本發(fā)明涉及一種微球組合物的制備方法，尤其涉及一種制備三色編碼微球組合物的方法。

背景技術(shù)：

現(xiàn)有的基于懸浮陣列芯片的多指標(biāo)檢測(cè)系統(tǒng)采用含有編碼信息的微球?qū)Φ鞍踪|(zhì)、核酸和細(xì)胞因子等同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析，廣泛應(yīng)用在生命科學(xué)研究、疾病篩查、藥物篩選以及臨床診斷中。懸浮陣列技術(shù)的核心部件是具有獨(dú)特編碼信息的微球，特別可以通過有機(jī)熒光染料、拉曼分子標(biāo)簽、量子點(diǎn)、聚合物量子點(diǎn)等光學(xué)材料對(duì)微球進(jìn)行光學(xué)編碼。稀土是指化學(xué)元素周期表中鑭系元素以及與鑭系元素密切相關(guān)的元素—釔和鈧的統(tǒng)稱。稀土元素一般都可以產(chǎn)生不同特征光譜的熒光。特別是稀土配合物具有極窄的發(fā)射峰(稀土離子發(fā)射光譜半峰寬一般僅為10-20nm)、較大的Stokes位移、具有良好的發(fā)光色純度、較強(qiáng)的抗光漂白能力和熒光壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)可作為理想的光學(xué)編碼材料。Zhu等(Chemical Communications,2014,50(90):14041-14044)提出了主客體結(jié)構(gòu)的單色編碼微球制備策略，以磁性微球(5.8μm)作為主體母球，有機(jī)染料摻雜的二氧化硅納米顆粒(200nm)作為客體子球，將表面含有豐富氨基的子球和羧基功能化的母球通過化學(xué)鍵連接在一起形成具有主客體結(jié)構(gòu)的編碼微球。在此基礎(chǔ)上，申請(qǐng)?zhí)枮?01410247053.3，名稱為“一種載體顆粒及其制備方法”的中國(guó)專利申請(qǐng)公開了一種基于主客體結(jié)構(gòu)的編碼微球制備方法。其將不同的熒光元素分別裝載在主體微球和客體納米球中，利用單色的熒光子球和單色的熒光母球調(diào)節(jié)熒光強(qiáng)度得到幾十重以上的可區(qū)分的雙色編碼的微球。這種主客體結(jié)構(gòu)的編碼微球可以有效避免熒光元素分子之間的相互干擾，在提高編碼的精準(zhǔn)性的同時(shí)進(jìn)一步擴(kuò)大編碼的容量。然而由于采用了有機(jī)染料或者量子點(diǎn)作為熒光編碼元素，他們的熒光光譜半峰寬較大(通常有機(jī)染料的半峰寬高達(dá)60nm，量子點(diǎn)至少也有30nm)，因此如采用單色激光激發(fā)多色熒光編碼時(shí)，要么存在有機(jī)熒光分子選擇受限，要么存在采用量子點(diǎn)時(shí)由于半峰寬相對(duì)較寬而較難實(shí)現(xiàn)多色、高容量精準(zhǔn)編碼的困境。

因此，現(xiàn)有的編碼微球的主要問題有：

1、傳統(tǒng)的雙色熒光染料基的編碼微球由于有機(jī)熒光染料同時(shí)裝載在微球內(nèi)部，且雙色熒光素的熒光發(fā)射峰較寬，兩種熒光物質(zhì)之間產(chǎn)生干擾，實(shí)際的編碼精準(zhǔn)性受限。

2、多色(三色或三色以上)有機(jī)熒光染料基編碼微球由于熒光分子各自最適宜的激發(fā)光譜不同，要想獲得理想的編碼精度與較高的編碼容量，往往不得不采用多色激光激發(fā)，檢測(cè)裝備復(fù)雜，成本高，不利于設(shè)備的小型化；

3、多色量子點(diǎn)編碼微球雖然可以采用單色激光激發(fā)多色量子點(diǎn)，但由于量子點(diǎn)的熒光發(fā)射半峰寬較大，不同熒光顏色的量子點(diǎn)熒光光譜相互干擾，采用常用的流式細(xì)胞術(shù)的解碼檢測(cè)系統(tǒng)較難實(shí)現(xiàn)高精度的多色解碼。

