專利名稱：番茄pg基因啟動子反向重復(fù)序列及其載體和工程菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及的是一種番茄多聚半乳糖醛酸酶(PG)基因啟動子反向重復(fù)序列、構(gòu)建含有該序列克隆與表達(dá)載體過程中的PCR特異引物與中間載體、含有該序列的克隆與表達(dá)載體轉(zhuǎn)化菌株。
背景技術(shù)：
多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，PG)是在果實(shí)成熟過程中特異表達(dá)的細(xì)胞壁水解酶，其主要功能是將果實(shí)細(xì)胞壁中多聚半乳糖醛酸降解為半乳糖和醛酸，使細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)解體，導(dǎo)致果實(shí)的軟化。RNA干擾(RNA interference，RNAi)是近幾年發(fā)現(xiàn)的真核生物功能基因表達(dá)抑制的特殊機(jī)制，并成為一項(xiàng)極具潛力的真核生物基因功能研究和應(yīng)用的新技術(shù)。在植物中RNA干擾可發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平，即通過被抑制基因的啟動子序列的雙鏈RNA(dsRNA)來實(shí)現(xiàn)。因?yàn)榉聪蛑貜?fù)序列可使DNA形成復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)，因此，構(gòu)建含有反向重復(fù)序列的克隆和表達(dá)載體成為植物RNA干擾研究與應(yīng)用中的關(guān)鍵技術(shù)。目前還沒有針對PG基因啟動子構(gòu)建的反向重復(fù)序列克隆和表達(dá)載體。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明提供一種番茄PG基因啟動子反向重復(fù)序列及其載體和工程菌株。
本發(fā)明的目的之一是提供長度為1736bp、互補(bǔ)區(qū)為310bp的一種番茄PG基因啟動子反向重復(fù)序列。
本發(fā)明的目的之二是提供用于獲得上述序列過程中所設(shè)計的擴(kuò)增番茄PG基因啟動子1.4kb和310bp序列的兩對引物及含有擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆載體。
本發(fā)明的目的之三是提供含有該反向重復(fù)序列的克隆載體pPGPIR及轉(zhuǎn)化的E.coli的DH5α工程菌株。
本發(fā)明的目的之四是提供含有該反向重復(fù)序列的克隆載體pSKPGPIR及轉(zhuǎn)化的E.coli的DH5α工程菌株。
本發(fā)明之三和四提供的工程菌株帶有φ80lacZΔM15基因和Ampr基因，可以與pUC載體編碼的β-半乳糖苷酶氨基端實(shí)現(xiàn)α互補(bǔ)并具有抗氨芐青霉素抗性的能力。
本發(fā)明的目的之五是提供克隆該反向重復(fù)序列所用的植物表達(dá)載體pPGN及轉(zhuǎn)化的土壤農(nóng)桿菌LBA4404工程菌株。
本發(fā)明的目的之六是提供含有該反向重復(fù)序列的植物表達(dá)載體pNPGIR及E.coli的JM109工程菌株和土壤農(nóng)桿菌LBA4404工程菌株。
本發(fā)明之五和之六的大腸桿菌JM109工程菌株具有抗卡那霉素的能力。
本發(fā)明之五和之六的土壤農(nóng)桿菌LBA4404工程菌株為章魚堿類型農(nóng)桿菌，攜帶一個由Ti質(zhì)粒pTiAch5上去掉T-DNA毒性區(qū)的卸甲質(zhì)粒pAL4404，該質(zhì)粒提供vir區(qū)的輔助功能，具有抗鏈霉素、壯觀霉素和壯觀霉素的能力。
PG是一個受發(fā)育調(diào)控的具有組織特異性的酶，其活性在果實(shí)成熟的早期出現(xiàn)，并隨果實(shí)成熟而顯著增加。PG基因5′上游231bp是最小的具有啟動活性的區(qū)段，而5′上游1.4kb序列包括了PG基因轉(zhuǎn)錄的正、負(fù)調(diào)控區(qū)。本項(xiàng)發(fā)明涉及的1736bp番茄PG基因啟動子反向重復(fù)序列中的310bp互補(bǔ)區(qū)包含了上述231bp的最小啟動子。
首先設(shè)計和合成兩對特異引物，以番茄幼嫩子葉提取的核基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增PG基因啟動子1.4kb和310bp序列，以BamHI和KpnI酶切1.4kb序列PCR產(chǎn)物并克隆到pUC18載體上，將測定的序列在GenBank中進(jìn)行同源性比對，與登陸的番茄PG基因啟動子相應(yīng)的部位同源性超過99％，從而確定克隆的是目的序列，構(gòu)建成了pPGP克隆載體。擴(kuò)增的PG基因啟動子310bp序列以BamHI和PstI酶切并克隆到pUC18載體上，將測定的序列在GenBank中進(jìn)行同源性比對，與登陸的番茄PG基因啟動子相應(yīng)的部位同源性為100％，確定克隆的是目的序列，構(gòu)建成了pPGPmr克隆載體。
