本發(fā)明涉及具有提高的亮度的熒光染料及其使用方法。

背景技術：

綴合到抗體的熒光染料通常用于免疫熒光（immunofluorescence）分析。最近二十年來，業(yè)已開發(fā)了眾多抗體、熒光染料、流式細胞儀、流式分選儀和熒光顯微鏡的變體，以確保靶細胞的特異性檢測和分離。免疫熒光法技術中的一個問題為熒光發(fā)射的檢測閥值，其可以例如通過較好的檢測器、過濾器系統(tǒng)或改性的熒光染料提高。

常規(guī)小分子熒光染料分子的局限性為其受限的亮度。因此，生物分子通常用多個染料分子標記以提高熒色物綴合物的亮度。大多數(shù)上述熒光染料分子，例如若丹明或花青，包含平面的芳族發(fā)色團，其易于疏水相互作用，產(chǎn)生具有低熒光或不具有熒光的染料-染料二聚體。因此，經(jīng)標記的生物分子的熒光強度并不與所述生物分子的熒光染料的標記程度成比例。在較高的標記程度（degree of labeling，DOLs）下，單種染料的熒光強度由于通過二聚體、三聚體或多聚體形成引起的自猝滅機理而可能甚至降低。

這些不期望的形成已經(jīng)通過將提高水溶解度的取代基加到平面的芳族染料分子中降低到某些程度。文獻中所述的合適取代基可以向染料分子賦予電荷，例如在美國專利號5,268,486和6,977,305、6,130,101和Panchuk-Voloshina等人，J. Histochem. Cytochem. 47（9），1179（1999）中描述的例如磺酸酯基團，或例如在WO2013056720中描述的磷酸酯基團。其他合適的減少二聚的取代基為大體積水溶性聚合物，例如在專利申請WO2009078970中描述的聚乙二醇，或例如在美國專利號6,913,743和7,655,217中描述的帶電荷樹狀聚合物。盡管相對于未被取代的母染料這些被取代的染料的生物分子綴合物在較高的標記程度（DOLs）下獲得較高的亮度，但是即使就未被取代的母染料而言在較高的DOL下仍然偏離了經(jīng)標記的生物分子的熒光強度和標記程度之間的線性比例。

綴合物的亮度還受生物分子上可利用的官能化位點的數(shù)目的限制，所述生物分子可以在不損失生物分子活性的情況下官能化。結果，生物分子綴合物的DOLs仍受限制，例如對于抗體（IgG），在親水標記的情況下，其通常在4-8范圍中（R. P. Haugland，Current Protocols in Cell Biology（細胞生物中的現(xiàn)有方案）（2000）16.5.1-16.5.22）。因此這些綴合物的亮度仍差于例如藻膽蛋白的綴合物，藻膽蛋白例如藻紅蛋白（PE）或別藻藍蛋白（APC）。

藻膽蛋白及其生物分子綴合物的高熒光強度歸因于藻膽蛋白內存在多個熒光團亞基。R-藻紅蛋白例如包含34個藻膽素熒光團亞基（A. N. Glazer，J. Appl. Phycol. 6，105（1994））。因此藻膽蛋白(例如PE或APC)的生物分子綴合物例如在流式細胞法中是普遍的，盡管其缺點來源于其蛋白質性質，例如對非生理學溶劑、溫度和pH值的受限的穩(wěn)定性以及其受限的光穩(wěn)定性及其通常受限的儲存壽命。另一個缺點為不同顏色的受限的可利用性，這限制單熒光試驗內的復用能力(multiplexing capability)。

已努力通過將熒光團配置到精確的超分子結構中以避免經(jīng)激發(fā)的熒光團的自猝滅來構建具有藻膽蛋白樣熒光性質的多發(fā)色團構造。Benvin等人，J. Am. Chem. Soc. 129（7），2025（2007）描述了插入到超分子DNA模板中的熒光染料。然而，這種方法的缺點為DNA骨架內的熒光團的非共價連接。染料分子遷移出DNA骨架會導致熒光信號的損失。在多顏色實驗的情況下，標記不同的DNA骨架之間的染料交換會產(chǎn)生假陽性熒光信號。在采用多種顏色的多參數(shù)實驗的情況下，可建議使用共價連接的熒光團。

