本發(fā)明涉及生物熒光分析技術(shù)領(lǐng)域所用的熒光染料，具體涉及一種可用于活細(xì)胞內(nèi)丙二醛成像的熒光探針及其制備方法。

背景技術(shù)：

熒光探針具有時空分辨率高、操作簡便及對生命過程干擾小等優(yōu)點，是研究生命科學(xué)、臨床醫(yī)療診斷及熒光免疫分析的主要技術(shù)手段。在細(xì)胞生物學(xué)的研究方面，熒光光譜常用于跟蹤細(xì)胞內(nèi)特定成分(靶標(biāo))的位置及變化等情況，從而揭示生物靶標(biāo)的特定生理/病理功能。目前已經(jīng)有相當(dāng)多的針對某種特定生物靶標(biāo)的商品化熒光探針，如可用于細(xì)胞核成像的染料Hoechst 33342等。由于細(xì)胞內(nèi)的生物靶標(biāo)很多，因此針對特定靶標(biāo)的熒光探針的研究是目前的熱門領(lǐng)域。

在生命體的生長發(fā)育及疾病發(fā)生方面，氧化應(yīng)激(oxidative stress)扮演了一個相當(dāng)重要的角色。氧化應(yīng)激是指氧自由基過量生成而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)受損，致使氧自由基及相關(guān)代謝產(chǎn)物過量聚集，從而對細(xì)胞產(chǎn)生多種毒性的病理狀態(tài)。丙二醛(Malondialdehyde,MDA)作為氧化應(yīng)激的一個重要生物標(biāo)志物(biomarker)，是細(xì)胞內(nèi)脂類化合物的氧化產(chǎn)物，其表達(dá)水平與多種疾病的發(fā)生有著密切關(guān)系，據(jù)報道包括白血病、糖尿病、腫瘤等多種疾病的發(fā)生都伴隨著丙二醛含量的升高，因此，對細(xì)胞內(nèi)丙二醛的檢測，對于研究與氧化應(yīng)激有關(guān)的生物及生理作用、揭示相關(guān)疾病的致病機(jī)制及提供相應(yīng)的診療方法等方面有著非常重要的意義。

目前有著多種針對丙二醛的檢測方法，臨床上使用最廣的是2-硫代巴比妥酸法，該方法是對2-硫代巴比妥酸與丙二醛在強(qiáng)酸高溫環(huán)境下縮合生成的產(chǎn)物進(jìn)行紫外檢測，優(yōu)點是檢出限低、靈敏度高，缺點是操作繁瑣、特異性差、重復(fù)性差(參見Anal.Biochem.1979,95,351-358及Free Radical Biol.Med.1990,9,515–540)。為克服這種檢測方法的缺點，已有多種檢測方法被開發(fā)出來，包括液相色譜法、電泳法、拉曼光譜法、質(zhì)譜法等，這些方法的缺陷都在于檢測樣品的繁瑣前處理，這些前處理過程往往需要強(qiáng)酸性或/和加熱的反應(yīng)條件，因此檢測的對象基本都是體液如尿液、血清等，不能用于生理條件下的在活細(xì)胞內(nèi)的成像。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服當(dāng)前只能用體外檢測方法檢測丙二醛的缺陷，提供一種可用于活細(xì)胞內(nèi)丙二醛成像的熒光探針。本發(fā)明的目的還在于提供該熒光探針的制備方法。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種可用于活細(xì)胞內(nèi)丙二醛成像的熒光探針，其結(jié)構(gòu)通式為：

通式中：X為NH、CONH、NHCO、O、S、SO₂、SO₂NH或NHSO₂；

R₁為(CH₂)_nR₅、(CH₂)_mOR₆或(CHR₇CH₂O)_pR₆，R₂為(CH₂)_nR₅或(CH₂)_mOR₆；

R₃、R₄均為H、Cl、Br、I、NO₂、CN、CONHNH₂或COOR₇；

R₁、R₂中：n、m、p均為0-18中的整數(shù)，R₅為H或COOR₆，R₆為H或C_1-18烷基(碳原子數(shù)為1-18的烷基)；

R₃、R₄中：R₇為H、C_1-18烷基或M，M為金屬離子如Na⁺、K⁺等。

優(yōu)選的，通式中：X為NH，R₁為CH₂CH₂CH₃，R₂為H，R₃為CONHNH₂或H，R₄為NO₂、CONHNH₂或H。

所述的可用于活細(xì)胞內(nèi)丙二醛成像的熒光探針的制備方法，包括如下步驟：以氨基取代的苯甲酸甲酯衍生物為起始原料，通過Buchwald-Hartwig反應(yīng)與溴代的1,8-萘二甲酰亞胺偶聯(lián)生成酯類中間物，再與水合肼縮合得到熒光探針。

