本發(fā)明涉及生物樣品檢測領(lǐng)域，特別地，涉及一種雙發(fā)射比率熒光探針的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

銅離子在化學(xué)、電學(xué)、生物等眾多領(lǐng)域都具有很重要的應(yīng)用。銅的幾個尤其重要的作用包括作為很多生理反應(yīng)中酶的輔因子，以及威爾森氏病、阿茲海默癥等疾病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。然而，銅離子濃度很高時會造成嬰兒的肝損傷及兒童的肝硬化等，對人體健康具有危害性。隨著工業(yè)對銅的廣泛使用，銅含量對人類健康的影響及其檢測方法引起了人們越來越多的關(guān)注。

目前，測定銅離子的方法主要有原子吸收光譜、電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜、電化學(xué)等方法。近年來，熒光化學(xué)傳感器由于其高靈敏度、高選擇性、操作簡單等優(yōu)點日益受到人們關(guān)注。然而，大多數(shù)熒光化學(xué)傳感器隨著銅離子的加入伴隨熒光信號的單一增強或減弱，這種單一的以強度變化來檢測銅離子的方法通常會受到傳感器濃度(物質(zhì))、檢測器或光源的穩(wěn)定性、復(fù)雜樣品基質(zhì)中共存組分等一系列因素的干擾或者影響。

雙發(fā)射比率熒光通過將兩種不同的熒光類物質(zhì)結(jié)合在一種納米材料上，一個熒光發(fā)射光譜作為信號參考，另一個熒光發(fā)射光譜作為信號輸出，通過比率熒光的方法來檢測目標(biāo)物則可避免上述問題的影響。然而受限于不同種類的熒光類物質(zhì)的尋找及設(shè)計，該類探針的報道相對較少。

近年來，碳量子點由于其良好的水溶性、光穩(wěn)定性、生物相容性、低毒等優(yōu)點而備受人們矚目。碳量子點由于具備分子識別作用而被用于化學(xué)傳感器，但是將碳量子點用于比率熒光探針的構(gòu)建并進一步用于生物樣品檢測方面的研究并不是很多。與有機熒光類物質(zhì)相比，碳量子點用于比率熒光探針的構(gòu)建則不需要復(fù)雜的合成過程。Zhou等提出了碳量子點為熒光輸出信號的雙發(fā)射熒光探針檢測Cu²⁺，但是由于該碳量子點對Cu²⁺沒有識別作用，所以需要修飾一種對Cu²⁺有識別作用的有機分子來檢測，該探針制備過程復(fù)雜。

因此，構(gòu)建對Cu²⁺有選擇性識別作用的一種新型雙發(fā)射比率熒光探針并在此基礎(chǔ)上建立了選擇性好、靈敏高的可用于人體尿液及血漿中Cu²⁺的可視化新方法十分必要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供一種對Cu²⁺有選擇性識別作用的一種新型雙發(fā)射比率熒光探針的構(gòu)建方法。在此基礎(chǔ)上，通過Cu²⁺與聚乙烯亞胺碳量子點(BPEI-CQDs)發(fā)生作用導(dǎo)致其熒光淬滅的現(xiàn)象，建立了選擇性好、靈敏高的可用于人體尿液及血漿中Cu²⁺的可視化新方法，以解決技術(shù)問題。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種雙發(fā)射比率熒光探針的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

一種雙發(fā)射比率熒光探針的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

A、CdTe/CdS紅光量子點的合成：將巰基丙酸加入到氯化鎘溶液中，攪拌使混勻，將檸檬酸鈉加入到上述混合溶液中，攪拌8-15min后，用0.1mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH為11-12，隨后加入碲酸鈉和硼氫化鈉攪拌，緩慢加熱到90℃，冷卻至室溫并用乙醇離心反復(fù)洗滌，收集下層固體分散于5mL乙醇中備用，得到CdTe/CdS量子點溶液。

B、CdTe/CdS@SiO₂的合成：移取CdTe/CdS量子點溶液分散于水和乙醇混合液中(水：乙醇的質(zhì)量比＝1：4)，超聲至分散均勻，40℃下加入濃氨水，硅酸乙酯，恒溫加熱2-4小時，冷卻后離心分離，用乙醇水交替洗，得到肉粉色的CdTe/CdS@SiO₂材料自然晾干備用；