4、現(xiàn)有的主客體結(jié)構(gòu)的編碼微球編碼熒光元素為有機(jī)染料或者量子點(diǎn)進(jìn)行編碼，若用單色激光激發(fā)進(jìn)行編碼，亦存在熒光編碼顏色受限的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明提供了一種新的制備三色編碼微球組合物的方法，要解決的技術(shù)問題是實(shí)現(xiàn)單色激光同時(shí)激發(fā)三種顏色熒光進(jìn)行多色編碼。

為解決上述問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種制備三色編碼微球組合物的方法，所述方法包括如下步驟：

1)制備子球；

2)制備母球；

3)將子球和母球組裝成微球組合物；

其中，所述微球組合物至少裝載有三種熒光物質(zhì)，所述的三種熒光物質(zhì)中的至少其中之一為稀土配合物。

優(yōu)選地，所述的三種熒光物質(zhì)的其中之一為稀土配合物，另外兩種為量子點(diǎn)熒光物質(zhì)。

優(yōu)選地，所述兩種量子點(diǎn)的中心發(fā)射波長(zhǎng)至少相差30nm。

優(yōu)選地，所述的稀土配合物為銪稀土配合物。

優(yōu)選地，所述微球組合物為以下其中之一：

a)所述子球?yàn)榉菬晒庋趸杌蚓酆衔镂⑶?，所述母球?yàn)閮?nèi)部共同裝載銪稀土配合物和兩種不同中心發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)的微球；

b)所述子球?yàn)殇B稀土配合物子球，所述母球?yàn)閮煞N不同中心發(fā)射波長(zhǎng)的雙色量子點(diǎn)母球；

c)所述子球?yàn)閱紊孔狱c(diǎn)子球，所述母球?yàn)榱硪环N中心發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)和銪稀土配合物共同摻雜的母球；

d)所述子球?yàn)閱紊孔狱c(diǎn)和銪稀土配合物子球，所述母球?yàn)榱硪环N中心發(fā)射波長(zhǎng)的量子點(diǎn)母球；

e)所述子球?yàn)閮煞N不同中心發(fā)射波長(zhǎng)的雙色量子點(diǎn)子球，所述母球?yàn)閱紊B稀土配合物母球；

f)所述子球?yàn)楸砻娼M裝有兩種不同中心發(fā)射波長(zhǎng)的熒光量子點(diǎn)的銪摻雜的介孔氧化硅微球，所述母球?yàn)榉菬晒饩酆衔镂⑶颉?/p>

優(yōu)選地，所述子球和母球通過共價(jià)鍵結(jié)合組裝成微球組合物。

優(yōu)選地，所述子球的表面修飾有羥基、巰基、氨基或者羧基中的一種，所述母球的表面修飾有羧基、羥基、氨基或巰基中的一種。

優(yōu)選地，所述子球和母球通過表面靜電吸附組裝成微球組合物。

優(yōu)選地，所述母球裝載有磁性納米顆粒。

優(yōu)選地，所述子球的顆粒粒徑為30-500nm，所述母球的顆粒粒徑為0.5-20μm。

本發(fā)明在主客體結(jié)構(gòu)編碼微球制備策略基礎(chǔ)上，采用摻雜有發(fā)射峰在612nm左右的Eu稀土配合物的微球作為熒光子球或熒光母球，聯(lián)合裝載有發(fā)射峰在500nm和560nm左右的雙色量子點(diǎn)為熒光母球或熒光子球，以流式細(xì)胞術(shù)作為解碼方式，實(shí)現(xiàn)單色激光(355nm、375nm或者405nm均可)激發(fā)三種顏色熒光進(jìn)行多色編碼，極大程度上擴(kuò)大了編碼容量。

本發(fā)明的有益效果為：

1、引入稀土配合物作為熒光物質(zhì)，在單束激光激發(fā)下即可以實(shí)現(xiàn)三色熒光編碼微球的制備，較傳統(tǒng)的雙色編碼微球增加了編碼的維度，進(jìn)一步提高了編碼的數(shù)量。