所述的可用于活細(xì)胞內(nèi)丙二醛成像的熒光探針在檢測丙二醛中的應(yīng)用：所述的熒光探針在生理環(huán)境下能有效檢測到丙二醛，并在活細(xì)胞內(nèi)成功實現(xiàn)了內(nèi)源性及外源性丙二醛的生物成像。

本發(fā)明以苯甲酰肼(含取代的苯甲酰肼)為探針與丙二醛的作用部分，以1,8-萘二甲酰亞胺為熒光報道基團(tuán)，通過一定的連接基團(tuán)(如亞氨基)將這兩個部位連接得到可用于活細(xì)胞內(nèi)丙二醛成像的熒光探針。

本發(fā)明對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點和效果：

1、本發(fā)明首次實現(xiàn)了活細(xì)胞內(nèi)的丙二醛生物成像，目前尚無類似報道。

2、本發(fā)明所優(yōu)選的熒光探針MDAP-1，其斯托克斯位移可達(dá)到～180nm，從而完全避免了小的斯托克斯位移所導(dǎo)致染料的自吸收嚴(yán)重、激發(fā)光的散色干擾及由此帶來的檢測靈敏度 下降等缺點，有利于發(fā)揮染料的生物應(yīng)用。

3、本發(fā)明的熒光探針具有在生理環(huán)境下(pH＝7.4)定量檢測丙二醛的能力，定量檢測區(qū)間為2-200μM，最低檢出限低至0.6μM，具有較高的靈敏度。

4、本發(fā)明的熒光探針MDAP-1熒光響應(yīng)強(qiáng)，響應(yīng)時間短，在和1mM的丙二醛作用中，于5分鐘內(nèi)熒光增強(qiáng)60倍，10分鐘內(nèi)增強(qiáng)110倍，30分鐘內(nèi)達(dá)到150倍，這種大的熒光增強(qiáng)及熒光快速響應(yīng)，對于反應(yīng)活性高且在細(xì)胞內(nèi)快速降解的丙二醛的檢測而言，是十分有利的。

5、本發(fā)明的熒光探針MDAP-1顯示了優(yōu)良的選擇性。MDAP-1對各種金屬離子、各種氧化活性產(chǎn)物及多種活性羰基化合物都幾乎無熒光響應(yīng)。

6、本發(fā)明的熒光探針可用于內(nèi)源性及外源性丙二醛在活細(xì)胞內(nèi)的成像。在雙氧水所誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化應(yīng)激過程中，MDAP-1的熒光伴隨著雙氧水濃度的增高也發(fā)生不同程度的增強(qiáng)，揭示了細(xì)胞內(nèi)丙二醛的含量伴隨著氧化應(yīng)激過程的加強(qiáng)而升高的生物過程。并且，在加入等量的抗氧化劑---抗壞血酸及雙氧水后，熒光沒有變化，這也從側(cè)面證實了抗壞血酸的抗氧化能力，說明了抗壞血酸的藥物功能。在外源性丙二醛的細(xì)胞成像方面，MDAP-1的熒光伴隨著外加的丙二醛濃度的增大而呈現(xiàn)出逐漸增強(qiáng)的現(xiàn)象。

附圖說明

圖1是探針MDAP-1、MDAP-2、MDAP-3(10μM)與MDA(1mM)的熒光倍增對比圖。

圖2是MDAP-1(10μM)與MDA的熒光滴定曲線圖，MDA濃度由下至上依次為0、2、5、10、20、50、100、200、400、600、800、1000μM。

圖3是MDAP-1與MDA濃度的熒光響應(yīng)關(guān)系圖，內(nèi)插圖顯示在MDA濃度區(qū)間為0-200μM時，熒光強(qiáng)度與MDA濃度呈線性關(guān)系。