從pPGPmr克隆載體上以BamHI和PstI酶切下310bp序列并反向連接到pPGP克隆載體上，序列測定后確認(rèn)構(gòu)建成了含有1736bp反向重復(fù)序列的克隆載體pPGPIR。
以KpnI和PstI雙酶從克隆載體pPGPIR上切下該反向重復(fù)序列，克隆到pSK載體上，構(gòu)建成含有1736bp反向重復(fù)序列的克隆載體pSKPGPIR。
向E.coli的DH5α菌株中轉(zhuǎn)化含有番茄PG基因啟動子1.4kb序列的克隆載體pPGP、含有番茄PG基因啟動子1736bp反向重復(fù)序列的克隆載體pPGPIR和pSKPGPI所用的是分子克隆常規(guī)的預(yù)冷0.1mol/L CaCI2結(jié)合熱休克的方法。
用SmaI酶切植物表達(dá)載體pPGA，將11kb大片段回收并連接形成含有XhoI，NcoI，SstI，KpnI，SmaI，XbaI，BamHI切點(diǎn)的植物表達(dá)載體pPGN。以KpnI和BamHI雙酶從克隆載體pSKPGPIR上切下1736bp反向重復(fù)序列并克隆到pPGN載體上，形成植物表達(dá)載體pNPGIR。植物表達(dá)載體pPGN和pNPGIR向E.coli的JM109菌株和土壤農(nóng)桿菌LBA 4404菌株中的轉(zhuǎn)化采用電轉(zhuǎn)化方法，使用的是Micro pulser電轉(zhuǎn)化儀(Bio-Rad)。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)及效果本發(fā)明可廣泛用于植物PG基因表達(dá)抑制的相關(guān)理論及延緩果實(shí)衰老等應(yīng)用研究。


圖1為pPGP重組質(zhì)粒(克隆載體)PCR鑒定電泳圖。其中泳道1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，泳道2為陽性PCR對照；泳道34為重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物。
圖2為pPGPmr重組質(zhì)粒(克隆載體)PCR鑒定電泳圖。其中泳道1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，泳道2為陽性PCR對照；泳道3-9為重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物。
圖3為pPGP重組質(zhì)粒(克隆載體)BamHI-KpnI雙酶切鑒定電泳圖。其中泳道1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL15000，泳道8為重組質(zhì)粒BamHI-KpnI雙酶切，泳道9為非酶切重組質(zhì)粒。
圖4為pPGPmr重組質(zhì)粒(克隆載體)PstI-BamHI雙酶切鑒定電泳圖。其中泳道1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，泳道2為PstI-BamHI雙酶切pUC18對照，泳道3和5為PstI-BamHI雙酶切的重組質(zhì)粒，泳道4和6為非酶切重組質(zhì)粒。
圖5為pPGPIR重組質(zhì)粒(克隆載體)酶切鑒定電泳圖。其中泳道1為BamHI-PstI雙酶切pPGPIR質(zhì)粒，泳道2為KpnI-PstI雙酶切pPGPIR質(zhì)粒，泳道3為KpnI-BamHI雙酶切pPGP質(zhì)粒對照，泳道4為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DNA ladder，泳道5為BamHI-PstI雙酶切pPGP質(zhì)粒對照，泳道6為BamHI單酶切pPGPIR質(zhì)粒，泳道7為KpnI單酶切pPGPIR質(zhì)粒，泳道8為非酶切pPGPIR質(zhì)粒，泳道9為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000。
圖6為pSKPGPIR重組質(zhì)粒(克隆載體)酶切鑒定電泳圖。其中泳道1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL15000+2000，泳道2為KpnI-PstI雙酶切載體pSK，泳道3為KpnI-PstI雙酶切pSKPGPIR重組質(zhì)粒，泳道4為KpnI單酶切pSKPGPIR重組質(zhì)粒，泳道5為非酶切pSKPGPIR重組質(zhì)粒。
