活性劑中分子量大，起乳化作用并具 有穩(wěn)定活性的稱為生物乳化劑，主要包括多聚糖，蛋白，脂多糖，脂蛋白或者這些生物高聚 物的復(fù)雜混合物。生物乳化劑可以形成水包油（0/W)或者油包水（W/0)的乳狀液，并使其 穩(wěn)定。在較低的濃度下呈現(xiàn)出較好的乳化作用，并表現(xiàn)出一定的底物專一性。
[0004] 目前代謝合成生物乳化劑的菌株在應(yīng)用方面存在如下問題：1)活性不穩(wěn)定，在實(shí) 際生產(chǎn)中活性下降嚴(yán)重；短時(shí)間內(nèi)作用活性高，長時(shí)間作用活性下降；2)環(huán)境適應(yīng)能力差， 生長溫度范圍窄，實(shí)際環(huán)境溫度變化大，使菌株無法快速生長和表現(xiàn)活性；3)生物乳化劑 乳化活性強(qiáng)，但不能顯著降低表面張力，導(dǎo)致單獨(dú)使用驅(qū)油活性見效慢。因此，篩選具有應(yīng) 用價(jià)值的產(chǎn)高活性、高穩(wěn)定性生物乳化劑菌株具有重要的生產(chǎn)價(jià)值，如能將其與顯著降低 表面張力的綠色生物表面活性劑復(fù)配應(yīng)用，則會(huì)具有事半功倍的效果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一株嗜熱微生物突變菌株及其應(yīng)用。即一種具有生長速度 快，遺傳穩(wěn)定性高，乳化劑活性穩(wěn)定、耐受力好的菌株，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。
[0006] 本發(fā)明所提供的XS2-450 (Geobacillus pall idus)是通過對出發(fā)菌株 Geobacillus sp.XS2進(jìn)行常壓室溫等離子體誘變（ARTP)得到的。已于2014年7月9日保 藏于位于北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號的中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物 中心，保藏編號為：CGMCC No. 9430。
[0007] 本發(fā)明還提供一種微生物復(fù)合驅(qū)油的方法，驅(qū)油劑主要由三部分組成：微生物發(fā) 酵液，發(fā)酵培養(yǎng)基和生物表面活性劑鼠李糖脂。
[0008] 其中所用微生物發(fā)酵液即為Geobacillus pall idus XS2-450發(fā)酵培養(yǎng)所得，活菌 數(shù)為5xl09cfu/ml左右；
[0009] 發(fā)酵培養(yǎng)基是以2 %葡萄糖為碳源，0.3 %硝酸鈉為氮源，包含磷酸根離子 0. 54%，硫酸根離子0. 055%，鉀離子0. 66%，鐵離子0. 005%，鎂離子0. 05%，鈣離子 0.005% ;鼠李糖脂復(fù)配后的質(zhì)量百分比分?jǐn)?shù)為1%。
[0010] 本發(fā)明采用室溫常壓等離子體誘變方法獲得Geobacillus pallidus XS2-450,可 大幅提高乳化劑的乳化活性，對甲苯，二甲苯的乳化活性高達(dá)100% ;乳化穩(wěn)定性好，靜置 30d仍能保持70-100%的乳化活性；菌株連續(xù)傳代20次后乳化活性無明顯下降。本技術(shù)發(fā) 明對突變株Geobacillus pallidus XS2-450進(jìn)行了工業(yè)化放大生產(chǎn)，并應(yīng)用于油田單井吞 吐中試，使長慶油田劉55-4油井產(chǎn)油量提高12倍，采出液含水量降低70%以上，表現(xiàn)出了 重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和規(guī)?；瘧?yīng)用的潛力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1 :突變株XS2-450進(jìn)行常壓低溫等離子體誘變篩選時(shí)的存活曲線。
[0012] 圖2 :發(fā)酵不同時(shí)間突變株XS2-450與原始菌株乳化活性的對比。