圖4是MDAP-1(10μM)與MDA(1mM)作用的熒光強(qiáng)度-時間關(guān)系圖。

圖5是金屬離子、ROS及RCS對MDAP-1的熒光響應(yīng)圖，圖中，1：MDAP-1，2：Mg²⁺，3：Cd²⁺，4：Ca²⁺，5：Mn²⁺，6：Zn²⁺，7：Hg²⁺，8：Fe²⁺，9：Cu²⁺，10：H₂O₂，11：ClO^-；12：O₂^-，13：¹O₂，14：·OH，15：丙酮，16：乙醛，17：戊二醛，18：乙酰丙酮，19：甲醛，20：乙二醛，21：丙酮醛，22：丙二醛；黑色柱狀和帶斜線的柱狀代表檢測物濃度分別為0.1及1mM的熒光強(qiáng)度。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制，在不背 離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。

實施例1

可用于活細(xì)胞內(nèi)丙二醛成像的熒光探針MDAP-1、MDAP-2、MDAP-3的合成路線如下反應(yīng)式所示：

①采用Buchwald-Harwig氨基偶聯(lián)法合成中間物(3a、3b、3c)

A.化合物3a的合成

稱量300毫克6-溴-2-丙基-1H-苯并[de]異喹啉-1,3(2H)-二酮(化合物1，2.0mmol)(化合物1的合成見J.Org.Chem.2013,78,3980-3988)加入到50毫升兩口燒瓶中，再依次加入370毫克5-氨基-2-硝基苯甲酸甲酯(化合物2a，1.89mmol)(化合物2a的合成見Tetrahedron.Lett.2005,46,7477-7481)、42毫克Pd₂(dba)₃(0.046mmol)及66毫克(±)-2,2'-雙-(二苯膦基)-1,1'-聯(lián)萘(BINAP)，攪拌混合后脫氣，用注射器加入18毫升新鮮蒸餾的甲苯，加熱至沸，在回流條件下反應(yīng)過夜，冷卻至室溫。減壓除去溶劑后上色譜柱，淋洗劑為乙酸乙酯/石油醚(4:1，v/v)，得橙色粉末目標(biāo)產(chǎn)物。收率：53.2％。

¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz)δ10.03(s,1H),8.63(d,J＝8.0Hz,1H),8.54(d,J＝8.0Hz,1H),8.43(d,J＝8.0Hz,1H),8.14(d,J＝12.0Hz,1H),7.86(t,J₁＝J₂＝8.0Hz,1H),7.77(d,J＝8.0Hz,1H),7.48(m,1H),7.44(d,J＝8.0Hz,1H),4.01(t,J₁＝J₂＝8.0Hz,2H),3.85(s,3H),1.65(m,2H),0.93(t,J₁＝J₂＝8.0Hz,3H).¹³C NMR(DMSO-d₆,101MHz)δ166.57,163.85,163.21,148.98,143.41,138.47,132.62,131.71,131.13,129.61,129.46,127.50,126.91,124.97,122.79,118.30,116.73,116.07,103.92,53.55,41.45,21.26,11.75.HRMS–ESI(m/z):[M+H⁺]calcd.for C₂₃H₂₀N₃O₆,434.1352；found,434.1388.

B.化合物3b的合成

化合物3b的合成方法類同化合物3a，將370毫克5-氨基-2-硝基苯甲酸甲酯(化合物2a，1.89mmol)換成285毫克4-氨基苯甲酸甲酯(化合物2b，1.89mmol)，其余步驟同化合物3a的合成。收率：45.6％。

¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz)δ9.64(s,1H),8.73(d,J＝8.0Hz,1H),8.51(d,J＝8.0Hz,1H),8.35(d,J＝8.0Hz,1H),7.96(d,J＝8.0Hz,2H),7.83(t,J₁＝J₂＝8.0Hz,1H),7.60(d,J＝8.0Hz,1H),7.44(d,J＝8.0Hz,2H).3.99(t,J₁＝J₂＝8.0Hz,2H).3.84(s,3H),1.65(m,2H),0.92(t,J₁＝J₂＝8.0Hz,3H).¹³C NMR(DMSO-d₆,101MHz)δ165.77,163.50,162.76,146.15,145.16,132.66,131.08,130.83,129.16,129.15,125.66,123.09,122.73,122.11,118.80,113.69,111.63,51.82,40.93,20.87,11.36.HRMS–ESI(m/z):[M+H⁺]calcd.for C₂₃H₂₁N₂O₄,389.1501；found,389.1490.

