本發(fā)明涉及一類熒光染料。更具體地，涉及一類基于香豆素和熒光素的雜合熒光染料及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近年來，熒光染料伴隨著生命科學(xué)的發(fā)展發(fā)揮著越來越重要的作用，特別是隨著熒光分析檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，具有熒光特性的有機(jī)小分子在酶分析、生物分子標(biāo)記、細(xì)胞染色、臨床檢驗(yàn)診斷及環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域被廣泛的應(yīng)用，以有機(jī)小分子為基礎(chǔ)的熒光分子探針的報(bào)道也已屢見不鮮，這些探針分子具有操作簡(jiǎn)便、選擇性高、膜透性好、可重復(fù)性強(qiáng)，能原位檢測(cè)等眾多優(yōu)點(diǎn)。此外，分子熒光探針可參與監(jiān)控活細(xì)胞及活體中的生物分子與其代謝過程，使活細(xì)胞與計(jì)算機(jī)之間搭起一座橋梁，通過光纖傳遞信號(hào)進(jìn)而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)代謝過程的可視化。近年來關(guān)于各類小分子及離子的熒光探針的報(bào)道層出不窮，分子熒光探針己成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者們的研究熱點(diǎn)。目前，常見的經(jīng)典有機(jī)熒光團(tuán)包括內(nèi)源性的熒光分子(如熒光蛋白、還原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)等)和化學(xué)熒光探針，如：香豆素類、氧雜蒽類及其類似物等，它們?cè)谔结橆I(lǐng)域有著各自的優(yōu)勢(shì)及局限性。
香豆素類化合物是自然界中廣泛存在的一類重要天然雜環(huán)化合物。香豆素類化合物的母體結(jié)構(gòu)為苯并吡喃，最早由vogel于1820年從黃香草木犀中提取得到，但直到1868年，才由perkin首次人工合成了香豆素衍生物。研究表明，香豆素類化合物具有多方面獨(dú)特的生理學(xué)和生物學(xué)活性，例如：抗高血壓、抗凝血、抗真菌、抗細(xì)菌、抗病毒、抗癌等一系列的生物和藥用活性。近年來發(fā)現(xiàn)香豆素類化合物還具有抗氧化、抗衰老以及抵抗當(dāng)今危害人類健康的頑癥aids和腫瘤方面有較好的藥物活性，因此倍受國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。香豆素化合物除具有獨(dú)特生物活性外，還具有優(yōu)異的光學(xué)特性。香豆素類化合物的母核苯并吡喃是沒有熒光的無(wú)色物質(zhì)，但取代后的香豆素衍生物，特別是7位上引入給電子基團(tuán)，3或4位上引入吸電子基團(tuán)后，形成推拉電子體系，便得到熒光物質(zhì)，同時(shí)最大吸收波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)會(huì)發(fā)生 紅移。由于香豆素類化合物有較大的斯托克斯位移、生物相容性好、合成簡(jiǎn)單結(jié)構(gòu)易于修飾和易于通過改變分子內(nèi)存在的推拉體系容易調(diào)控光學(xué)性能等優(yōu)點(diǎn)，因此，香豆素類衍生物被廣泛的用做激光染料、熒光增白劑等，也是分子熒光探針設(shè)計(jì)中最常用的熒光團(tuán)之一。但香豆素?zé)晒馊玖系牧孔赢a(chǎn)率并不是特別高，吸收發(fā)射一般位于藍(lán)紫色區(qū)域。
氧雜蒽類熒光探針以熒光素為典型代表，其是目前世界上最受歡迎的熒光分子之一，由adolphbaeyer在1871年首次合成并命名。熒光素以其優(yōu)越的性能被化學(xué)家們一直研究并在大量的熒光團(tuán)分子中占據(jù)重要的地位，如原料相對(duì)廉價(jià)、熒光量子效率較高、摩爾消光系數(shù)較大、水溶性較好、激發(fā)波長(zhǎng)與488nm的氬離子激光器相匹配等、在水溶液中可以中性離子，陰離子，陽(yáng)離子，雙陽(yáng)離子形式存在，因此對(duì)ph特別敏感，可設(shè)計(jì)為ph熒光探針等，在過去的幾十年中，熒光素己被衍生合成為一系列的熒光探針作為細(xì)胞學(xué)和免疫化學(xué)中的檢測(cè)試劑，包括5(6)-羧基熒光素，異硫氰酸熒光素以及5(6)-乙酰氨基熒光素等。在細(xì)胞研究領(lǐng)域，熒光素是最早被用作ph探針的染料之一，它的熒光強(qiáng)度與ph的變化密切相關(guān)，ph<5時(shí)熒光素以弱熒光的電中性形式存在，ph介于5和6.5之間時(shí)以單陰離子(羧基去質(zhì)子化)形式存在，而當(dāng)ph>6.5時(shí)平衡轉(zhuǎn)化，熒光素以高量子效率的強(qiáng)熒光的雙負(fù)離子結(jié)構(gòu)形式存在。熒光素的光穩(wěn)定性、吸收與發(fā)射波長(zhǎng)范圍以及pka等都可以通過引入不同的取代基來修飾其結(jié)構(gòu)來調(diào)整。盡管基于熒光素的許多染料已被廣泛應(yīng)用于生物分析，但它也存在不少已被公認(rèn)的缺陷：(1)光穩(wěn)定性較差，易被光猝滅；(2)stokes位移小，激發(fā)光源干擾發(fā)射信號(hào)的收集；(3)用于細(xì)胞成像時(shí)容易被細(xì)胞代謝裂解或是易與蛋白質(zhì)形成復(fù)合物而使熒光減弱，降低了熒光分析的靈敏度。