[0013] 圖3 :突變株XS2-450發(fā)酵24h的發(fā)酵液對不同烴類的乳化活性。
[0014] 圖4 :突變株XS2-450發(fā)酵24h的發(fā)酵液對四種烴類的乳化穩(wěn)定性。

【具體實(shí)施方式】
[0015] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明的菌株及復(fù)合驅(qū)油方法進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0016] 實(shí)施例1
[0017] 本實(shí)施例說明將原始菌株進(jìn)行等離子體誘變的方法。
[0018] 其中所使用的培養(yǎng)基配方（w/v):
[0019] 固體平板LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基：氯化鈉10%，胰蛋白胨10%，酵母提取物 5%，瓊脂 2%，pH 7. 5。
[0020] 液體LB培養(yǎng)基：氯化鈉10%，胰蛋白胨10%，酵母提取物5%，pH7. 5。以原始菌 株Geobacillus pallidusXS2進(jìn)行等離子體誘變的具體方法如下：
[0021] 1、制備原始菌株 Geobacillus pallidusXS2 菌懸液
[0022] 原始菌株Geobacillus pallidusXS2是本實(shí)驗(yàn)室從中國甘肅玉門油田鴨兒峽油藏 分離篩選到的一株嗜熱地芽孢桿菌；為地芽孢桿菌屬XS2菌株（Geobacillus pallidus)， 該菌株的保藏號為CGMCC No. 8338,于2013年10月15日保藏位于北京市朝陽區(qū)北辰西路 1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。 從固體LB平板上挑取原始菌株Geobacillus pallidusXS2的單克隆接種于液體LB中進(jìn)行 搖床活化培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度60°C，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，50ml三角瓶，裝液量為15-20ml，培養(yǎng)時(shí)間 8-12h，得到對數(shù)生長期、活力高的菌液，稀釋至細(xì)胞濃度0D_ = 1-1. 3,得到待誘變的菌懸 液。
[0023] 2、制備樣品載片
[0024] 取上一步驟制備得到的菌懸液10μ1，滴加在滅菌冷卻后的載片上，載片直徑 10_，然后將載片置于無菌超凈工作臺，自然風(fēng)干至無明顯液滴，全部操作在無菌條件下進(jìn) 行。
[0025] 3、等離子誘變操作
[0026] 利用等離子體誘變系統(tǒng)進(jìn)行操作。以氦氣為放電氣體，射頻功率100W，氣體流量 10SLM，選取處理時(shí)間0s，15s，30s，45s，60s，90s進(jìn)行等離子體誘變，每次處理一個(gè)載片。誘 變后，用生理鹽水將載體上的細(xì)胞洗脫下來，繪制存活曲線。
[0027] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如附圖1所示。為提高獲得高乳化活性和生長能力較強(qiáng)菌株的幾率，根 據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選取45s為后續(xù)篩選的誘變輻照時(shí)間，此時(shí)細(xì)胞的存活率為3. 08%。
[0028] 實(shí)施例2
[0029] 本實(shí)例說明產(chǎn)高活性生物乳化劑菌株的篩選方法。
[0030] 其中所使用的培養(yǎng)基配方（w/v):
[0031] 固體平板LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基：氯化鈉10%，胰蛋白胨10%，酵母提取物 5%，瓊脂 2%，pH 7. 5。
[0032] 液體LB培養(yǎng)基：氯化鈉10%，胰蛋白胨10%，酵母提取物5%，pH7. 5。