2、引入的稀土配合物的發(fā)射峰極窄，提高了基于流式細(xì)胞術(shù)原理的解碼的靈敏度和精準(zhǔn)性。

3、現(xiàn)有的三色或者多色的熒光編碼微球往往需要采用多激光激發(fā)，而基于量子點(diǎn)和稀土配合物的三色微球可以采用同種激光激發(fā)，這對(duì)于設(shè)備的小型化智能化具有實(shí)際意義，進(jìn)一步降低設(shè)備的制造以及應(yīng)用成本。

以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的構(gòu)思、具體結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進(jìn)一步說明，以充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例制備的三色編碼微球組合物的照片。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例制備的三色編碼微球組合物的三種熒光物質(zhì)的熒光發(fā)射光譜的示意圖。

具體實(shí)施方式

本文所使用的術(shù)語(yǔ)“編碼微球”是指具有可識(shí)別特性從而被熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀解碼的顆粒。

在以下實(shí)施例中，編碼熒光微球的制備主要由熒光母球與熒光子球兩個(gè)結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成，母球與子球分別通過各自表面的功能基團(tuán)間化學(xué)共價(jià)反應(yīng)或者通過靜電吸附形成具有類似樹莓結(jié)構(gòu)的組裝微球，如圖1所示。由圖1可以看出磁性聚合物母球表面連接著致密的子球，表面形貌規(guī)整，平均粒徑約為6μm(以下實(shí)施例中微球組合物裝載兩種中心發(fā)射波長(zhǎng)絕對(duì)值相差不低于30nm的量子點(diǎn)，以及與兩種量子點(diǎn)中心發(fā)射波長(zhǎng)相差不低于15nm的稀土配合物)。

一、子球的制備

實(shí)施例1第一類型子球的制備

本實(shí)施例采用表面修飾有氨基，顆粒粒徑為110nm的非熒光介孔氧化硅納米顆粒。作為該具體實(shí)施的變形，子球也可以是聚合物顆粒；顆粒粒徑也可以是30-500nm；子球表面也可以修飾羧基或其它功能基團(tuán)。

實(shí)施例2第二類型子球的制備

在該具體實(shí)施例，內(nèi)部裝載有中心發(fā)射波長(zhǎng)612nm的銪(Eu³⁺)稀土配合物介孔氧化硅顆粒作為單色的子球。介孔氧化硅粒徑為110nm，且修飾有氨基(作為該具體實(shí)施的變形，子球表面也可以修飾羥基、巰基或者羧基等功能基團(tuán))，并選用量子產(chǎn)率高、熒光穩(wěn)定以及可用可見光激發(fā)的銥金屬配體敏化Eu³⁺，典型制備方法如下：

步驟1：Ir(dfppy)₂(pic-OH)的制備(具體也可參見Biomaterials,2014,35(22):5830-5839)

首先2-乙氧基乙醇和水以3:1的比例(總體積為120ml，回流溫度120℃)混合在250ml燒瓶中，加入IrCl₃·3H₂O(1mmol，355.3mg)和2-(2,4-二氟苯基)吡啶(2.2mmol，429.2mg)?；旌衔锛訜峄亓?4h。冷卻至室溫后，將固態(tài)沉淀物過濾干燥得到原始的Ir的氯橋接的二聚體[Ir₂(dfppy)₄Cl₂]。將混合物[Ir₂(dfppy)₄Cl₂](0.2mmol，243.2mg，1216g/mol)和3-羥基-2-羧基吡啶(pic-OH，0.44mmol，62.46mg)和K₂CO₃(0.6mmol，83mg)加入到2-乙氧基乙醇(體積為120ml，2-乙氧基乙醇和水3:1)中，然后將懸浮液150℃回流24h。冷卻至室溫后，蒸餾去除溶劑得到固體產(chǎn)物，用二氯甲烷/乙醚(體積比4:1)色譜層析得到黃色固態(tài)產(chǎn)物Ir(dfppy)₂(pic-OH)。蒸餾去除溶劑，干燥得到產(chǎn)物。其制備流程如下所示：

步驟2：介孔納米顆粒MSN的制備(具體也可參見ACS applied materials&interfaces 6.21(2014):19064-19074.)