C.化合物3c的合成

化合物3c的合成方法類同化合物3a，將370毫克5-氨基-2-硝基苯甲酸甲酯(化合物2a，1.89mmol)換成285毫克3-氨基苯甲酸甲酯(化合物2c，1.89mmol)，其余步驟同化合物3a的合成。收率：63.5％。

¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz)δ9.54(s,1H),8.80(d,J＝8.0Hz,1H),8.52(d,J＝8.0Hz,1H),8.32(d,J＝8.0Hz,1H),7.96(s,2H),7.83(t,J₁＝J₂＝8.0Hz,1H),7.72(d,J＝8.0Hz,1H),7.69(d,J＝8.0Hz,1H),7.58(t,J₁＝J₂＝8.0Hz,1H),7.37(d,J＝8.0Hz,1H),4.00(t,J₁＝J₂＝8.0Hz,2H).3.87(s,3H),1.64(m,2H),0.92(t,J₁＝J₂＝8.0Hz,3H).¹³CNMR(DMSO-d₆,101MHz)δ165.91,163.54,162.73,146.79,141.19,133.09,131.00,130.86,129.90,129.30,128.88,125.98,125.30,123.99,122.10,122.01,122.00,112.06,108.46,52.25,40.85,20.88,11.35.HRMS–ESI(m/z):[M+H⁺]calcd.for C₂₃H₂₁N₂O₄,389.1501；found,389.1490.

②熒光探針MDAP-1、MDAP-2、MDAP-3的合成

A.MDAP-1的合成

將110毫克化合物3a(0.26mmol)溶于8毫升甲醇，加入0.4毫升水合肼(8.25mmol)，加熱攪拌回流過夜，冷卻后減壓蒸去溶劑，油狀粗品經(jīng)色譜柱(淋洗劑為乙酸乙酯/甲醇，10:1)分離得到橙色目標(biāo)產(chǎn)物MDAP-1。收率：55.0％。

¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz)δ10.03(s,1H),8.63(d,J＝8.0Hz,1H),8.54(d,J＝8.0Hz,1H),8.43(d,J＝8.0Hz,1H),8.14(d,J＝12.0Hz,1H),7.86(t,J₁＝J₂＝8.0Hz,1H),7.77(d,J＝ 8.0Hz,1H),7.48(m,1H),7.44(d,J＝8.0Hz,1H),4.01(t,J₁＝J₂＝8.0Hz,2H).3.85(s,3H),1.65(m,2H),0.93(t,J₁＝J₂＝8.0Hz,3H).¹³C NMR(DMSO-d₆,101MHz)δ166.57,163.85,163.21,148.98,143.41,138.47,132.62,131.71,131.13,129.61,129.46,127.50,126.91,124.97,122.79,118.30,116.73,116.07,103.92,53.55,41.45,21.26,11.75.HRMS–ESI(m/z):[M+H⁺]calcd.for C₂₃H₂₀N₃O₆,434.1352；found,434.1388.

B.MDAP-2的合成

MDAP-2的合成方法類同MDAP-1，將110毫克化合物3a(0.26mmol)換成100毫克化合物3b(0.26mmol)，其余步驟同MDAP-1的合成，得到深黃色目標(biāo)產(chǎn)物MDAP-2。收率：37.4％。

¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz)δ9.73(s,1H),9.55(s,1H),8.78(d,J＝12Hz,1H),8.51(d,J＝12Hz,1H),8.32(d,J＝8.0Hz,1H),7.89(d,J＝8.0Hz,2H),7.82(t,J₁＝J₂＝8.0Hz,1H),7.48(d,J＝8.0Hz,1H),7.43(d,J＝8.0Hz),4.52(brs,2H),3.99(t,J₁＝J₂＝8Hz,2H),1.64(m,2H),0.92(t,J₁＝J₂＝8.0Hz,3H).¹³CNMR(DMSO-d₆,101MHz)δ165.43,163.54,162.76,146.21,143.64,132.98,131.03,129.28,129.15,128.40,127.47,125.37,122.41,122.02,119.99,112.49,109.81,40.88,20.88,11.36.HRMS–ESI(m/z):[M+H⁺]calcd.for C₂₂H₂₁N₄O₃,389.1614；found,389.1603.