用于生物分子標記的另一類明亮熒光染料為基于半導體聚合物的熒光聚合物，例如，譬如在美國專利號8,158,444、8,354,239和8,802,450以及8,362,193、8,455,613和8,575,303中所述的聚芴。當聚合物內的有效綴合長度限制于9-10個單體亞基時，這些聚合物還包含多個熒光團亞基。

通過在水溶性骨架上使常規(guī)熒光染料分子多聚來制備較明亮的熒光染料迄今未產(chǎn)生用于生物分子標記的化合物。推薦例如右旋糖苷的熒光標記為在3000MW范圍中每個右旋糖苷0.3-0.7個染料分子，在10,000MW范圍中0.5-2個染料分子，在40,000MW范圍中2-4個染料分子和在70,000MW范圍中3-6個染料分子。由于其大尺寸和大體積，這些染料多聚體在生物分子標記中不提供益處且不適用于制備具有藻膽蛋白樣熒光強度的生物分子綴合物。具有較高的標記程度的熒光標記的右旋糖苷由于染料-染料相互作用表現(xiàn)出猝滅。這發(fā)現(xiàn)用于美國專利號5,719,031中，其中右旋糖苷-熒光染料-綴合物的標記程度足夠高以提供熒光猝滅。右旋糖苷-熒光染料-綴合物的酶降解伴隨著熒光發(fā)射信號的增強，這用于定量酶消化過程。

對用于標記生物分子的改進的熒光染料仍存在相當大的需要，其提供藻膽蛋白樣熒光強度，而沒有藻膽蛋白和熒光聚合物的限制。

技術實現(xiàn)要素：

因此本發(fā)明的一個目的在于提供具有高熒光強度、低非特異性背景染色和對固定的穩(wěn)定性的熒光染料標記。

意料不到地，發(fā)現(xiàn)在支化聚醚骨架（例如多臂聚乙二醇）上多聚的熒光染料具有高熒光性而不具有可注意到的猝滅。另外，聚醚骨架似乎降低熒光染料非特異性連接的趨勢。

本發(fā)明的一方面允許定制熒光染料標記在光穩(wěn)定性和對不同環(huán)境條件例如溫度、pH和溶劑的穩(wěn)定性方面的性質。在本發(fā)明的另一方面，提供了寬范圍的不同激發(fā)和發(fā)射波長。在本發(fā)明的另一方面，保持生物分子活性，盡管高數(shù)目的熒光團亞基存在于生物分子-熒光染料綴合物中。

在本發(fā)明中，可能將高程度的熒光團標記引入到生物分子中而不具有活性損失或提高的非特異性連接，例如，在抗體的情況下，獲得大于10、優(yōu)選等于或大于15的熒光團DOL，產(chǎn)生具有藻膽蛋白-綴合物狀熒光強度和低的非特異性的背景染色的抗體熒色物綴合物。

因此，本發(fā)明的一個目的為根據(jù)通式I的熒光染料：

其中

C為包含20-200個原子的核部分；

S為相同或不同的包含1-10個碳原子的醚殘基；

n為2-500范圍的整數(shù)；

m為0-500范圍的整數(shù)；

x為2-50范圍的整數(shù)；

y為1-50范圍的整數(shù)；

R為相同或不同的殘基，其包含能夠與生物分子形成共價鍵的反應性基團；

F為相同或不同的共價連接到（S）_n的熒光團。

所述核部分C提供用于聚醚殘基（S）_n和（S）_m的多個（x+y）連接點。R包含能夠與識別細胞結構如抗原的生物分子形成共價鍵的反應性基團。

附圖說明

參考下圖描述各種例示性細節(jié)，其中：

圖1a-1e表示通過流式細胞法測量的用與以下物質綴合的CD4抗體（克隆Vit4）染色的外周血單核細胞（PBMC）的點狀圖的對比：圖1a，異硫氰酸熒光素（FITC）；圖1b，與支化PEG多聚的熒光素（PEG-FAM）；圖1c，Alexa Fluor 488（AF488）；圖1d，與支化PEG多聚的Alexa Fluor 488（PEG-AF488），或（1e）R-藻紅蛋白（PE）。