用量筒量取150ml的水和18ml異丙醇混合在250ml的三頸圓底燒瓶中，加入0.45g十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)，將反應(yīng)體系在60℃油浴加熱并攪拌。取2.83ml氨水加入反應(yīng)體系作為催化劑，再將1.5ml的正硅酸四乙酯(TEOS)逐滴加入燒瓶中，反應(yīng)體系變?yōu)槿榘咨磻?yīng)維持在60℃油浴加熱攪拌(450rpm)。停止攪拌，將合成的膠體懸浮液在60℃老化24h。使用硝酸銨去除CTAB模板。將顆粒分散在乙醇中加入硝酸銨超聲2h，重復(fù)3-4次徹底除去CTAB，將其分散在30ml乙醇中，測(cè)試其固含量。

步驟3：Ir-Eu-MSN顆粒的制備

15ml乙醇和Ir(dfppy)₂(pic-OH)(5.4mg，7.5μmol，713.7g/mol，可通過調(diào)節(jié)其加入量改變介孔顆粒熒光強(qiáng)度)加入到50ml燒瓶中，回流30min(80℃)。將80mg的MSN顆粒分散在2ml乙醇中加入反應(yīng)體系攪拌反應(yīng)30min。將溶解有EuCl₃·6H₂O(5.0mg，可通過調(diào)節(jié)其加入量改變介孔顆粒熒光強(qiáng)度)的1ml乙醇加入到反應(yīng)體系攪拌30min。最后用NaOH(0.1M)調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液pH＝6-7(大約400μl)，反應(yīng)12h。反應(yīng)結(jié)束離心分離產(chǎn)物。用乙醇洗滌3次。10000rpm離心10min，分散在8ml乙醇中。

步驟4：Ir-Eu-MSN顆粒的聚乙烯亞胺(PEI)修飾

20mg Ir-Eu-MSN顆粒分散于7ml水中，40mgPEI溶于1ml水加入顆粒中，反應(yīng)30min，10000rpm水洗三次分散在水中。

實(shí)施例3第三類型子球的制備

在該具體實(shí)施例中，表面組裝有中心發(fā)射波長(zhǎng)為500nm熒光量子點(diǎn)的微球作為單色子球。微球粒徑為110nm，且修飾有氨基(作為該具體實(shí)施的變形，子球表面也可以修飾羥基等功能基團(tuán))；子球表面組裝的量子點(diǎn)選擇粒徑為1-10nm的CdSe@ZnS納米晶(作為該具體實(shí)施的變形，也可是相同發(fā)射波長(zhǎng)的其他納米晶)。制備方法為現(xiàn)有技術(shù)，在此不再詳述。

實(shí)施例4第四類型子球的制備

在該具體實(shí)施例中，表面組裝有中心發(fā)射波長(zhǎng)為560nm熒光量子點(diǎn)的微球作為單色子球。微球粒徑為110nm，且修飾有氨基(作為該具體實(shí)施的變形，子球表面也可以修飾羥基等功能基團(tuán))；表面組裝的量子點(diǎn)選擇粒徑為1-10nm的CdSe@ZnS納米晶(作為該具體實(shí)施的變形，也可是相同發(fā)射波長(zhǎng)的其他納米晶)。制備方法為現(xiàn)有技術(shù)，在此不再詳述。

實(shí)施例5第五類型子球的制備

在該具體實(shí)施例中，表面組裝有中心發(fā)射波長(zhǎng)為500nm熒光量子點(diǎn)的銪摻雜介孔氧化硅微球作為雙色子球，銪摻雜介孔氧化硅微球制備方法如類型二中所述。介孔氧化硅粒徑為110nm，且修飾有氨基(作為該具體實(shí)施的變形，子球表面也可以修飾羥基等功能基團(tuán))；表面組裝的量子點(diǎn)選擇粒徑為1-10nm的CdSe@ZnS納米晶(作為該具體實(shí)施的變形，也可是相同發(fā)射波長(zhǎng)的其他納米晶)。制備方法為現(xiàn)有技術(shù)，在此不再詳述。