終上所述，香豆素類和熒光素類熒光染料都存在著各自缺陷，在應(yīng)用到生物體系識(shí)別領(lǐng)域還有很多的局限性。香豆素?zé)晒馊玖系牧孔赢a(chǎn)率并不是特別高，吸收發(fā)射一般位于藍(lán)紫色區(qū)域?；跓晒馑氐脑S多染料，光穩(wěn)定性較差，stokes位移小，激發(fā)光源干擾發(fā)射信號(hào)的收集。因此，合成化學(xué)和光學(xué)性質(zhì)更加穩(wěn)定、量子產(chǎn)率更高、毒性小、stokes位移大、易于修飾的新型熒光染料具有重大的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明基于原料易得的熒光素衍生物，通過活潑的丙二酸二乙酯偶聯(lián)到熒光素類似物形成一個(gè)香豆素結(jié)構(gòu)，具有大的共軛體系，作為重要的中間體，由其可以生成一系列不對(duì)稱、非直線型共軛結(jié)構(gòu)的熒光染料。這類基于香豆素和熒光素的熒光染料具有熒光素量 子產(chǎn)率高的特點(diǎn)，也具有香豆素stokes位移大的性質(zhì)，位移大可以有效避免激發(fā)光源對(duì)發(fā)射信號(hào)收集的干擾；同時(shí)，該類染料生物相容性好，低毒性，具有細(xì)胞膜通透性，可用于生物體系中的細(xì)胞器或生物大分子如蛋白質(zhì)等的共價(jià)熒光標(biāo)記，對(duì)于研究生命科學(xué)有非常重要的作用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種基于香豆素和熒光素的雜合熒光染料，該雜合熒光染料具有不對(duì)稱、非直線型共軛結(jié)構(gòu)，且具有熒光素量子產(chǎn)率高、熒光穩(wěn)定性好、stokes位移大、生物相容性好、低毒性以及細(xì)胞膜通透性等特點(diǎn)。
本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種基于香豆素和熒光素的雜合熒光染料的制備方法，該制備方法簡(jiǎn)單，基于原料易得的熒光素衍生物，通過活潑的丙二酸二乙酯偶聯(lián)到熒光素類似物形成一個(gè)香豆素結(jié)構(gòu)，具有大的共軛體系，作為重要的中間體，由其可以生成一系列不對(duì)稱、非直線型共軛結(jié)構(gòu)的熒光染料。
本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種基于香豆素和熒光素的雜合熒光染料的應(yīng)用。
為達(dá)到上述第一個(gè)目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
基于香豆素和熒光素的雜合熒光染料，其特征在于，具有如下結(jié)構(gòu)式i：
其中，r1、r2、r3、r4分別獨(dú)立的為氫、羥基、烴基或鹵素；r5、r6、r7、r8、r9分別獨(dú)立的為氫、甲基、甲氧基、羧基、磺酸基、羥基、氨基、硝基、鹵素、胺基、甲酰胺基或甲酸酯基；x為羧基、氫、甲醛基、甲酰胺基或甲酸酯基；
所述r1、r2、r3、r4中的烴基為直鏈、支鏈或環(huán)狀；所述烴基包含1-8個(gè)碳原子；
所述r5、r6、r7、r8、r9、x中甲酸酯基為2-20個(gè)碳原子烴基甲酸酯基、2-20個(gè)碳原子取代烷基甲酸酯基、甲酸芐基酯基或甲酸n-琥珀酰亞胺酯基；
所述r5、r6、r7、r8、r9、x中甲酰胺基為2-20個(gè)碳原子烴基甲酰胺基、2-20個(gè)碳原子取代烷基取代甲酰胺基、芐基甲酰胺基或馬來酰亞胺基；
所述r5、r6、r7、r8、r9中胺基為1-20個(gè)碳原子烴基胺基、1-20個(gè)碳原子取代烷基取代胺基或1-20個(gè)碳原子?；坊?；
所述鹵素為氟、氯、溴或碘。
優(yōu)選地，所述r1、r2、r3、r4中的烴基，分別獨(dú)立的為甲基、乙基、丙基、異丙基、環(huán)丙基、烯丙基、丁基、異丁基、叔丁基、戊基、異戊基、新戊基、叔戊基、己基、2-甲基戊基、環(huán)己基、庚基、2-甲基己基、辛基或2-甲基庚基；
所述r5、r6、r7、r8、r9、x中的甲酸酯基，其中2-20個(gè)碳原子烴基甲酸酯基為coo(ch2)nch3或cooch2ch＝ch2，其中，n為0-18；
所述r5、r6、r7、r8、r9、x中甲酸酯基，其中2-20個(gè)碳原子取代烷基甲酸酯基為coo(ch2)nch2cooh、coo(ch2)nch2coom、coo(ch2)nch2so3h或coo(ch2)nch2so3m，其中，n為0-18，m為平衡電荷的陽(yáng)離子；