圖2表示通過流式細胞法測量的用與以下物質綴合的CD4抗體（克隆Vit4）染色的五種不同供體的T協(xié)助細胞（CD4明亮陽性）的中值熒光強度（MFI）和染色指數(shù)（SI）：FITC、在支化PEG上多聚的熒光素（PEG-FAM）、Alexa Fluor 488（AF488）、在支化PEG上多聚的Alexa Fluor 488（PEG-AF488）或PE。

圖3表示，與用綴合到常規(guī)異硫氰酸熒光素（FITC）的所述CD4抗體染色相比，針對在綴合到人CD4抗體（克隆Vit4）的在8-支鏈聚乙二醇上多聚的熒光素（PEG-FAM）而言，提高的DOL對T協(xié)助細胞的染色的作用。在所有情況下，抗體染色濃度為3μg/mL。

圖4a表示CD4-PEG-FAM染色的未固定的和甲醇固定的T協(xié)助細胞的直方圖；圖4b表示CD4-PE染色的未固定的和甲醇固定的T協(xié)助細胞的直方圖。

在所有圖中，具有PEG亞基的熒光染料為根據(jù)本發(fā)明的。

具體實施方式

根據(jù)本發(fā)明的熒光染料可以通過本領域技術人員已知并進一步在本專利申請的實施例中公開的標準化學方法制備。

例如，根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選熒光染料在以下通式II和III中表示：

。

在式（II）和（III）中，Z為F和R中的至少一個，且p為n和m中的至少一個（取決于相應的聚醚支鏈是否連接到F或R，條件是包含至少兩個F和至少一個基團R。F、R、n和m具有如業(yè)已公開的含義。

熒光團F

用于本發(fā)明的熒光團F經(jīng)由聚醚骨架連接到核部分C且可以為任何有機熒光染料分子。通常，發(fā)現(xiàn)這種熒光團在有機染料激光器中用作激光染料。業(yè)已發(fā)現(xiàn)可以綴合到生物分子的被取代形式用作流式細胞法和熒光顯微鏡法中的標記。

優(yōu)選地，熒光團F選自噸染料、若丹明染料、香豆素染料、花青染料、芘染料、嗪染料、吡啶基唑染料和吡咯亞甲基染料。

在本發(fā)明的一個變體中，熒光團F再一次被賦予水溶性的取代基取代，所述賦予水溶性的取代基選自磺酸酯、膦酸酯、磷酸酯、聚醚、磺酰胺和碳酸酯。使用具有磺酸酯取代基的熒光染料特別有利，例如由Thermo Fisher Scientific Inc.提供的Alexa Fluor族染料。每個熒光團的磺酸酯取代程度可以為2或更多，即對于若丹明染料或花青染料。與未磺化的染料相比，使用磺化的染料產(chǎn)生在聚醚骨架上多聚的熒光團的甚至更明亮的綴合物，這可以在圖2中發(fā)現(xiàn)：用在支化PEG上多聚的Alexa Fluor 488（PEG-AF488）的CD4綴合物染色的T協(xié)助細胞的亮度（平均MFI 98）幾乎為用在支化PEG上多聚的熒光素（PEG-FAM）的CD4綴合物染色的T協(xié)助細胞的亮度（平均MFI 55）的兩倍。

熒光團F可以通過本領域已知的方法連接到聚醚骨架，即通過使具有對氨基或巰基具有反應性的基團的熒光染料與具有氨基端基的支化聚醚骨架反應。

核部分C

核部分C可以為包含1-100個碳原子的任何結構，這允許x+y個聚醚殘基（S）_n和（S）_m的連接。

用于本發(fā)明的有用的核部分為多羥基化合物、多氨基化合物和多巰基化合物。優(yōu)選為多羥基化合物，例如具有四個羥基作為3-4個聚醚殘基經(jīng)由醚鍵的連接點的季戊四醇、具有六個羥基作為3-6個聚醚支鏈經(jīng)由醚鍵的連接點的二季戊四醇、具有八個羥基作為3-8個聚醚支鏈經(jīng)由醚鍵的連接點的三季戊四醇或六聚甘油。