C、BPEI-CQDs的合成：將聚乙烯亞胺及檸檬酸溶解于超純水中，慢慢加熱至200℃，加熱20min后，大部分水被蒸干出現(xiàn)淡黃色，繼續(xù)加入水，重復(fù)操作8-12次，溶液顏色變?yōu)殚冱S色，即形成了BPEI-CQDs，用超純水稀釋，0.01mol/L的鹽酸過柱子純化，得到的BPEI-CQDs溶液減壓蒸餾，得到膠狀BPEI-CQDs，于真空干燥箱40℃烘干；

D、CdTe/CdS@SiO₂@BPEI-CQDs的合成：將CdTe/CdS@SiO₂溶解于乙醇中，加入BPEI-CQDs至上述溶液中，加熱至60℃，加入硅酸乙酯和異腈酸酯，60℃恒溫5-7小時，冷卻后離心，用乙醇和超純水交替洗，自然晾干，即可。

優(yōu)選的，將雙發(fā)射比率熒光探針應(yīng)用于測定生物樣品中Cu²⁺的濃度。

一種雙發(fā)射比率熒光探針應(yīng)用于測定生物樣品中Cu²⁺的濃度的方法，包括以下步驟：取待檢測液體，加入濃硝酸酸化，10000-12500rpm離心8-15min，取1.0mL上清用超純水稀釋至50mL；依次加入2.47mL磷酸鹽緩沖液，20μL探針儲備液，10μL二價銅離子儲備液于比色池中混勻，反應(yīng)2min后在熒光儀上測定該溶液熒光光譜，根據(jù)預(yù)先測定的不同濃度Cu²⁺存在時探針的工作曲線，得到Cu²⁺的濃度。

優(yōu)選的，所述的待測液體為尿液或血漿。

優(yōu)選的，當(dāng)血漿是從冰箱中取出時，應(yīng)先在室溫下解凍，再做后續(xù)處理。

優(yōu)選的，所述的磷酸鹽緩沖液的濃度為10mmol/L，pH為7.4。

優(yōu)選的，所述的探針儲備液為50mg/mL的CdTe/CdS@SiO₂@BPEI-CQDs溶液。

本構(gòu)建方法操作簡單、不需要復(fù)雜設(shè)備，所制備的雙發(fā)射熒光探針(CdTe/CdS@SiO₂@BPEI-CQDs)在苛刻條件下穩(wěn)定性高；所建立的測定人體尿液中和血漿中微量Cu²⁺的方法選擇性好、靈敏度高、可視化。

附圖說明

圖1：CdTe/CdS@SiO₂@BPEI-CQDs雙發(fā)射比率熒光探針對Cu²⁺的檢測原理圖。

圖2：CdTe/CdS@SiO₂(A)及CdTe/CdS@SiO₂@BPEI-CQDs(B)的透射電鏡圖。

圖3：CdTe/CdS@SiO₂@BPEI-CQDs納米熒光探針的XPS圖(A)，C1s(B)，N1s(C)，O1s(D)的高分辨XPS圖。

圖4：CdTe/CdS(右上線),CdTe/CdS@SiO₂(右中線),及雙發(fā)射硅納米顆粒(右下線)的熒光發(fā)射光譜圖。

圖5：BPEI-CQDs(a),CdTe/CdS@SiO₂(b),CdTe/CdS@SiO₂@BPEI-CQDs(c)的紅外光譜圖。

圖6：pH值對淬滅效率的影響圖

圖7：NaCl濃度(a)、365nm光照時間(b)對F₄₅₀/F₆₅₀比值的影響圖。

圖8：金屬離子(a)、氨基酸(b)對F₄₅₀/F₆₅₀比值的影響圖(灰色為60μM Cu²⁺存在時)。

圖9：不同濃度Cu²⁺存在時探針的熒光譜圖(a)，工作曲線圖(b)，對應(yīng)于(b)圖的探針溶液的顏色變化圖(c)。

具體實施方式

實施例1

一種雙發(fā)射比率熒光探針的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

A.CdTe/CdS紅光量子點的合成

74μL巰基丙酸加入至100mL的氯化鎘溶液中(0.5mmol)，攪拌使混勻。稱取20mg檸檬酸鈉加入到上述混合溶液中。攪拌10min后，用0.1mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH為11.2，隨后加入4.4mg碲酸鈉及20mg硼氫化鈉攪拌。緩慢加熱到90℃，加熱時間不同可以得到不同發(fā)射波長(475-810nm)的CdTe/CdS量子點，通過控制反應(yīng)時間反應(yīng)到所需波長后，冷卻至室溫并用乙醇離心反復(fù)洗滌，收集下層固體分散于5mL乙醇中備用；