[0033] 發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2 %，硝酸鈉0. 3 %，磷酸二氫鉀0. 042 %，磷酸氫二鉀0. 12 %， 硫酸亞鐵0.005%，硫酸鎂0.05%，氯化鈣0.005%，維生素0.02 %。微量元素0.1%，pH 為 7. 5。
[0034] 微量元素：硼酸0. 025 %，硫酸銅0. 05 %，硫酸錳0. 05 %，鑰酸鈉0. 006 %，硫酸鋅 0· 07%。
[0035] 維生素：D-泛酸鈣0· 004 %，肌醇0· 002 %，煙酸0· 004%，維生素6. 004%，對氨基 苯甲酸0· 002%，維生素 B120. 05%。
[0036] 篩選步驟如下：
[0037] 1、固體平板培養(yǎng)基初篩
[0038] 將誘變后的載片置于裝有l(wèi)_2ml生理鹽水的具塞試管中，劇烈震蕩，將載片上的 細(xì)胞洗脫下來，梯度稀釋至不同濃度涂布于固體LB培養(yǎng)基平板上，60°C倒置培養(yǎng)16h，挑取 單克隆。
[0039] 2、液體試管培養(yǎng)基復(fù)篩
[0040] 將篩選的菌株接種于裝有液體LB培養(yǎng)基的試管（15X 150_)中，裝液量為2ml， 60°C搖床震蕩培養(yǎng)12h后，以10%的接種量轉(zhuǎn)接到液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，繼續(xù)震蕩培養(yǎng)至 24h。用等體積發(fā)酵液同液體石蠟漩渦振蕩混合測試發(fā)酵液的乳化活性，篩選乳化活性最好 的菌株。最終篩選的XS2-450的乳化活性較原始菌株提高25%，達(dá)到75. 05%。
[0041] 3、小型發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)驗(yàn)證突變株活性穩(wěn)定性
[0042] 將突變株XS2-450和原始菌株XS2以相同培養(yǎng)條件分別接入種子培養(yǎng)基中擴(kuò)大 培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度60°C，500ml，培養(yǎng)時(shí)間12h。轉(zhuǎn)接至7L發(fā)酵罐中培養(yǎng)，裝液量4L，發(fā)酵時(shí)間 24h，檢測發(fā)酵過程中乳化活性結(jié)果如圖2所示?？梢钥闯雠c原始菌株相比，突變株分泌乳 化劑的時(shí)間更長，達(dá)到20h，活性也更高，達(dá)到70%。
[0043] 實(shí)施例3
[0044] 本實(shí)施例測定突變株XS2-450對各種不同烴類的乳化活性。
[0045] 本發(fā)明所提供的乳化活性測定方法是將突變株發(fā)酵原液與七種不同的烴類（甲 苯，二甲苯，正十六烷，液體石蠟，大豆油，柴油，橄欖油）以一定比例混合，渦旋震蕩2min， 靜置24h，乳化活性=乳化層高度/液面總高度*100%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)過體系優(yōu)化后突 變株XS2-450對以上七種烴類均有較高的乳化活性。其中甲苯最高達(dá)到100%，比原始菌株 活性提高了 29.6%。
[0046] 實(shí)施例4
[0047] 本實(shí)施例檢測突變株XS2-450的乳化穩(wěn)定性和遺傳穩(wěn)定性
[0048] XS2-450的乳化穩(wěn)定性：
[0049] 1從固體LB平板上挑取單個(gè)克隆，接種于LB液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，60°C，200rpm 震蕩培養(yǎng)16h制備種子液。
[0050] 2以10% (v/v)的接種量，將種子液接種于無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，60°C，200rpm，震蕩培 養(yǎng) 24h。