實(shí)施例6第六類型子球的制備

在該具體實(shí)施例中，表面組裝有中心發(fā)射波長(zhǎng)為560nm熒光量子點(diǎn)的銪摻雜介孔氧化硅微球作為雙色子球，銪摻雜介孔氧化硅微球制備方法如類型二中所述。介孔氧化硅粒徑為110nm，且修飾有氨基(作為該具體實(shí)施的變形，子球表面也可以修飾羥基等功能基團(tuán))；表面組裝的量子點(diǎn)選擇粒徑為1-10nm的CdSe@ZnS納米晶(作為該具體實(shí)施的變形，也可是相同發(fā)射波長(zhǎng)的其他納米晶)。

實(shí)施例7第七類型子球的制備

在該具體實(shí)施例中，表面組裝有中心發(fā)射波長(zhǎng)為500nm和560nm熒光量子點(diǎn)的介孔氧化硅微球作為雙色子球。氧化硅粒徑為110nm，且修飾有氨基(作為該具體實(shí)施的變形，子球表面也可以修飾羥基等功能基團(tuán))；表面組裝的量子點(diǎn)選擇粒徑為1-10nm的CdSe@ZnS納米晶(作為該具體實(shí)施的變形，也可是相同發(fā)射波長(zhǎng)的其他納米晶)。

實(shí)施例8第八類型子球的制備

在該具體實(shí)施例中，表面組裝有中心發(fā)射波長(zhǎng)為500nm和560nm熒光量子點(diǎn)的銪摻雜的介孔氧化硅微球作為三色子球。銪摻雜的介孔氧化硅微球制備方法如類型二中所述。介孔氧化硅粒徑為110nm，且修飾有氨基(作為該具體實(shí)施的變形，子球表面也可以修飾羥基等功能基團(tuán))；表面組裝的量子點(diǎn)選擇粒徑為1-10nm的CdSe@ZnS納米晶(作為該具體實(shí)施的變形，也可是相同發(fā)射波長(zhǎng)的其他納米晶)。

二、母球的制備

實(shí)施例9第一類型母球的制備

在該具體實(shí)施例中，母球用非熒光微球，具體母球選用粒徑為0.5-20μm(更優(yōu)選為5-6μm)的聚合物微球，微球表面具有羧基(作為該具體實(shí)施例的變形，微球表面也可以具有羥基、氨基或巰基等功能基團(tuán))。聚合物微球裝載有磁性納米顆粒。制備方法為現(xiàn)有技術(shù)，在此不再詳述。

實(shí)施例10第二類型母球的制備

本實(shí)施例采用內(nèi)部組裝有中心發(fā)射波長(zhǎng)500nm熒光量子點(diǎn)的聚合物磁性微球作為母球(作為該具體實(shí)施例的變形，也可以采用表面裝載有中心發(fā)射波長(zhǎng)500nm熒光量子點(diǎn)的聚合物介孔微球)，表面功能基團(tuán)為羧基。具體制備方式參照專利201410247053.3所述，典型制備步驟如下：

稱量6.85mg聚苯乙烯微球白色粉末，倒入2ml離管；稱取聚(苯乙烯-co-馬來酸酐)(PSMA，M_w＝1700)，分散于一定量的氯仿，超聲，2ml離心管保存；配制堿液：吸取200ul 1M的氫氧化鈉水溶液，溶解于4ml超純水，10ml玻璃瓶保存；在氯仿中預(yù)先混合量子點(diǎn)，向QDs中加入PSMA氯仿分散液，超聲分散；再將QDs、PSMA分散液轉(zhuǎn)入稱好的6.85mgMPS中，槍頭小心攪拌將白色粉末浸潤(rùn)于氯仿分散液中，得到分散液，超聲15min；向黃色MPS、QDs、PSMA分散液中加入500ul事先配好的NaOH堿液，超聲分散使其反應(yīng)，得反應(yīng)混合液,超聲10min；反應(yīng)混合液離心2min，13000rpm，吸取上清并吸取氯仿(測(cè)熒光)，保留在UV(365nm)下看其熒光強(qiáng)度；超純水1ml洗滌3次，離心2min，13000rpm，最后分散于1ml水，即得QDs@MPS，測(cè)定分散液熒光強(qiáng)度，避光保存。