三季戊四醇 六聚甘油

聚醚殘基S

聚醚殘基（S）_n和（S）_m由醚單體單元S組成，其每個單體亞基S各自可以包含1-10個且優(yōu)選1-4個氧原子。這些聚醚支鏈可以為均聚的或共聚的，即交替或嵌段共聚物。聚醚殘基（S）_n和（S）_m可以為直鏈或支鏈的，尤其在使用具有2個或更多個氧原子的單體單元的情況下。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，聚醚殘基包含聚乙二醇鏈，即S代表殘基-CH₂CH₂O-且n、m獨立為10-200范圍的整數(shù)。

在本發(fā)明的一個特別有用的實施方案中，市售多臂聚乙二醇（支化PEGs）用作包含核部分和聚醚支鏈的骨架。多臂聚乙二醇例如由Nanocs Inc.或NOF Corporation商業(yè)化。

反應性基團R

根據(jù)本發(fā)明的熒光染料經(jīng)由基團R連接到包含反應性基團的生物分子?；鶊FR應當能夠用官能團例如氨基和巰基經(jīng)由生物分子的反應性基團形成共價鍵。R或（S）_m/（S）_n包含能夠與相應的其他基團形成共價鍵的亞基。例如，具有氨基端基的聚醚基團（S）_m/（S）_n為市售的，其例如可以與包含羧基官能團的R基團反應。本領域技術人員在選擇合適化學中將不具有困難。包含這種反應性基團的R的例子例如為活性酯（例如N-羥基琥珀酰亞胺酯、四氟苯基酯、五氟苯基酯、磺基二氯苯基酯、亞胺酯、異硫氰酸酯、異氰酸酯）、磺酰鹵、?；u、?；B氮化物、單氯三嗪、二氯三嗪、醛、乙二醛、馬來酰亞胺、碘代乙酰胺、肼、疊氮硝基苯基、亞磷酰胺、炔、烷基疊氮化物、二烯或烯丙基。

還可能經(jīng)由反應性基團R形成共價鍵，所述反應性基團R為能夠與帶有合適的反應性基團的反應底物反應的官能團。適用于連接反應的官能團可以例如由氨基、巰基、羥基或羧基構成。

還可想到在聚醚支鏈上使用具有低反應性的另外的反應性基團R’，目的是保持熒光團分開以避免染料-染料相互作用。這些低反應性基團R’可以為氫原子、烷基、三氟烷基、芳基、鹵素基團、磺?；?、磺酸酯基團、膦酸酯基團、磺酰胺基團或其組合。上述反應性基團R中至少一種對根據(jù)本發(fā)明的熒光染料的性能來說是必要的。

熒光生物分子綴合物

本發(fā)明的另一個目的為包含經(jīng)由基團R綴合到至少一個生物分子的如已公開的一個或多個熒光染料的熒光生物分子綴合物，所述至少一個生物分子選自各自為天然的或重組體的免疫球蛋白、抗體、抗體片段、Fab、Fab'、F（ab'）₂、sdAb、scFv、di-scFv。

本發(fā)明的生物分子綴合物通過使生物分子與熒光染料的反應性基團R反應或通過使活化的生物分子與熒光染料的合適官能團R反應制備。

適用于與本發(fā)明的熒光染料綴合的生物分子可以為蛋白質、肽、糖、核酸、脂質及其組合。這些生物分子能夠連接到連接配偶體，例如分析物、細胞表面標識物、抗原等，以便標記、檢測和定量所述分析物、細胞表面標識物、抗原等。