所述r5、r6、r7、r8、r9、x中甲酰胺基，其中，2-20個(gè)碳原子烴基甲酰胺基為conh(ch2)nch3或con[(ch2)nch3]2，其中，n為0-9；
所述r5、r6、r7、r8、r9、x中甲酰胺基，其中2-20個(gè)碳原子取代烷基取代甲酰胺基為conh(ch2)nch2cooh、con[(ch2)nch2cooh]2、conh(ch2)nch2coom、con[(ch2)nch2coom]2、conh(ch2)nch2so3h、con[(ch2)nch2so3h]2、conh(ch2)nch2so3m或con[(ch2)nch2so3m]2，其中，n為0-8，m為平衡電荷的陽(yáng)離子；
所述r5、r6、r7、r8、r9中胺基，其中，1-20個(gè)碳原子烴基胺基為nh(ch2)nch3或n[(ch2)nch3]2，其中，n為0-9；
所述r5、r6、r7、r8、r9中胺基，其中，1-20個(gè)碳原子取代烷基取代胺基為nh(ch2)nch2cooh、n[(ch2)nch2cooh]2、nh(ch2)nch2coom、n[(ch2)nch2coom、nh(ch2)nch2so3、n[(ch2)nch2so3h]2]2、nh(ch2)nch2so3m或n[(ch2)nch2so3m]2，其中，n為0-9，m為平衡電荷的陽(yáng)離子；
所述r5、r6、r7、r8、r9中胺基，其中1-20個(gè)碳原子?；坊鶠橐阴；? 胺基、叔丁氧羰基胺基、苯甲?；坊?、甲基取代苯甲酰基胺基、乙基取代苯甲?；坊⒙热〈郊柞；坊迦〈郊柞；坊蝰R來酰亞胺基。
為達(dá)到上述第二個(gè)目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
本發(fā)明還公開了上述基于香豆素和熒光素的雜合熒光染料的制備方法，具體的，
當(dāng)所述雜合熒光染料的結(jié)構(gòu)式i中x為羧基時(shí)，其制備方法包括如下步驟：
向2毫摩爾化合物ii與1-5毫摩爾丙二酸二乙酯的混合物中加入15-20ml無(wú)水乙醇，攪拌均勻后，加入0.2ml六氫吡啶，于70-80℃溫度下回流反應(yīng)1-24h；冷卻至室溫后，旋蒸除去無(wú)水乙醇，向殘余物中加入蒸餾水，使用二氯甲烷萃取，用無(wú)水mgso4干燥后，旋蒸除去二氯甲烷，得到粗產(chǎn)品中間體，真空干燥，再柱層析純化得中間體化合物iii；
將1毫摩爾化合物iii溶到5-10mlnaoh的meoh溶液中，加熱至100℃回流反應(yīng)3-5h，冷卻，過濾出殘余物，真空干燥后得產(chǎn)物ia；
所述化合物ii的結(jié)構(gòu)式如下：
所述化合物iii的結(jié)構(gòu)式如下：
所述產(chǎn)物化合物ia的結(jié)構(gòu)式如下：
其中，上述r1、r2、r3、r4分別獨(dú)立的為氫、羥基、烴基或鹵素；r5、r6、r7、r8、r9分別獨(dú)立的為氫、甲基、甲氧基、羧基、磺酸基、羥基、氨基、硝基、鹵素、胺基、甲酰胺基或甲酸酯基。
當(dāng)所述雜合熒光染料的結(jié)構(gòu)式i中x為氫時(shí)，其制備方法包括如下步驟：
向2毫摩爾化合物ii與1-5毫摩爾丙二酸二乙酯的混合物中加入15-20ml無(wú)水乙醇，攪拌均勻后，加入0.2ml六氫吡啶，于70-80℃溫度下回流反應(yīng)1-24h；冷卻至室溫后，旋蒸除去無(wú)水乙醇，向殘余物中加入蒸餾水，使用二氯甲烷萃取，用無(wú)水mgso4干燥后，旋蒸除去二氯甲烷，得到粗產(chǎn)品中間體，真空干燥，再柱層析純化得中間體化合物iii；
向1毫摩爾化合物iii中加入8毫升體積比為1：1的濃鹽酸和冰醋酸，于70-80℃加熱回流反應(yīng)4-6h；將反應(yīng)液冷卻至室溫，倒入20毫升冰水，用質(zhì)量百分濃度為40％的naoh溶液調(diào)節(jié)溶液的ph值到5，收集析出的固體；繼續(xù)攪拌30min，將粗產(chǎn)品過濾、水洗3次，真空干燥后重結(jié)晶純化，得到產(chǎn)物ib；
所述化合物ii的結(jié)構(gòu)式如下：
所述化合物iii的結(jié)構(gòu)式如下：
所述產(chǎn)物ib的結(jié)構(gòu)式如下：
其中，上述r1、r2、r3、r4分別獨(dú)立的為氫、羥基、烴基或鹵素；r5、r6、r7、r8、r9分別獨(dú)立的為氫、甲基、甲氧基、羧基、磺酸基、羥基、氨基、硝基、鹵素、胺基、甲酰胺基或甲酸酯基。
當(dāng)所述雜合熒光染料的結(jié)構(gòu)式i中x為甲醛基時(shí)，其制備方法包括如下步驟：
向2毫摩爾化合物ii與1-5毫摩爾丙二酸二乙酯的混合物中加入15-20ml無(wú)水乙醇，攪拌均勻后，加入0.2ml六氫吡啶，于70-80℃溫度下回流反應(yīng)1-24h；冷卻至室溫后，旋蒸除去無(wú)水乙醇，向殘余物中加入蒸餾水，使用二氯甲烷萃取，用無(wú)水mgso4干燥后，旋蒸除去二氯甲烷，得到粗產(chǎn)品中間體，真空干燥，再柱層析純化得中間體化合物iii；