實(shí)施例11第三類型母球的制備

本實(shí)施例采用內(nèi)部組裝有中心發(fā)射波長(zhǎng)560nm熒光量子點(diǎn)的聚合物磁性微球作為母球(作為該具體實(shí)施例的變形，也可以采用表面裝載有中心發(fā)射波長(zhǎng)560nm熒光量子點(diǎn)的聚合物介孔微球)，表面功能基團(tuán)為羧基。具體制備方法如類型二母球所述。

實(shí)施例12第四類型母球的制備

在該具體實(shí)施中，通過溶脹法制備含有Eu³⁺稀土配合物的聚合物微球，稀土配合物制備方法參考子球類型二(采用同樣的稀土配體)，微球采用羧基修飾的聚合物磁性微球。

實(shí)施例13第五類型母球的制備

本實(shí)施例采用內(nèi)部裝載Eu³⁺稀土配合物，內(nèi)部或表面裝載中心發(fā)射波長(zhǎng)500nm的雙色熒光母球。通過溶脹等方法制備含有Eu³⁺稀土配合物的聚合物微球，稀土配合物制備方法參考子球類型二(采用同樣的稀土配體)。裝載中心發(fā)射波長(zhǎng)500nm熒光量子點(diǎn)，制備方法如母球類型二。微球采用表面功能基團(tuán)為羧基的聚合物磁性微球。

實(shí)施例14第六類型母球的制備

本實(shí)施例采用內(nèi)部裝載Eu³⁺稀土配合物，內(nèi)部或表面裝載中心發(fā)射波長(zhǎng)560nm的雙色熒光母球。通過溶脹等方法制備含有Eu³⁺稀土配合物的聚合物微球，稀土配合物制備方法參考子球類型二(采用同樣的稀土配體)。裝載中心發(fā)射波長(zhǎng)560nm熒光量子點(diǎn)，制備方法如母球類型二。微球采用表面功能基團(tuán)為羧基的聚合物磁性微球。

實(shí)施例15第七類型母球的制備

本實(shí)施例采用內(nèi)部裝載有中心發(fā)射波長(zhǎng)500nm和560nm熒光量子點(diǎn)的聚合物介孔微球或者表面組裝有中心發(fā)射波長(zhǎng)500nm和560nm熒光量子點(diǎn)的聚合物磁性微球作為母球，制備方法如母球類型二。微球采用表面功能基團(tuán)為羧基的聚合物磁性微球。

實(shí)施例16第八類型母球的制備

本實(shí)施例采用內(nèi)部裝載Eu³⁺稀土配合物，內(nèi)部或表面裝載中心發(fā)射波長(zhǎng)500nm和560nm的三色熒光母球。通過溶脹法制備含有Eu³⁺稀土配合物的聚合物微球，稀土配合物制備方法參考子球類型二(采用同樣的稀土配體)。表面層層自組裝中心發(fā)射波長(zhǎng)500nm和560nm熒光量子點(diǎn)，制備方法如母球類型二。微球采用表面功能基團(tuán)為羧基的聚合物磁性微球。

三、母球與子球的組裝方法(參照中國(guó)發(fā)明專利201410247053.3)

實(shí)施例17組裝方法一

母球表面共價(jià)組裝單層子球，所述的母球可以為上述母球類型中的任意一種，子球也可以為上述結(jié)構(gòu)單元中的任意一種類型子球。同一種母球可組裝兩不同種類的子球?？梢愿鶕?jù)調(diào)節(jié)不同種類的子球的比例調(diào)節(jié)顏色和編碼熒光強(qiáng)度。下文以一種子球與母球的組裝方法為例，不同比例子球組裝方法相同。制備方法如下：

取聚苯乙烯微球母球3mg，用100mM MEST(pH＝4)洗兩次，離心去上清液，超聲分散于300μL 100mM MEST中備用。取5mg羧基稀土配合物介孔子球，離心去上清液，超聲分散于300μL100mM MEST中。邊超聲邊將母球滴加入子球內(nèi)。滴加完畢后，渦旋振蕩，并置于垂直混合儀上混合30min。稱取EDC和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)各10mg，溶于200μL100mM MEST中配成反應(yīng)液，現(xiàn)配現(xiàn)用。反應(yīng)30min后，加入反應(yīng)液200μL，渦旋振蕩，并置于垂直混合儀上混合3h。反應(yīng)結(jié)束后，離心去上清液，0.1M NaOH洗3次(每次超聲2min)，水洗3次，最后分散在1ml水中。