圖7為pNPGIR重組子質(zhì)粒(植物表達(dá)載體)酶切鑒定電泳圖。其中泳道1為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL15000+DL2000，泳道2為KpnI-XbaI雙酶切植物表達(dá)載體pPGN，泳道3為XbaI-KpnI雙酶切pNPGIR重組質(zhì)粒，泳道4為XbaI單酶切pNPGIR重組質(zhì)粒，泳道5為KpnI-XbaI雙酶切pNPGIR重組質(zhì)粒，泳道6為KpnI單酶切pNPGIR重組質(zhì)粒，泳道7為非酶切pNPGIR重組質(zhì)粒，泳道8為非酶切植物表達(dá)載體PGN。
圖8為植物表達(dá)載體pPGN構(gòu)建流程圖。
圖9為植物表達(dá)載體pNPGIR的構(gòu)建流程圖。
具體實(shí)施方式實(shí)施例1重組質(zhì)粒pPGP和pPGPmr的獲得根據(jù)GenBank已發(fā)表的番茄PG基因(GenBank accession numberX14074)啟動子的DNA序列信息和RNAi研究中選擇用于構(gòu)建hpRNA序列的基本經(jīng)驗(yàn)，設(shè)計如下PCR特異引物。
Primer(PG)15′CGCGGATCCGCGGCTTCTTAAAAAGGCAAATTG 3′Primer(PG)25′CGGGGTACCCCGATGATAAGAGGTATGGGAAG 3′Primer(PG)35′CGCGGATCCGCGCCATTTAACTTTGATTGTAATTA 3′Primer(PG)45′AAAACTGCAGCCATGATAAGAGGTATGGGAAG 3′以番茄幼嫩子葉核基因組DNA為模板，以Primer(PG)1和Primer(PG)2作為擴(kuò)增番茄PG基因啟動子1.4kb序列的上下游引物；以Primer(PG)3和Primer(PG)4作為擴(kuò)增番茄PG基因啟動子310bp序列的上下游引物。50μl PCR反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min，以94℃變性1min、56℃退火1min、72℃延伸2min的條件循環(huán)32個反應(yīng)，最后72℃延伸8min。
擴(kuò)增分別得到了含有PG基因啟動子區(qū)域1415bp序列和310bp序列的1439bp和334bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。將用BamHI和KpnI酶切的1439bp PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到經(jīng)相同酶切的pUC18載體上，經(jīng)圖1、圖3鑒定重組質(zhì)粒和序列測定，確定克隆的為目標(biāo)序列的pPGP重組質(zhì)粒。
將用BamHI和PstI酶切的334bp的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到經(jīng)相同酶切的pUC18載體上，經(jīng)圖2、圖4鑒定重組質(zhì)粒和序列測定，確定克隆的為目標(biāo)序列的pPGPmr重組質(zhì)粒。
實(shí)施例2克隆載體pPGPIR的構(gòu)建分別提取上述重組質(zhì)粒pPGP和pPGPmr，并分別用BamHI和PstI酶切。將pPGPmr酶切產(chǎn)物電泳，回收約310bp泳帶并與pPGP酶切產(chǎn)物連接，連接產(chǎn)物用常規(guī)的預(yù)冷0.1mol/L CaCI2和熱休克結(jié)合處理的方法轉(zhuǎn)化E.coli的DH5α菌株。重組質(zhì)粒經(jīng)圖5所示KpnI、BamHI單酶切和BamHI-PstI、KpnI-PstI雙酶切鑒定，并與同樣經(jīng)過這些酶切的重組質(zhì)粒pPGP對比，確定所克隆的為含有PG基因啟動子區(qū)域1415bp序列和反向310bp序列的克隆載體pPGPIR。
實(shí)施例3克隆載體pSKPGPIR的構(gòu)建分別提取克隆載體pSK和重組質(zhì)粒pPGPIR，并分別用KpnI-PstI雙酶切。將pPGPIR酶切產(chǎn)物電泳，回收約1.7kb泳帶并與酶切的pSK產(chǎn)物連接，連接產(chǎn)物用常規(guī)的預(yù)冷0.1mol/L CaCI2和熱休克結(jié)合處理的方法轉(zhuǎn)化E.coli的DH5α菌株。重組質(zhì)粒經(jīng)圖6所示KpnI單酶切和KpnI-PstI雙酶切鑒定，并與同樣經(jīng)過這些酶切的重組質(zhì)粒pSK對比，以及序列測定(詳見序列表)確定所克隆的為含有1736bp PG基因啟動子反向重復(fù)序列的克隆載體pSKPGPIR。在距離該反向重復(fù)序列一端313bp和另一端1417bp之間為標(biāo)志性BamHI酶切點(diǎn)，從反向重復(fù)序列的兩個端部分別向序列中延伸310bp為互補(bǔ)序列。