向1毫摩爾化合物iii中加入8毫升體積比為1：1的濃鹽酸和冰醋酸，于70-80℃加熱回流反應(yīng)4-6h；將反應(yīng)液冷卻至室溫，倒入20毫升冰水，用質(zhì)量百分濃度為40％的naoh溶液調(diào)節(jié)溶液的ph值到5，收集析出的固體；繼續(xù)攪拌30min，將粗產(chǎn)品過濾、水洗3次，真空干燥后重結(jié)晶純化，得到化合物ib；
在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，向0.5毫升三氯氧磷中滴加0.5毫升dmf，30min內(nèi)滴加完畢，反應(yīng)液溫度控制在50℃；待反應(yīng)液呈淡紅色，再向其中滴加2毫升溶有1.4mmol化合物ib的dmf溶液；反應(yīng)液在60℃下繼續(xù)反應(yīng)8-12h后，將其倒入20毫升的冰水中，收集析出的紅色固體；粗產(chǎn)品經(jīng)過濾、水洗3次、真空干燥，再重結(jié)晶純化得到相應(yīng)化合物ib的醛基產(chǎn)物ic；
所述化合物ii的結(jié)構(gòu)式如下：
所述中間體iii的結(jié)構(gòu)式如下：
所述化合物ib的結(jié)構(gòu)式如下：
所述產(chǎn)物ic的結(jié)構(gòu)式如下：
其中，上述r1、r2、r3、r4分別獨(dú)立的為氫、羥基、烴基或鹵素；r5、r6、r7、r8、r9分別獨(dú)立的為氫、甲基、甲氧基、羧基、磺酸基、羥基、氨基、硝基、鹵素、胺基、甲酰胺基或甲酸酯基。
當(dāng)所述雜合熒光染料的結(jié)構(gòu)式i中x為甲酸酯基時(shí)，其制備方法包括如下步驟：
向2毫摩爾化合物ii與1-5毫摩爾丙二酸二乙酯的混合物中加入15-20ml無(wú)水乙醇，攪拌均勻后，加入0.2ml六氫吡啶，于70-80℃溫度下回流反應(yīng)1-24h；冷卻至室溫后，旋蒸除去無(wú)水乙醇，向殘余物中加入蒸餾水，使用二氯甲烷萃取，用無(wú)水mgso4干燥后，旋蒸除去二氯甲烷，得到粗產(chǎn)品中間體，真空干燥，再柱層析純化得中間體化合物iii；
將1毫摩爾化合物iii溶到5-10mlnaoh的meoh溶液中，加熱至100℃回流反應(yīng)3-5h，冷卻，過濾出殘余物，真空干燥后得化合物ia；
將0.5毫摩爾化合物ia、0.5毫摩爾相應(yīng)的鹵代化合物r10y溶于10毫升干燥的dmf，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)12h后，蒸干溶劑柱層析分離純化得到產(chǎn)物id；
所述化合物ii的結(jié)構(gòu)式如下：
所述化合物iii的結(jié)構(gòu)式如下：
所述化合物ia的結(jié)構(gòu)式如下：
所述產(chǎn)物id的結(jié)構(gòu)式如下：
其中，上述r1、r2、r3、r4分別獨(dú)立的為氫、羥基、烴基或鹵素；r5、r6、r7、r8、r9分別獨(dú)立的為氫、甲基、甲氧基、羧基、磺酸基、羥基、氨基、硝基、鹵素、胺基、甲酰胺基或甲酸酯基；r10為1-19個(gè)碳原子的烴基、1-19個(gè)碳原子取代烷基、芐基或n-琥珀酰亞胺。
所述鹵代化合物r10y中y為氯、溴或碘。
當(dāng)所述雜合熒光染料的結(jié)構(gòu)式i中x為甲酰胺基時(shí)，其制備方法包括如下步驟：
向2毫摩爾化合物ii與1-5毫摩爾丙二酸二乙酯的混合物中加入15-20ml 無(wú)水乙醇，攪拌均勻后，加入0.2ml六氫吡啶，于70-80℃溫度下回流反應(yīng)1-24h；冷卻至室溫后，旋蒸除去無(wú)水乙醇，向殘余物中加入蒸餾水，使用二氯甲烷萃取，用無(wú)水mgso4干燥后，旋蒸除去二氯甲烷，得到粗產(chǎn)品中間體，真空干燥，再柱層析純化得中間體化合物iii；
將1毫摩爾化合物iii溶到5-10mlnaoh的meoh溶液中，加熱至100℃回流反應(yīng)3-5h，冷卻，過濾出殘余物，真空干燥后得化合物ia；
將0.5毫摩爾化合物ia、0.5毫摩爾相應(yīng)的胺基化合物nhr11r12溶于10毫升干燥的dmf，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)12h后，蒸干溶劑柱層析分離純化得到產(chǎn)物ie；
所述化合物ii的結(jié)構(gòu)式如下：
所述化合物iii的結(jié)構(gòu)式如下：
所述產(chǎn)物ia的結(jié)構(gòu)式如下：
所述產(chǎn)物ie的結(jié)構(gòu)式如下：
其中，上述r1、r2、r3、r4分別獨(dú)立的為氫、羥基、烴基或鹵素；r5、r6、r7、r8、r9分別獨(dú)立的為氫、甲基、甲氧基、羧基、磺酸基、羥基、氨基、硝基、鹵素、胺基、甲酰胺基或甲酸酯基；r11、r12分別獨(dú)立的為氫、1-19個(gè)碳原子烴基、1-19個(gè)碳原子取代烷基取代、芐基或馬來酰亞胺基，r11、r12不能同時(shí)為氫。
本申請(qǐng)的制備方法中使用的原料ii包括但不限于根據(jù)文獻(xiàn)“j.org.chem.1995,60,2964-2965”或文獻(xiàn)“j.org.chem.,vol.72,no.7,2007”中公開的方法制備得到，其余原料可通過但不限于市售獲得。