抗體片段可以通過重組程序合成，所述重組程序包括包含這些類型的分子的共價和非共價綴合物。

在本發(fā)明的一個實施方案中，生物分子選自肽/MHC-復合物、用于細胞黏附的受體或共刺激分子、受體配體、抗原、半抗原結合劑、抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白、適體、引物和連接酶底物。優(yōu)選地，受體例如為用于細胞黏附的部分或共刺激分子且半抗原結合劑為抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白。核酸可以例如為適體、引物或連接酶底物。

用熒光團標記的支化聚醚骨架標記的生物素結合劑（例如抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素蛋白或中性抗生物素蛋白）使得能夠經(jīng)由生物素化的主要檢測分子進行敏感度檢測，原因是所述主要檢測分子的多種生物素化的乘法效應。

在本發(fā)明的一個實施方案中，生物分子為具有各自帶有4-6個熒光團基團的2-7個熒光聚醚標記的IgG抗體，導致每個抗體分子8-40個染料分子的熒光團DOLs，優(yōu)選超過10個熒光團單元的熒光團DOL，最優(yōu)選15或更多個熒光團單元的DOL。

在本發(fā)明的又一個實施方案中，生物分子綴合物包含一個或多個熒光染料，其中至少一個生物分子與各自包含1-10個(包含和10個)熒光團F的2-20個熒光染料綴合。優(yōu)選超過一個熒光染料存在于生物分子綴合物中。

工業(yè)適用性

本發(fā)明的生物分子綴合物和/或熒光染料特別可用于利用通過生物分子綴合物識別的某些抗原組的細胞檢測、計數(shù)或分離。

因此，本發(fā)明的另一個目的為通過流式細胞法和/或通過熒光顯微鏡法分析用根據(jù)本發(fā)明的熒光生物分子綴合物標記的細胞或組織的方法。因此，所述方法可以包括用所述熒光生物分子綴合物標記，并進行流式細胞法和熒光顯微鏡法中的至少一種。

在本發(fā)明的另一個實施方案中，一個或多個標記的細胞落從樣品檢出并作為靶細胞分離。通過綴合物檢出的細胞優(yōu)選通過靜電力、壓電力、機械分離或光聲裝置從樣品分離。適用于這種分離的尤其為流式分選儀，例如，基于FACS或MEMS的細胞分選儀系統(tǒng)，例如在EP14187215.0或EP14187214.3中所公開。

在本發(fā)明的另一個實施方案中，細胞或組織樣品上的生物分子綴合物的連接靶標的位置通過熒光顯微鏡法測定。熒光顯微鏡法的合適方法包括表面熒光顯微鏡法(epifluorescence microscopy)、共焦激光掃描顯微鏡法、多光子顯微鏡法、全內反射熒光（TIRF）顯微鏡法、單平面照明顯微鏡法（SPIM）和超分辨率顯微鏡法，例如，受激發(fā)射耗散（STED）顯微鏡法、隨機光學重建顯微鏡法（STORM）、光活化定位顯微鏡法（PALM）或空間調制照明（SMI）顯微鏡法。

實施例

實施例1

步驟A：在8-臂PEG上多聚的AF488（PEG-AF488）的制備

將氨基-PEG（8-臂）在pH 7下以10mg/mL的濃度溶解在0.5M PBS緩沖液中。將溶解在DMSO中的AF488, NHS酯（2mg/mL）以20倍摩爾過量加入并在室溫下在黑暗中孵育30分鐘。通過SEC在標準條件下除去游離的染料。所得的PEG-AF488具有5.7的DOL。

通過相同程序使用NHS-熒光素（NHS-FAM）獲得PEG-FAM。

步驟B：CD4抗體與PEG-AF488連接

步驟A中獲得的PEG-AF488（2.5mg/mL，在磷酸鹽緩沖鹽水中）通過加入10倍摩爾過量的SMCC并在室溫下孵育1小時來活化。并行地，CD4抗體（克隆Vit 4）通過與10mmol/L二硫蘇糖醇反應1小時還原。馬來酰亞胺活化的PEG-AF488和還原的抗體的兩者在Sephadex G25上用磷酸鹽緩沖鹽水（pH 7.2，包含2mM EDTA）進行緩沖液交換。將馬來酰亞胺活化的PEG-AF488以15倍過量加到還原的抗體中并在室溫下在黑暗中孵育1小時。反應產(chǎn)物通過SEC純化。所得的CD4-PEG-AF488具有13.2的DOL。