實(shí)施例4植物表達(dá)載體pPGN和pNPGIR的構(gòu)建提取植物表達(dá)載體pPGA并用SmaI酶切，電泳后回收11kb大片段并進(jìn)行自連(見圖8所示)，連接物用Bio-Rad生產(chǎn)的電轉(zhuǎn)化儀Micro pulser電轉(zhuǎn)化到E.coli JM109中，獲得含有XhoI，NcoI，SstI，KpnI，SmaI，XbaI，BamHI切點(diǎn)的能在E.coli和土壤農(nóng)桿菌中復(fù)制的植物表達(dá)載體pPGN。分別提取克隆載體pSKPGPIR和植物表達(dá)載體pPGN并用KpnI和BamHI雙酶切，電泳回收酶切的pSKPGPIR約1.7kb泳帶，如圖9所示將該1.7kb酶切序列與經(jīng)同樣酶切的植物表達(dá)載體pPGN連接，連接物用上述電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)化到E.coli JM109菌株中，重組質(zhì)粒經(jīng)圖7所示XbaI單酶切、KpnI-XbaI雙酶切、XbaI-KpnI雙酶切及與相應(yīng)酶切的pPGN進(jìn)行對比，確定為含有1736bpPG基因啟動子反向重復(fù)序列的植物表達(dá)載體pNPGIR。
用類似的電轉(zhuǎn)化方法將植物表達(dá)載體pNPGIR轉(zhuǎn)化到土壤農(nóng)桿菌LBA4404菌株中。
經(jīng)轉(zhuǎn)化獲得含有植物表達(dá)載體pPGN和pNPGIR的工程菌株E.coli JM109具有抗卡那霉素的能力；含有植物表達(dá)載體pPGN和pNPGIR的工程菌株的土壤農(nóng)桿菌LBA4404菌株具有抗鏈霉素、壯觀霉素和壯觀霉素的能力。
序列表<110>南開大學(xué)，天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心<120>番茄PG基因啟動子反向重復(fù)序列及其載體和工程菌株<160>1<210>1<211>1736<212>DNA<213>番茄(Lycopersicon Esculentum)<400>
atgataagag gtatgggaag ggtttgtcta tttatagatt ttaaggggtt tgagttggtc 60aatatggtta attgtaatgg gtattatatt agtttggatg agagatattt agacgaaaga 120gtttcttgga catttttgtc tggcttgtct tctcccgtct caattttttt gtcgtatttc 180ttttatatga tgtttaaaaa tatttatttt gaataattaa aaaaatatta tgttacaatt 240ctttgttaaa tattaatttt atttatatgt tggtaatttt taaaaattaa ttacaatcaa 300agttaaatgg cgcggatccg cgcttcttaa aaaggcaaat tgattaattt gaagtcaaaa 360taattaatta taacaatggt aaagcacctt aagaaaccat agtttgaaag gttaccaatg 420cgctatatat taatcaactt gataatataa aaaaaatttc aattcgaaaa gggcctaaaa 480tattctcaaa gtattcgaaa tggtacaaaa ctaccatccg tccacctatt gactccaaaa 540taaaattatt atccaccttt gagtttaaaa ttgactactt atataacaat tctaaattta 600aactatttta atacttttaa aaatacatgg cgttcaaata tttaatataa tttaatttat 660gaatatcatt tataaaccaa ccaactacca actcattaat cattaaatcc cacccaaatt 720ctactatcaa aat tgtccta aacactactaaaacaagacg aaattgttcg agtccgaatc 780gaagcaccaa tctaatttag gttgagccgc atatttagga ggacactttc aatagtattt 840ttttcaagca tgaatttgaa atttaagatt aatggtaaag aagtagtaca tcccgaatta 900