[0051] 3將發(fā)酵原液分別與甲苯，二甲苯，正十六燒，液體石蠟以不同比例混合，渦旋震蕩 2min，分別靜置24h，15d，30d，檢測并記錄乳化活性變化過程。
[0052] 結(jié)果如圖3所示，突變株XS2-450的發(fā)酵原液對甲苯的乳化穩(wěn)定性在24h后可保 持100%，30d后仍保持92±0. 7% ;對二甲苯的乳化穩(wěn)定性在24h后可保持99. 5±0. 5%， 30d后仍保持85±0. 4% ;對正十六烷的乳化穩(wěn)定性24h后保持78±0. 5%，30d后仍保持 62. 5±0. 4%;對液體石蠟的乳化穩(wěn)定性24h后75±0. 5%，30d后仍保持69±0. 3%。說明 菌株XS2-450發(fā)酵后分泌的生物乳化劑具有很強(qiáng)的乳化活性和乳化穩(wěn)定性。
[0053] XS2-450的遺傳穩(wěn)定性：
[0054] 1從固體LB平板上挑取突變株XS2-450單個(gè)克隆，接種于LB液體培養(yǎng)基中，60°C， 200rpm震蕩培養(yǎng)12h作為第一代種子液。
[0055] 2以10% (v/v)的接種量，將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，60°C，200rpm，震蕩培養(yǎng) 24h，作為第一代的發(fā)酵液，按照上述方法測定乳化活性。
[0056] 3以10% (v/v)的接種量，再次接種至LB液體培養(yǎng)基中，60°C，200rpm震蕩培養(yǎng) 12h，作為第二代的種子液。
[0057] 4以10% (v/v)的接種量，將第二代種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基試管中，60°C， 200rpm，震蕩培養(yǎng)24h。作為第二代的發(fā)酵液測定乳化活性。
[0058] 如此再繼續(xù)傳代至20代，檢測每一代的乳化活性，發(fā)酵液對液體石蠟的乳化活性 可以穩(wěn)定維持在在65%?75%之間，說明突變株遺傳穩(wěn)定。
[0059] 實(shí)施例5
[0060] 本實(shí)施例說明突變株XS2-450在微生物復(fù)合驅(qū)油中的應(yīng)用。
[0061] 1突變株XS2-450大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)。
[0062] 其中所使用的培養(yǎng)基配方（w/v):
[0063] 液體LB培養(yǎng)基：氯化鈉10%，胰蛋白胨10%，酵母提取物5%，pH 7. 5。
[0064] 發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2 %，硝酸鈉0. 3 %，磷酸二氫鉀0. 042 %，磷酸氫二鉀0. 12 %， 硫酸亞鐵〇· 005 %，硫酸鎂0· 05 %，氯化鈣0· 005 %，pH為L 5。
[0065] 發(fā)酵過程中補(bǔ)料：葡萄糖40%，硝酸鈉12%。
[0066] 實(shí)驗(yàn)過程：將活化后的種子液接種于500ml三角瓶中，裝液量200ml，共兩瓶，培養(yǎng) 12h后，轉(zhuǎn)接至7L發(fā)酵罐中，裝液量4L。培養(yǎng)18h后，轉(zhuǎn)接至30L發(fā)酵罐中，裝液量為24L， 培養(yǎng)20h后，轉(zhuǎn)接至200L發(fā)酵罐中，裝液量為120L，培養(yǎng)20h后，轉(zhuǎn)接至2000L發(fā)酵罐中，裝 液量為1600L，培養(yǎng)從8h開始，每隔8h補(bǔ)料一次，40h后，收集發(fā)酵液。
[0067] 2生物乳化劑同鼠李糖脂復(fù)配提高乳化效率和乳化穩(wěn)定性