使用相同的方案將CD4連接到PEG-FAM。

步驟C：用綴合到在8-臂PEG上多聚的熒色物的CD4抗體對PBMC染色。

對于染色實驗，10⁶個外周血單核細胞（PBMC）各自再懸浮在100μl包含2mM EDTA和0.5% BSA的磷酸鹽緩沖鹽水中。細胞用以3μg/mL在步驟B中所獲得的相應的CD4抗體綴合物染色并在室溫下孵育10分鐘。復染用CD3-APC和碘化丙啶進行以排除死細胞。

與R-藻紅蛋白（PE）或非多聚的熒色物FITC或AF488綴合的市售CD4抗體用于對照。

細胞在室溫下在黑暗中孵育10分鐘。洗滌通過離心和再懸浮在1mL包含2mM EDTA和0.5% BSA的磷酸鹽緩沖鹽水中進行。染色細胞在MACSQuant 10分析儀上分析。圖1顯示使用以下物質的熒光強度相對于側向散射（SSC）的點狀圖例子：圖1a，異硫氰酸熒光素（FITC）；圖1b，與支化PEG多聚的熒光素（PEG-FAM）；圖1c，Alexa Fluor 488（AF488）；圖1d，與支化PEG多聚的Alexa Fluor 488（PEG-AF488），或（1e），R-藻紅蛋白（PE）并通過流式細胞法測量。

圖2表示5種供體的PBMC的中值熒光強度（MFI）和染色指數(shù)（SI）結果。

用根據(jù)本發(fā)明的熒色物標記的抗體染色的細胞的亮度至少為用母熒色物標記的抗體染色的細胞的亮度的兩倍且為用藻膽蛋白標記的抗體（CD4-PE）標記的細胞的同等水平。圖3表示，與用綴合到常規(guī)異硫氰酸熒光素（FITC）的所述CD4抗體染色相比，對于綴合到人CD4抗體（克隆Vit4）的在8-支鏈聚乙二醇上多聚的熒光素（PEG-FAM），提高的DOL對T協(xié)助細胞的染色的作用。在所有情況下，抗體染色濃度為3μg/mL。

熒色物是否還被磺化成AF488（Alexa Fluor）尤其有利。用在8-臂PEG上多聚的AF488（PEG-AF488）標記的所得的抗體綴合物的亮度約為由在8-臂PEG上多聚的熒光素制得的相應綴合物的亮度的兩倍。

實施例2：甲醇固定對染色強度的影響。

外周血單核細胞根據(jù)實施例1所述進行染色，排除碘化丙啶作為復染劑。對于甲醇固定，將1mL甲醇加到100μL細胞懸浮液中并在冰上孵育30分鐘。細胞用1mL包含2mM EDTA和0.5% BSA的磷酸鹽緩沖鹽水洗滌兩次并在其中再懸浮。在MACSQuant 10分析儀上分析染色并固定的細胞并與未固定細胞對比。圖4a和4b表示CD4-PEG-FAM染色的未固定和甲醇固定的T協(xié)助細胞（圖4a）和CD4-PE染色的未固定和甲醇固定的T協(xié)助細胞（圖4b）的直方圖。CD4-PEG-FAM的熒光強度相對于甲醇固定是穩(wěn)定的，而CD4-PE的熒光強度表明降低了5倍。

因此，本發(fā)明的熒光生物分子綴合物和/或熒光染料顯示對環(huán)境影響(例如固定)表現(xiàn)出改進的穩(wěn)定性。

雖然結合上文概述的例示性性實施描述了各種細節(jié)，在回顧以上公開內容之后，各種備選方案、修改、改變、改進和/或實質等效物，不管已知的或當前無法預料或可能當前無法預料的，可以變得顯而易見。因此，上述例示性性實施旨在說明而非限制。