attcatgcct tttttaaata taattatata aatatttatg atttgtttta aatattaaaa 960cttgaatata ttatttttaa aaaaattatc tattaagtac catcacataa ttgagacgaa 1020ggaataatta agatgaacat agtgtttaat tagtaatgga tgggtagtaa atttatttat 1080aaattatatc aataagttaa attataacaa atatttgagc gccatgtatt ttaaaaaata 1140ttaaatagtt tgaatttaaa accgttagat aaatggtcaa ttttgaaccc aaaagtggat 1200gagaagggta ttttagagcc aataggggga tgagaaggat attttgaagc caatatgtga 1260tggatggagg ataattttgt atcatttcta atactttaaa gatattttag gtcattttcc 1320cttctttagt ttatagacta tagtgttagt tcatcgaata tcatctatta tttccgtctt 1380aaattatttt ttattttata aatttttaaa aaataaatta ttctttccat ttaactttga 1440ttgtaattaa tttttaaaaa ttaccaacat ataaataaaa ttaatattta acaaagaatt 1500gtaacataat atttttttaa ttattcaaaa taaatatttt taaacatcat ataaaagaaa 1560tacgacaaaa aaattgagac gggagaagac aagccagaca aaaatgtcca agaaactctt 1620tcgtctaaat atctctcatc caaactaata taatacccat tacaattaac catattgacc 1680aactcaaacc ccttaaaatc tataaataga caaacccttc ccatacctct tatcat 173權(quán)利要求
1.一種長度為1736bp、互補(bǔ)區(qū)為310bp的番茄PG基因啟動子反向重復(fù)序列，其具體序列如序列表所示。
2.用于獲得權(quán)利要求1序列過程中所設(shè)計的擴(kuò)增番茄PG基因啟動子1.4kb和310bp序列的兩對引物及含有擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆載體，即pPGP克隆載體和pPGPmr克隆載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的克隆載體，其特征在于以番茄幼嫩子葉提取的核基因組DNA為模板，分別擴(kuò)增PG基因啟動子1.4kb和310bp序列，以BamHI和KpnI酶切1.4kb序列PCR產(chǎn)物并克隆到pUC18載體上，構(gòu)建成pPGP克隆載體；擴(kuò)增的PG基因啟動子310bp序列以BamHI和PstI酶切并克隆到pUC18載體上，構(gòu)建成pPGPmr克隆載體。
4.一種克隆載體，其特征在于含有權(quán)利要求1的序列的克隆載體pPGPIR。
5.一種工程菌株，其特征在于是用權(quán)利要求4的克隆載體pPGPIR轉(zhuǎn)化的E.coli的DH5α工程菌株。
6.一種克隆載體，其特征在于含有權(quán)利要求1的序列的克隆載體pSKPGPIR。
7.一種工程菌株，其特征在于是用權(quán)利要求6的克隆載體pSKPGPIR轉(zhuǎn)化的E.coli的DH5α工程菌株。
8.一種表達(dá)載體，其特征在于含有權(quán)利要求1序列的植物表達(dá)載體pNPGIR。
9.一種工程菌株，其特征在于是用權(quán)利要求8的植物表達(dá)載體pNPGIR轉(zhuǎn)化的E.coli的JM109工程菌株。
10.一種工程菌株，其特征在于是用權(quán)利要求8的植物表達(dá)載體pNPGIR轉(zhuǎn)化的土壤農(nóng)桿菌LBA4404工程菌株。
全文摘要
一種番茄PG基因啟動子反向重復(fù)序列及其載體和工程菌株。本發(fā)明針對番茄果實(shí)成熟相關(guān)酶PG基因，設(shè)計特異性引物擴(kuò)增PG基因啟動子1400bp和310bp序列，將這兩個序列反向連接到pUC18上構(gòu)建成pPGPIR；再將反向重復(fù)序列克隆到pSK載體上構(gòu)建成pSKPGPIR。測定反向重復(fù)序列長度為1736bp，在距該序列一端313bp和另一端1417bp之間為標(biāo)志性BamHI酶切點(diǎn)，從兩個端部分別向序列中延伸310bp為互補(bǔ)序列。構(gòu)建的通用植物表達(dá)載體pPGN上的MCS包含6個特征性酶切點(diǎn)，PG基因啟動子反向重復(fù)序列克隆到pPGN上KpnI和BamHI之間，構(gòu)建成可廣泛研究植物PG基因抑制表達(dá)的新型載體pNPGIR。
文檔編號C12N15/82GK101045927SQ20061013066
公開日2007年10月3日 申請日期2006年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2006年12月29日
發(fā)明者白艷玲, 王丹, 付麗婭, 喬明強(qiáng), 徐海津, 張秀明, 劉仲齊 申請人:南開大學(xué), 天津市農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心