實(shí)施例18組裝方法二

母球表面靜電吸附單層子球，所述的母球可以為上述母球類型中的任意一種，子球也可以為上述結(jié)構(gòu)單元中的任意一種類型子球。同一種母球可組裝不同種類的子球?？梢愿鶕?jù)調(diào)節(jié)不同種類的子球的比例調(diào)節(jié)顏色和編碼熒光強(qiáng)度。下文以一種子球與母球組裝為例，不同比例子球組裝方法相同。制備方法如下：

取氨基表面的聚苯乙烯微球母球3mg，用1M NaCl鹽溶液洗兩次，離心去上清液，超聲分散于300μL1M NaCl鹽溶液中備用。取5mg羧基稀土配合物介孔子球，離心去上清液，超聲分散于300μL1M NaCl鹽溶液中。邊超聲邊將母球滴加入子球內(nèi)。滴加完畢后，渦旋振蕩，并置于垂直混合儀上混合30min。反應(yīng)結(jié)束后，離心去上清液，水洗3次，最后分散在1ml水中。

四、微球組合的制備

實(shí)施例19第一種微球組合物的制備

母球獨(dú)立編碼熒光微球的制備。選用第八類型且表面為羧基的母球，即內(nèi)部共同裝載銪稀土配合物和中心發(fā)射波長(zhǎng)為500nm和560nm的量子點(diǎn)的聚合物微球。選用第一類型的子球即表面修飾有氨基的非熒光氧化硅或聚合物微球。母球與子球通過組裝方法一或者二實(shí)現(xiàn)組裝，得到表面為氨基的編碼熒光組裝微球。制備的微球組合如圖1所示。如圖2所示為三種熒光物質(zhì)的熒光發(fā)射光譜，在375nm激光激發(fā)時(shí)可以看到光譜之間的發(fā)射峰明顯分離，便于后續(xù)檢測(cè)通道區(qū)分不同的熒光物質(zhì)。

通過此種組合，調(diào)控類型八母球中銪稀土配合物和兩種量子點(diǎn)的裝載量，分別使每種發(fā)射波長(zhǎng)的熒光量子點(diǎn)實(shí)現(xiàn)5種獨(dú)立的熒光強(qiáng)度，銪稀土配合物得到4重獨(dú)立熒光強(qiáng)度，最終可以實(shí)現(xiàn)100重?zé)晒饩幋a微球的制備。

實(shí)施例20第二種微球組合物的制備

銪稀土配合物子球與雙色量子點(diǎn)母球聯(lián)合編碼微球的制備。選用第七類型且表面為羧基的母球，選用第二類型且表面為氨基的子球。母球與子球通過組裝方法一或者二實(shí)現(xiàn)組裝，得到表面為氨基的編碼熒光組裝微球。

通過此種組合，調(diào)控母球中兩種類型量子點(diǎn)裝載量，最終得到2-25種編碼母球；調(diào)控銪稀土配合物子球的組裝密度和熒光強(qiáng)度，可以實(shí)現(xiàn)1-8種獨(dú)立的熒光強(qiáng)度，最終可實(shí)現(xiàn)200重?zé)晒饩幋a微球的制備。

實(shí)施例21第三種微球組合物的制備

單色量子點(diǎn)子球(500nm)與雙色量子點(diǎn)(560nm)和銪稀土配合物母球聯(lián)合編碼微球的制備。選用第六類型且表面為羧基的母球，選用第三類型且表面為氨基的子球。母球與子球通過組裝方法一或者二實(shí)現(xiàn)組裝，得到表面為氨基的編碼熒光組裝微球。

通過此種組合，調(diào)控母球中兩種熒光物質(zhì)裝載量，最終得到2-20種編碼母球；調(diào)控第三類子球的組裝層數(shù)，可以實(shí)現(xiàn)1-3種獨(dú)立的熒光強(qiáng)度，最終可實(shí)現(xiàn)60重光編碼微球的制備。