[0068] 為了達(dá)到適應(yīng)性強(qiáng)，見效快，有效期長的驅(qū)油效果，將突變株XS2-450發(fā)酵液與生 物表面活性劑鼠李糖脂復(fù)配。分別測定不同比例的發(fā)酵液與鼠李糖脂混合液對液體石蠟乳 化活性及穩(wěn)定性。最終確定突變株XS2-450發(fā)酵液與鼠李糖脂溶液（濃度為0. lg/Ι)以 70 :4的比例混合得到對液體石蠟的最高乳化活性為87%。為了進(jìn)一步驗(yàn)證復(fù)配后的混合 液對長慶油田原油的乳化活性，在60°C，180rpm，原油添加量為5% (w/v)的條件下，分別添 加10 %復(fù)配混合液，10 %突變株XS2-450發(fā)酵液，10 %鼠李糖脂溶液（0. lg/Ι)，搖床震蕩 5min，對比復(fù)配混合液、突變株XS2-450發(fā)酵液、鼠李糖脂溶液（0. lg/Ι)三者對原油作用效 果?？梢悦黠@看到復(fù)配后的混合液能夠快速將原油分散和乳化，同時(shí)能夠維持乳化狀態(tài)達(dá) 到15d以上，而單獨(dú)添加突變株XS2-450發(fā)酵液或者鼠李糖脂溶液（0. lg/Ι)乳化效果均沒 有復(fù)配混合液好。說明復(fù)配混合液既能夠使體系的表面/界面張力降低，又能夠有效維持 乳化穩(wěn)定的狀態(tài)，綜合發(fā)揮了生物乳化劑和鼠李糖脂的兩者優(yōu)勢。
[0069] 3微生物復(fù)合驅(qū)油的單井吞吐中試
[0070] 將復(fù)配混合液與營養(yǎng)液混勻注入到長慶油田劉55-4井中，封井三個(gè)月后開井采 油，同時(shí)對原油產(chǎn)量、采出液含水量等數(shù)據(jù)進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測。試驗(yàn)前該井生產(chǎn)狀況如下：劉 55-4于2010年5月投產(chǎn)，2011年11月含水上升，平均日產(chǎn)量0. 23m3,折合原油0.03T，含 水量為85. 7 %。經(jīng)過微生物復(fù)合驅(qū)油劑之后的生產(chǎn)狀況：平均日產(chǎn)量0. 65M3,折合原油 0. 36T，含水量為25%。經(jīng)過微生物復(fù)合驅(qū)油劉55-4的原油產(chǎn)量提升12倍，含水量降低 70%。由此可見本發(fā)明具有重大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。
【權(quán)利要求】
1. 一株嗜熱地芽孢桿菌，其特征在于，所述的地芽孢桿菌的保藏編號為CGMCC No.9430。
2. 如權(quán)利要求1所述的嗜熱地芽孢桿菌，其特征在于，所述的地芽孢桿菌是通過對出 發(fā)菌株Geobaci 1 lus sp. XS2進(jìn)行常壓室溫等離子體誘變獲得的。
3. 權(quán)利要求1所述的嗜熱地芽孢桿菌在石油開采中的應(yīng)用。
4. 一種微生物復(fù)合驅(qū)油劑，其特征在于，所述的驅(qū)油劑包含有微生物發(fā)酵液，發(fā)酵培養(yǎng) 基和鼠李糖脂；其中所述的微生物發(fā)酵液即是權(quán)利要求1所述的嗜熱地芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng) 獲得的。
5. 如權(quán)利要求4所述的微生物復(fù)合驅(qū)油劑，其特征在于所述的微生物發(fā)酵液中活菌數(shù) 為 5xl09cfu/ml〇
6. 如權(quán)利要求4所述的微生物復(fù)合驅(qū)油劑，其特征在于所述的發(fā)酵培養(yǎng)基包含有2% 葡萄糖、0. 3 %硝酸鈉、磷酸根離子0. 54%、硫酸根離子0. 055 %、鉀離子0. 66 %、鐵離子 0. 005%、鎂離子 0. 05%、鈣離子 0. 005%。
7. 如權(quán)利要求4所述的微生物復(fù)合驅(qū)油劑，其特征在于所述的鼠李糖脂的質(zhì)量百分比 分?jǐn)?shù)為1%。
8. 權(quán)利要求4所述的微生物復(fù)合驅(qū)油劑在開采石油中的應(yīng)用。
【文檔編號】C09K8/582GK104152388SQ201410419831
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月23日
【發(fā)明者】黃志勇, 董大媛, 王興彪, 蔡明昱 申請人:中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所