為達(dá)到上述第三個(gè)目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：
本發(fā)明還保護(hù)上述基于香豆素和熒光素的雜合熒光染料的應(yīng)用。
具體的，所述基于香豆素和熒光素的雜合熒光染料主要用于生物體系中的細(xì)胞器或生物大分子的共價(jià)熒光標(biāo)記；
優(yōu)選地，所述生物大分子為核酸或蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的有益效果如下：
本發(fā)明一類基于香豆素和熒光素的雜合熒光染料i，具有不對(duì)稱、非直線型共軛結(jié)構(gòu)，該類染料具有熒光素量子產(chǎn)率高的特點(diǎn)，也具有香豆素stokes位 移大的性質(zhì)，位移大可以有效避免激發(fā)光源對(duì)發(fā)射信號(hào)收集的干擾；同時(shí)，該類染料生物相容性好，低毒性，具有細(xì)胞膜通透性，可用于生物體系中的細(xì)胞器或生物大分子如蛋白質(zhì)等的共價(jià)熒光標(biāo)記，對(duì)于研究生命科學(xué)有非常重要的作用。
附圖說明
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
圖1示出制備化合物i的反應(yīng)方程式。
具體實(shí)施方式
為了更清楚地說明本發(fā)明，下面結(jié)合優(yōu)選實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說明。附圖中相似的部件以相同的附圖標(biāo)記進(jìn)行表示。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，下面所具體描述的內(nèi)容是說明性的而非限制性的，不應(yīng)以此限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
實(shí)施例1
ii-1根據(jù)文獻(xiàn)(j.org.chem.1995,60,2964-2965)由對(duì)二甲氨基苯基熒光酮制備，產(chǎn)率78％。
將782mg(2mmol)化合物ii-1與640mg(4mmol)丙二酸二乙酯混合在17毫升無(wú)水乙醇中，室溫?cái)嚢璐耆芙夂?，再加?.2ml六氫吡啶，在75℃回流反應(yīng)6h；冷卻至室溫，減壓蒸干有機(jī)溶劑，得到殘余物，加入蒸餾水，使用二氯甲烷萃取，收集有機(jī)相，使用無(wú)水mgso4干燥，減壓旋蒸除去溶劑，得到粗產(chǎn)品，柱層析(環(huán)乙烷：乙酸乙酯＝7:1)純化分離得到782mg化合物id-1，產(chǎn)率80％。esims：m/z，487.1。λabmax/nm＝505nm,λemmax/nm＝548nm,фf＝41％。
將487mg(1mmol)化合物id-1溶到naoh的meoh溶液，100℃下攪拌反應(yīng)4h，冷卻，過濾出殘余物，得到357mg化合物ia-1，產(chǎn)率77.8％。esims： m/z，459.1。λabmax/nm＝504nm,λemmax/nm＝545nm,фf＝41.4％。
實(shí)施例2
將487mg(1mmol)按實(shí)施例1的方法制備得到的化合物id-1溶于4ml濃鹽酸和4ml冰醋酸中。繼續(xù)升溫在70℃回流反應(yīng)5h。反應(yīng)液冷卻至室溫，倒入20ml冰水，用質(zhì)量百分濃度為40％的naoh溶液調(diào)節(jié)溶液的ph值到5，有大量的固體析出。繼續(xù)攪拌30min，粗產(chǎn)品過濾、水洗3次，真空干燥后用甲苯重結(jié)晶得到340mg化合物ib-1，產(chǎn)率82％。esims：m/z，415.1。λabmax/nm＝487nm,λemmax/nm＝537nm,фf＝43％。
向25ml的三口瓶中加入0.5ml三氯氧磷，氮?dú)獗Ｗo(hù)下緩慢滴加0.5ml新蒸的dmf，30min內(nèi)滴加完畢，加熱反應(yīng)液，溫度控制在50℃。待反應(yīng)液呈淡紅色，再向其中滴加2ml溶有581mg化合物ib-1(1.4mmol)的dmf溶液。反應(yīng)液在60℃下繼續(xù)反應(yīng)12h后，將其倒入20ml的冰水中，有大量的固體析出。粗產(chǎn)品經(jīng)過濾、水洗3次、真空干燥，然后用無(wú)水乙醇重結(jié)晶得到452.8mg化合物ic-1，產(chǎn)率為73％。esims：m/z，443.1。λabmax/nm＝491nm,λemmax/nm＝539nm,фf＝42.8％。
實(shí)施例3
將230mg(0.5mmol)化合物ia-1、926mg(0.5mmol)十二烷基胺溶于10毫升干燥的dmf，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)12h后，蒸干溶劑柱層析分離純化得到121mg化合物ie-1,產(chǎn)率38.6％。esims：m/z，626.3。