B.CdTe/CdS@SiO₂的合成

移取2mL CdTe/CdS量子點溶液分散于100mL水和乙醇混合液中(水：乙醇的質(zhì)量比＝1：4)，超聲至分散均勻，40℃下加入4.6mL濃氨水，460μL硅酸乙酯，恒溫加熱3小時，冷卻后離心分離，用乙醇水交替洗，得到肉粉色的CdTe/CdS@SiO₂材料自然晾干備用；

C.BPEI-CQDs的合成

將0.5g聚乙烯亞胺及1.0g檸檬酸溶解于10mL超純水中，于25mL燒杯中慢慢加熱至接近200℃，加熱20min后，大部分水被蒸干出現(xiàn)淡黃色，繼續(xù)加入1mL水，重復(fù)操作10次，溶液顏色變?yōu)殚冱S色，即形成了BPEI-CQDs，用超純水稀釋至10mL，0.01mol/L的鹽酸過柱子純化，得到的BPEI-CQDs溶液減壓蒸餾，得到膠狀BPEI-CQDs于真空干燥箱40℃烘干；

D.CdTe/CdS@SiO₂@BPEI-CQDs的合成

將0.12g CdTe/CdS@SiO₂溶解于120mL乙醇中，加入25.5mg BPEI-CQDs至上述溶液中，加熱至60℃，加入225μL硅酸乙酯及225μL異腈酸酯，60℃恒溫6小時，冷卻后離心，用乙醇和超純水交替洗，自然晾干。

實施例2

一種雙發(fā)射比率熒光探針的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

A.CdTe/CdS紅光量子點的合成

74μL巰基丙酸加入至100mL的氯化鎘溶液中(0.5mmol)，攪拌使混勻。稱取20mg檸檬酸鈉加入到上述混合溶液中。攪拌15min后，用0.1mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH為11.2，隨后加入4.4mg碲酸鈉及20mg硼氫化鈉攪拌。緩慢加熱到90℃，加熱時間不同可以得到不同發(fā)射波長(475-810nm)的CdTe/CdS量子點，通過控制反應(yīng)時間反應(yīng)到所需波長后，冷卻至室溫并用乙醇離心反復(fù)洗滌，收集下層固體分散于5mL乙醇中備用；

B.CdTe/CdS@SiO₂的合成

移取2mL CdTe/CdS量子點溶液分散于100mL水和乙醇混合液中(水：乙醇的質(zhì)量比＝1：4)，超聲至分散均勻，40℃下加入4.6mL濃氨水，460μL硅酸乙酯，恒溫加熱2小時，冷卻后離心分離，用乙醇水交替洗，得到肉粉色的CdTe/CdS@SiO₂材料自然晾干備用；

C.BPEI-CQDs的合成

將0.5g聚乙烯亞胺及1.0g檸檬酸溶解于10mL超純水中，于25mL燒杯中慢慢加熱至接近200℃，加熱20min后，大部分水被蒸干出現(xiàn)淡黃色，繼續(xù)加入1mL水，重復(fù)操作12次，溶液顏色變?yōu)殚冱S色，即形成了BPEI-CQDs，用超純水稀釋至10mL，0.01mol/L的鹽酸過柱子純化，得到的BPEI-CQDs溶液減壓蒸餾，得到膠狀BPEI-CQDs于真空干燥箱40℃烘干；

D.CdTe/CdS@SiO₂@BPEI-CQDs的合成

將0.12g CdTe/CdS@SiO₂溶解于120mL乙醇中，加入25.5mg BPEI-CQDs至上述溶液中，加熱至60℃，加入225μL硅酸乙酯及225μL異腈酸酯，60℃恒溫5小時，冷卻后離心，用乙醇和超純水交替洗，自然晾干。