C.MDAP-3的合成方法類同MDAP-1，將110毫克化合物3a(0.26mmol)換成100毫克化合物3c(0.26mml)，其余步驟同MDAP-1的合成，得到橙色目標(biāo)產(chǎn)物MDAP-3。收率：42.8％。

¹H NMR(DMSO-d₆,400MHz)δ9.86(s,1H),9.46(s,1H),8.78(d,J＝8.0Hz,1H),8.46(d,J＝8.0Hz,1H),8.25(d,J＝8.0Hz,1H),7.86(s,1H),7.77(t,J₁＝J₂＝8.0Hz,1H),7.61(m,1H),7.52(m,2H),7.30(d,J＝8.0Hz,1H),4.57(brs,2H),3.96(t,J₁＝J₂＝8.0Hz,2H),1.62(m,2H),0.91(t,J₁＝J₂＝8.0Hz,3H).¹³C NMR(DMSO-d₆,101MHz)δ165.58,163.59,162.78,147.16,140.68,134.55,133.23,129.56,129.26,128.85,125.20,124.61,122.10,121.88,121.71,120.66,111.50,108.23,40.85,20.87,11.33.HRMS–ESI(m/z):[M+H⁺]calcd.for C₂₂H₂₁N₄O₃,389.1614；found,389.1604.

實施例2 熒光探針MDAP-1、MDAP-2、MDAP-3與丙二醛(MDA)的熒光響應(yīng)

用DMSO配制熒光探針MDAP-1、MDAP-2及MDAP-3的儲備液(100mM)，取少量加入EP管中，用PBS緩沖液(10mM，pH 7.4)稀釋，加入一定量的MDA溶液，再用DMSO及PBS稀釋至探針終濃度為10μM、MDA的終濃度為1mM(此時溶劑構(gòu)成：DMSO:PBS＝1:9， 體積比，pH 7.4)。將EP管在37℃下溫育四小時后測量其熒光響應(yīng)情況。取最大激發(fā)波長為370nm，三個化合物的發(fā)射波長都在550-553nm左右，斯托克斯位移都在180nm左右，這個斯托克斯位移相對于普通的熒光探針而言是相當(dāng)大的，能有效避開激發(fā)光對發(fā)射的干擾，對于細(xì)胞成像是十分有利的；三個探針的熒光強(qiáng)度相對于與MDA反應(yīng)前，分別增強(qiáng)了174、50及140倍(見圖1)。由于MDAP-1的熒光響應(yīng)最為理想，因此選擇該探針做進(jìn)一步的研究。

實施例3 熒光探針MDAP-1與丙二醛(MDA)的量的相互關(guān)系

取MDAP-1的DMSO儲備液少量于EP管中，用PBS緩沖液(10mM，pH 7.4)稀釋，加入一定量的MDA溶液，再用PBS及DMSO稀釋至探針終濃度為10μM，MDA的終濃度分別為0、2、5、10、20、50、100、200、400、600、800、1000μM。在37℃溫育4小時，檢測溶液的熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長：370nm；發(fā)射波長：553nm。MDAP-1-MDA滴定的熒光圖見圖2；其熒光強(qiáng)度與MDA的關(guān)系圖見圖3。溶劑構(gòu)成：DMSO:PBS＝1:9，體積比，pH 7.4)。結(jié)果顯示，MDAP-1的熒光強(qiáng)度隨濃度的增大而增高，且在0-200μM的濃度范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度與MDA的濃度呈現(xiàn)出線性關(guān)系，最低檢測限經(jīng)計算為0.6μM。

實施例4 熒光探針MDAP-1與丙二醛(MDA)的熒光-時間相互關(guān)系

取MDAP-1的DMSO儲備液少量于EP管中，用PBS緩沖液(10mM，pH7.4)稀釋，加入一定量的MDA溶液，再用PBS及DMSO稀釋至探針終濃度為10μM、MDA的終濃度為1mM。在37℃溫育，取不同時間點的溶液檢測其熒光響應(yīng)情況(激發(fā)波長：370nm；發(fā)射波長：553nm。溶劑構(gòu)成：DMSO:PBS＝1:9，體積比，pH 7.4)。MDAP-1對MDA的熒光響應(yīng)很快，在5分鐘時熒光增強(qiáng)60倍、10分鐘時熒光增強(qiáng)110倍、30分鐘達(dá)到約150倍(見圖4)。由于MDA在細(xì)胞內(nèi)活性高、易于降解，MDAP-1對MDA良好的響應(yīng)速度對于MDA在細(xì)胞內(nèi)的成像是有利的。

實施例5 熒光探針MDAP-1對MDA的熒光響應(yīng)的選擇性

本實施例的考察對象分為三個層面。

首先考察的MDAP-1對離子的熒光響應(yīng)情況，將Mg²⁺、Cd²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Hg²⁺、Fe²⁺和Cu²⁺分別加入MADP-1溶液中(離子終濃度分別為0.1及1mM；MDAP-1終濃度為10μM；溶劑構(gòu)成：DMSO:PBS＝1:9，體積比，pH 7.4)，在370nm激發(fā)下檢測553nm的熒光發(fā)射情況，結(jié)果見圖5，和未加離子的探針MDAP-1相比較，加離子后探針MDAP-1熒光無明顯變化。