將230g(0.5mmol)化合物ia-1、124mg(0.5mmol)溴代十二烷溶 于10毫升干燥的dmf，氮?dú)獗Ｗo(hù)下于125℃反應(yīng)15小時(shí)后，蒸干溶劑柱層析分離得到153mg化合物id-2,產(chǎn)率48.8％。esims：m/z，627.3。
實(shí)施例4
ii-2根據(jù)文獻(xiàn)(j.org.chem.1995,60,2964-2965)由四氯熒光素制備，產(chǎn)率81％。
將992mg(2mmol)化合物ii-2與640mg(4mmol)丙二酸二乙酯混合在17毫升無(wú)水乙醇中，室溫?cái)嚢璐耆芙夂?，再加?.2ml六氫吡啶，在80℃回流反應(yīng)4h。冷卻至室溫，減壓蒸干有機(jī)溶劑，得到殘余物，加入蒸餾水，使用二氯甲烷萃取，收集有機(jī)相，使用無(wú)水mgso4干燥，減壓旋蒸除去溶劑，得到粗產(chǎn)品，柱層析(環(huán)乙烷：乙酸乙酯＝8:1)純化分離得到899mg化合物id-3，產(chǎn)率76％。esims：m/z，591.9。λabmax/nm＝503nm,λemmax/nm＝543nm,фf＝42％。
將592mg(1mmol)化合物id-3溶于4ml濃鹽酸和4ml冰醋酸中。繼續(xù)升溫至80℃回流反應(yīng)6h。反應(yīng)液冷卻至室溫，倒入20ml冰水，有大量的固體析出。繼續(xù)攪拌30min，粗產(chǎn)品過濾、水洗3次，真空干燥后用甲苯重結(jié)晶得到426.3mg化合物ib-2，產(chǎn)率82％。esims：m/z，519.9。λabmax/nm＝483nm,λemmax/nm＝531nm,фf/nm＝43.7％。
實(shí)施例5
ii-3根據(jù)文獻(xiàn)(j.org.chem.1995,60,2964-2965)由5(6)-羧基熒光素琥珀酰亞胺酯制備，產(chǎn)率76％。
將914mg(2mmol)化合物ii-3與640mg(4mmol)丙二酸二乙酯混合在17毫升無(wú)水乙醇中，室溫?cái)嚢璐耆芙夂?，再加?.2ml六氫吡啶，于73℃回流反應(yīng)4h。冷卻至室溫，減壓蒸干有機(jī)溶劑，得到殘余物，加入蒸餾水，使用二氯甲烷萃取，收集有機(jī)相，使用無(wú)水mgso4干燥，減壓旋蒸除去溶劑，得到粗產(chǎn)品，柱層析(環(huán)乙烷：乙酸乙酯＝8:1)純化分離得到840.7mg化合物id-4，產(chǎn)率76％。esims：m/z，553.1。λabmax/nm＝501nm,λemmax/nm＝540nm,фf＝40.8％。
實(shí)施例6
ii-4根據(jù)文獻(xiàn)(j.org.chem.1995,60,2964-2965)由2-羥基苯基熒光酮制備，產(chǎn)率85％。
將728mg(2mmol)化合物ii-4與640mg(4mmol)丙二酸二乙酯混合在17毫升無(wú)水乙醇中，室溫?cái)嚢璐耆芙夂?，再加?.2ml六氫吡啶，于80℃回流反應(yīng)4h。冷卻至室溫，減壓蒸干有機(jī)溶劑，得到殘余物，加入蒸餾水，使用二氯甲烷萃取，收集有機(jī)相，使用無(wú)水mgso4干燥，減壓蒸除去溶劑，得到粗產(chǎn)品，柱層析(環(huán)乙烷：乙酸乙酯＝9:1)純化分離得到772mg化合物id-5，產(chǎn)率84％。esims：m/z，460.1。λabmax/nm＝505nm,λemmax/nm＝547nm,фf＝43％。
將460mg(1mmol)化合物id-5溶到naoh的meoh溶液，100℃下攪拌反應(yīng)4h，冷卻，過濾出殘余物，得到348mg化合物ia-2，產(chǎn)率80.6％。esims：m/z，432.0。λabmax/nm＝504nm,λemmax/nm＝544nm,фf＝42.7％。
實(shí)施例7
ii-5根據(jù)文獻(xiàn)(j.org.chem.1995,60,2964-2965)由熒光素制備，產(chǎn)率89％。
ii-6根據(jù)文獻(xiàn)(j.org.chem.,vol.72,no.7,2007)由化合物ii-5制備，79.3％。
將804mg(2mmol)化合物ii-6和二氮雜二環(huán)dbu(30ul)混合在丙二酸二乙酯(1ml,6mmol)，真空下攪拌，加熱到160℃，反應(yīng)8h后，冷卻到室溫，加入二氯和鹽酸溶液，分液，水相用二氯萃取兩次，收集有機(jī)相，用無(wú)水mgso4干燥，過濾，旋蒸蒸去溶劑，得殘余物，柱層析純化粗產(chǎn)品(環(huán)乙烷：乙酸乙酯＝9:1-4:1)，得到化合物577.8mgid-6，產(chǎn)率58％。esims：m/z，498.1。λabmax/nm＝499nm,λemmax/nm＝538nm,фf＝38.7％。
將249g(0.5mmol)化合物id-6、124mg(0.5mmol)溴代十二烷溶于10毫升干燥的dmf，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)15小時(shí)后，蒸干溶劑柱層析分離得到171mg化合物id-7,產(chǎn)率51.4％。esims：m/z，666.3。