實施例3

一種雙發(fā)射比率熒光探針的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

A.CdTe/CdS紅光量子點的合成

74μL巰基丙酸加入至100mL的氯化鎘溶液中(0.5mmol)，攪拌使混勻。稱取20mg檸檬酸鈉加入到上述混合溶液中。攪拌8min后，用0.1mol/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)溶液pH為11.2，隨后加入4.4mg碲酸鈉及20mg硼氫化鈉攪拌。緩慢加熱到90℃，加熱時間不同可以得到不同發(fā)射波長(475-810nm)的CdTe/CdS量子點，通過控制反應(yīng)時間反應(yīng)到所需波長后，冷卻至室溫并用乙醇離心反復(fù)洗滌，收集下層固體分散于5mL乙醇中備用；

B.CdTe/CdS@SiO₂的合成

移取2mL CdTe/CdS量子點溶液分散于100mL水和乙醇混合液中(水：乙醇的質(zhì)量比＝1：4)，超聲至分散均勻，40℃下加入4.6mL濃氨水，460μL硅酸乙酯，恒溫加熱4小時，冷卻后離心分離，用乙醇水交替洗，得到肉粉色的CdTe/CdS@SiO₂材料自然晾干備用；

C.BPEI-CQDs的合成

將0.5g聚乙烯亞胺及1.0g檸檬酸溶解于10mL超純水中，于25mL燒杯中慢慢加熱至接近200℃，加熱20min后，大部分水被蒸干出現(xiàn)淡黃色，繼續(xù)加入1mL水，重復(fù)操作8次，溶液顏色變?yōu)殚冱S色，即形成了BPEI-CQDs，用超純水稀釋至10mL，0.01mol/L的鹽酸過柱子純化，得到的BPEI-CQDs溶液減壓蒸餾，得到膠狀BPEI-CQDs于真空干燥箱40℃烘干；

D.CdTe/CdS@SiO₂@BPEI-CQDs的合成

將0.12g CdTe/CdS@SiO₂溶解于120mL乙醇中，加入25.5mg BPEI-CQDs至上述溶液中，加熱至60℃，加入225μL硅酸乙酯及225μL異腈酸酯，60℃恒溫7小時，冷卻后離心，用乙醇和超純水交替洗，自然晾干。

用TEM、XPS、熒光發(fā)射光譜、FT-IR等手段對其結(jié)構(gòu)和形貌進行了表征。

由圖2-5可以知道，BPEI-CQDs碳量子點被成功修飾在二氧化硅球上。

實施例4

取尿液1.0mL，加入0.1mL濃HNO₃酸化，12000rpm離心10min，取1.0mL上清用超純水稀釋至50mL。

從冰箱中取出血漿室溫下解凍，按上述方法酸化，去蛋白處理后稀釋。

依次加入2.47mL磷酸鹽緩沖(PBS，10mM，pH＝7.4)，20μL探針儲備液(CdTe/CdS@SiO₂@BPEI-CQDs，50mg/mL)，10μL不同濃度的二價銅離子儲備液于比色池中混勻。反應(yīng)2min后在熒光儀上測定該溶液熒光光譜，根據(jù)預(yù)先測定的不同濃度Cu²⁺存在時探針的工作曲線，得到Cu²⁺的濃度。

本發(fā)明中進一步考察了不同pH對該雙發(fā)射熒光探針對Cu²⁺淬滅效率的影響。當(dāng)溶液pH在4-6之間時，該體系熒光強度較強，當(dāng)體系pH值過高或過低時，熒光強度均有所降低(圖6)。圖中灰色柱狀表明，酸性條件下(pH≤3.0)Cu²⁺對熒光探針的淬滅作用很小。在堿性溶液中(pH＞7.0)淬滅效率仍然不高。pH4-7環(huán)境下，淬滅效率較高，且當(dāng)溶液pH在5-7之間，該雙發(fā)射熒光探針具有較好的穩(wěn)定性。綜合考慮pH對該探針檢測Cu²⁺淬滅效率的影響及將該探針用于生物樣品的檢測，選擇pH為7.4的PBS溶液作為緩沖。

圖7為NaCl濃度(a)、365nm光照時間(b)對F450/F650比值的影響；

圖8為金屬離子(a)、氨基酸(b)對F₄₅₀/F₆₅₀比值的影響(灰色為60μM Cu²⁺存在時)；

圖9為不同濃度Cu²⁺存在時探針的熒光譜圖(a)，工作曲線(b)，對應(yīng)于(b)圖的探針溶液的顏色變化圖(c)。

表1和表2為實施例4的分析

表1尿液分析結(jié)果

表2血漿分析結(jié)果

以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。