由于MDA是氧化應(yīng)激的產(chǎn)物，而氧化應(yīng)激也會產(chǎn)生活性氧簇(Reactive Oxidative Stress,ROS)，因此考察了ROS對探針的干擾情況，將H₂O₂、ClO^-、O₂^-、¹O₂及·OH分別加入到MDAP-1 溶液中(ROS終濃度分別為0.1及1mM；MDAP-1終濃度為10μM；溶劑構(gòu)成：DMSO:PBS＝1:9，體積比，pH 7.4)，在370nm激發(fā)下檢測553nm的熒光發(fā)射情況，結(jié)果見圖5，同樣加入ROS后探針MDAP-1熒光無顯著改變。

最后考察了與MDA結(jié)構(gòu)較為接近的活性羰基化合物(Reactive carbonyl species,RCS)，將1mM的丙酮、乙醛、戊二醛、乙酰丙酮、甲醛、乙二醛及丙酮醛加入到MDAP-1溶液中(RCS終濃度分別為0.1及1mM；MDAP-1終濃度為10μM；溶劑構(gòu)成：DMSO:PBS＝1:9，體積比，pH 7.4)，在370nm激發(fā)下檢測553nm的熒光發(fā)射情況，結(jié)果見圖5，同樣加入RCS后探針MDAP-1熒光無顯著改變。以上結(jié)果表明MDAP-1的對MDA的優(yōu)良選擇性。

實施例6 熒光探針MDAP-1的細(xì)胞毒性

將不同濃度的MDAP-1(0、1、5、10μM)加入到已孵育好的Hela細(xì)胞內(nèi)，繼續(xù)孵育24小時，應(yīng)用MTT法檢測細(xì)胞的增殖情況。測試結(jié)果表明，MDAP-1在0-10μM的濃度下未顯示出明顯的細(xì)胞毒性。

實施例7 細(xì)胞內(nèi)外源性及內(nèi)源性MDA的成像

①外源性MDA的細(xì)胞成像

在孵育好的Hela細(xì)胞培養(yǎng)基內(nèi)加入5μM的MDAP-1，溫育30分鐘后分別加入不同濃度的丙二醛(0、0.1、0.2、0.5mM)繼續(xù)溫育30分鐘，加入PBS緩沖液(pH 7.4)震蕩洗滌3次(每次5分鐘)，再加入細(xì)胞培養(yǎng)基，在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。使用激發(fā)光源為400nm。收集500-650nm的成像圖片。結(jié)果顯示，MDAP-1可使Hela細(xì)胞帶有微弱的熒光，在0.1mM的MDA作用下，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)約0.2倍；在0.2mM的MDA作用下，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)約1.0倍；而在0.5mM的MDA作用下，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)約2.7倍。上述結(jié)果表明MDAP-1可用于外源性MDA的細(xì)胞成像。

②內(nèi)源性MDA的細(xì)胞成像

由于MDA是細(xì)胞氧化應(yīng)激的產(chǎn)物，因此內(nèi)源性MDA的產(chǎn)生可通過雙氧水誘導(dǎo)細(xì)胞的氧化應(yīng)激來實現(xiàn)。在本實驗中，HeLa細(xì)胞先與5μM的MDAP-1孵育30分鐘，使用激發(fā)光源為400nm，在0時刻分別加入0.1及0.5mM的雙氧水，每隔30秒鐘收集500-650nm的熒光強(qiáng)度。在30秒時刻熒光強(qiáng)度即已達(dá)到平臺，以后的時間內(nèi)(總檢測時間為6分鐘)熒光強(qiáng)度無顯著改變。在0.1mM的雙氧水作用下，熒光強(qiáng)度和未加入雙氧水的相比較增長了2％，而0.5mM的雙氧水則增長了20％。

為了證明MDA的發(fā)生的確是由于氧化應(yīng)激產(chǎn)生的，一種抗氧劑---抗壞血酸(0.5mM)和雙氧水(0.5mM)被同時加入到5μM的MDAP-1作用過的HeLa細(xì)胞中，操作過程同上， 在整個觀測時間內(nèi)未見到熒光的變化。上述結(jié)果說明MDAP-1可用于由雙氧水誘發(fā)的內(nèi)源性MDA的細(xì)胞成像。