實(shí)施例8
ii-7根據(jù)文獻(xiàn)(j.org.chem.1995,60,2964-2965)由5-羧基熒光素制備，產(chǎn)率86％。
將808mg(2mmol)化合物ii-7與640mg(4mmol)丙二酸二乙酯混合在15毫升無(wú)水乙醇中，室溫?cái)嚢璐耆芙夂?，再加?.2ml六氫吡啶，于80℃回流反應(yīng)6h。冷卻至室溫，減壓蒸干有機(jī)溶劑，得到殘余物，加入蒸餾水，使用二氯甲烷萃取，收集有機(jī)相，使用無(wú)水mgso4干燥，減壓旋蒸除去溶劑，得到粗產(chǎn)品，柱層析(環(huán)乙烷：乙酸乙酯＝9:1)純化分離得到846.4mg化合物id-8，產(chǎn)率82％。esims：m/z，516.1。λabmax/nm＝503nm,λemmax/nm＝544nm,фf＝42.3％。
將279.3mg(0.33mmol)化合物id-8、76mg(0.66mmol)n-羥基丁二酰亞胺、二環(huán)己基碳二亞胺溶于7毫升干燥的dmf，氮?dú)獗Ｗo(hù)下80℃反應(yīng)2小時(shí)，冷卻、過濾，濾液蒸干溶劑柱層析純化分離得到61.6mg化合物id-9,產(chǎn) 率26.3％。esims：m/z,710.1。
實(shí)施例9
ii-8根據(jù)文獻(xiàn)(j.org.chem.1995,60,2964-2965)由9-[1-(2-甲基-4-甲氧基苯基)]-6-羥基-3h-呫噸-3-酮(其中，9-[1-(2-甲基-4-甲氧基苯基)]-6-羥基-3h-呫噸-3-酮是根據(jù)文獻(xiàn)“j.am.chem.soc.2005,127,4888-4894”制備得到)制備，產(chǎn)率86.7％。
將3.2mg(1.4mmol)氧化銀和氫氧化鈉(57mg，1.4mmol)混合在5ml水中，加熱到60℃，攪拌下加入化合物ii-8(505mg，1.4mmol)。氧化銀轉(zhuǎn)化成蓬松的金屬銀，產(chǎn)生大量熱。攪拌10分鐘，過濾，殘?jiān)y用20ml的熱水洗。濾液用鹽酸酸化，冷卻。析出沉淀，過濾，干燥。加入2ml乙酸酐和1滴硫酸，加熱反應(yīng)30分鐘，然后將反應(yīng)液倒入冰水中，攪拌混合物，隨著冰的融化，析出固體，過濾出沉淀。使用苯和乙酸重結(jié)晶得251.7mg化合物ii-9，產(chǎn)率43％。esims：m/z，418.1。
209mg化合物ii-9(0.5mmol)和0.4ml氯化亞砜(1.5mmol)混合到2ml乙醚和4ml苯，加熱回流16h。冷卻到室溫，減壓下旋蒸除去溶劑，殘余油狀物溶解在6ml乙二醇二甲醚，制得酰氯基化合物。一個(gè)50ml的3口燒瓶，配備2個(gè)50ml的滴液漏斗和1個(gè)攪拌器，冰浴下到0℃。1g再蒸餾處理的丙二酸二乙酯，3g冰，和3ml水加入燒瓶混合均勻。往反應(yīng)液中加入1-2滴茜素黃r(酸堿指示劑，ph變色范圍10.2(黃色)～12.0(紅色))的5％(v/v)乙醇水溶液，然后開始攪拌。酰氯基化合物的乙二醇二甲醚溶液轉(zhuǎn)移到滴液漏斗里，另一個(gè)滴液漏斗盛10ml50％(w/w)的氫氧化鈉水溶液。在攪拌下，緩慢滴加兩個(gè)滴液漏斗，氫氧化鈉水溶液的滴加速度以維持反應(yīng)混合液呈紅色為標(biāo)準(zhǔn)。加完酰氯基化合物后繼續(xù)攪拌25分鐘。加入20ml的水，過濾，濾液使用濃鹽酸調(diào)ph到3，冷卻到4℃。24h后，析出固體，過濾出沉淀，用苯和乙醇重結(jié)晶，得到54.3mg化合物id-10，產(chǎn)率23％。esims：m/z，472.1。λabmax/nm＝505nm,λemmax/nm＝545nm,фf＝39.6％。
實(shí)施例10
將47.2mg(0.1mmol)由實(shí)施例9制備得到的化合物id-10，1ml三氯氧磷和三乙胺(2ml)混合均勻，加熱到60℃，攪拌3h，然后把反應(yīng)混合物倒入冰水里，析出固體，室溫下攪拌混合物24h。用濃氫氧化鈉調(diào)混合物的ph到5-6，然后過濾，用水洗，干燥得38.2mg化合物id-11，產(chǎn)率78％。esims：m/z，490.1。λabmax＝506nm,λemmax＝547nm,фf＝38.7％。
實(shí)施例11
ii-10根據(jù)文獻(xiàn)(j.org.chem.1995,60,2964-2965)由2',7'-二氯熒光素制備，產(chǎn)率88.3％。
將856mg(2mmol)化合物ii-10與640mg(4mmol)丙二酸二乙酯混合在15毫升無(wú)水乙醇中，室溫?cái)嚢璐耆芙夂螅偌尤?.2ml六氫吡啶，于80℃回流反應(yīng)6h。冷卻至室溫，減壓蒸干有機(jī)溶劑，得到殘余物，加入蒸餾水，使用二氯甲烷萃取，收集有機(jī)相，使用無(wú)水mgso4干燥，減壓旋蒸除去溶劑，得到粗產(chǎn)品，柱層析(環(huán)乙烷：乙酸乙酯＝9:1)純化分離得到869.8mg化合物id-12，產(chǎn)率83％。esims：m/z，524.0。λabmax/nm＝509nm,λemmax/nm＝551nm,фf＝40.5％。
實(shí)施例12
ii-11根據(jù)文獻(xiàn)(j.org.chem.1995,60,2964-2965)由6-硝基熒光素制備，產(chǎn)率87.1％。
將810.1mg(2mmol)化合物ii-11與640mg(4mmol)丙二酸二乙酯混合在15毫升無(wú)水乙醇中，室溫?cái)嚢璐耆芙夂螅偌尤?.2ml六氫吡啶，于78℃回流反應(yīng)6h。冷卻至室溫，減壓蒸干有機(jī)溶劑，得到殘余物，加入蒸餾水，使用二氯甲烷萃取，收集有機(jī)相，使用無(wú)水mgso4干燥，減壓旋蒸除去溶劑，得到粗產(chǎn)品，柱層析(環(huán)乙烷：乙酸乙酯＝9:1)純化分離得到830.8mg化合物id-13，產(chǎn)率82.9％。esims：m/z，501.1。λabmax/nm＝503nm,λemmax/nm＝543nm,фf＝41.7％。
將化合物id-13在水溶液中用na2s和nash還原，即可得到化合物id-14，產(chǎn)率55％。esims：m/z,471.1。
實(shí)施例13
ii-12根據(jù)文獻(xiàn)(j.org.chem.1995,60,2964-2965)由磺酰熒光素制備，產(chǎn)率89.5％。
將792mg(2mmol)化合物ii-12與640mg(4mmol)丙二酸二乙酯混合在15毫升無(wú)水乙醇中，室溫?cái)嚢璐耆芙夂螅偌尤?.2ml六氫吡啶，于80℃回流反應(yīng)6h。冷卻至室溫，減壓蒸干有機(jī)溶劑，得到殘余物，加入蒸餾水，使用二氯甲烷萃取，收集有機(jī)相，使用無(wú)水mgso4干燥，減壓旋蒸除去溶劑，得到粗產(chǎn)品，柱層析(環(huán)乙烷：乙酸乙酯＝9:1)純化分離得到804.1mg化合物id-15，產(chǎn)率81.7％。esims：m/z，492.1。λabmax/nm＝501nm,λemmax/nm＝543nm,фf＝41％。
將492mg(1mmol)化合物id-15溶到naoh的meoh溶液，100℃下攪拌 反應(yīng)5h，冷卻，過濾出殘余物，得到375.8mg化合物ia-3，產(chǎn)率81％。esims：m/z，464.0。
實(shí)施例14
ii-13根據(jù)文獻(xiàn)(j.org.chem.1995,60,2964-2965)由5-馬來酰亞胺熒光素制備，產(chǎn)率85.7％。
將914mg(2mmol)化合物ii-13與640mg(4mmol)丙二酸二乙酯混合在15毫升無(wú)水乙醇中，室溫?cái)嚢璐耆芙夂螅偌尤?.2ml六氫吡啶，于80℃回流反應(yīng)6h。冷卻至室溫，減壓蒸干有機(jī)溶劑，得到殘余物，加入蒸餾水，使用二氯甲烷萃取，收集有機(jī)相，使用無(wú)水mgso4干燥，減壓旋蒸除去溶劑，得到粗產(chǎn)品，柱層析(環(huán)乙烷：乙酸乙酯＝9:1)純化分離得到891.6mg化合物id-16，產(chǎn)率80.6％。esims：m/z，553.1。
實(shí)施例15
所得基于香豆素和熒光素的雜合熒光染料在核酸的共價(jià)熒光標(biāo)記中的應(yīng)用：
化合物id-4與核苷酸氨基烯丙基-dutp偶聯(lián)：
將277mg(0.5mmol)實(shí)施例5制備得到的化合物id-4的dmf溶液加入到258mg(0.5mmol)烯丙基-dutp的緩沖溶液中(ph＝8)，室溫下攪拌20小時(shí)，濃縮后柱層析純化分離得到189.9g化合物id-17，產(chǎn)率39.8％。esims：m/z,954.1。λabmax/nm＝500nm,λemmax/nm＝538nm,фf＝40.5％。
實(shí)施例16
按照實(shí)施例12的方法，由5-硝基熒光素和丙二酸二乙酯為原料，制得化合物id-18。esims：m/z,471.1。
根據(jù)文獻(xiàn)(rscadvances.2013,3,16940)將化合物id-18與cs2反應(yīng)即可得到化合物id-19，產(chǎn)率29.7％。esims：m/z,513.1。λabmax/nm＝489nm,λemmax/nm＝544nm,фf＝40.0％。
所得基于香豆素和熒光素的雜合熒光染料在核酸的共價(jià)熒光標(biāo)記中的共價(jià)熒光標(biāo)記中的應(yīng)用：
將126g(0.2mmol)化合物id-19的dmf溶液加入到0.103g(0.2mmol)烯丙基-dutp的緩沖溶液中(ph＝8)，室溫下攪拌20小時(shí)，濃縮后柱層析純化分離得到100.6mg化合物id-20，產(chǎn)率48.9％。esims：m/z,1029.1。λabmax/nm＝487nm,λemmax/nm＝543nm,фf＝39.7％。
顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定，對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)，這里無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉，凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。