實(shí)施例22第四種微球組合物的制備

單色量子點(diǎn)子球(560nm)與雙色量子點(diǎn)(500nm)和銪稀土配合物母球聯(lián)合編碼微球的制備。選用第五類型且表面為羧基的母球，選用第四類型且表面為氨基的子球。母球與子球通過組裝方法一或者二實(shí)現(xiàn)組裝，得到表面為氨基的編碼熒光組裝微球。

通過此種組合，調(diào)控母球中兩種熒光物質(zhì)裝載量，最終得到2-20種編碼母球；調(diào)控第三類子球的組裝層數(shù)，可以實(shí)現(xiàn)1-3種獨(dú)立的熒光強(qiáng)度，最終可實(shí)現(xiàn)60重光編碼微球的制備。

實(shí)施例23第五種微球組合物的制備

單色量子點(diǎn)母球(560nm)與雙色量子點(diǎn)(500nm)和銪稀土配合物子球聯(lián)合編碼微球的制備。選用第三類型且表面為羧基的母球，選用第五類型且表面為氨基的子球。母球與子球通過組裝方法一或者二實(shí)現(xiàn)組裝，得到表面為氨基的編碼熒光組裝微球。

通過此種組合，調(diào)控母球中量子點(diǎn)裝載量，最終得到1-10種編碼母球；調(diào)控子球中熒光物質(zhì)裝載量，可以實(shí)現(xiàn)1-24種獨(dú)立的熒光強(qiáng)度，最終可實(shí)現(xiàn)240重光編碼微球的制備。

實(shí)施例24第六種微球組合物的制備

單色量子點(diǎn)母球(500nm)與雙色量子點(diǎn)(560nm)和銪稀土配合物子球聯(lián)合編碼微球的制備。選用第二類型且表面為羧基的母球，選用第六類型且表面為氨基的子球。母球與子球通過組裝方法一或者二實(shí)現(xiàn)組裝，得到表面為氨基的編碼熒光組裝微球。

通過此種組合，調(diào)控母球中量子點(diǎn)裝載量，最終得到1-10種編碼母球；調(diào)控子球中熒光物質(zhì)裝載量，可以實(shí)現(xiàn)1-24種獨(dú)立的熒光強(qiáng)度，最終可實(shí)現(xiàn)240重光編碼微球的制備。

實(shí)施例25第七種微球組合物的制備

單色銪稀土配合物母球與雙色量子點(diǎn)子球聯(lián)合編碼微球的制備。選用第四類型且表面為羧基的母球，選用第七類型且表面為氨基的子球。母球與子球通過組裝方法一或者二實(shí)現(xiàn)組裝，得到表面為氨基的編碼熒光組裝微球。

通過此種組合，調(diào)控母球中銪稀土配合物裝載量，最終得到1-4種編碼母球；調(diào)控子球中兩種量子點(diǎn)組裝層數(shù)，可以實(shí)現(xiàn)1-4種獨(dú)立的熒光強(qiáng)度，最終可實(shí)現(xiàn)16重光編碼微球的制備。

實(shí)施例26第八種微球組合物的制備

三色熒光子球和空白母球聯(lián)合編碼微球的制備。選用第一類型且表面為羧基的母球，選用第八類型且表面為氨基的子球。母球與子球通過組裝方法一或者二實(shí)現(xiàn)組裝，得到表面為氨基的編碼熒光組裝微球。

通過此種組合得到雙色量子點(diǎn)4種編碼和單色銪稀土配合物8重編碼，最終可實(shí)現(xiàn)32重光編碼微球的制備。

應(yīng)當(dāng)指出以上實(shí)施例中，均為一種類型母球和一種類型子球連接，一種類型的母球也可與多種類型(一般為兩種)子球連接，調(diào)控得到更多種類的編碼結(jié)構(gòu)微球。并且可以根據(jù)需要得到單色或者雙色的編碼微球。

在以上實(shí)施例中：

1、銪稀土配合物的敏化配體有多種，不同配體形成的稀土配合物其發(fā)射峰位置基本不變，因此如二本甲酰甲烷、4,4,4-三氟-1-(2-萘基)-1,3-丁二酮等β-二酮或者多元羧酸配體等都可以作為Eu離子的有效能量供體，同時(shí)可以加入鄰菲羅啉、三正辛基氧膦等第二配體，作為協(xié)同試劑參與能量轉(zhuǎn)移過程，因此作為銪離子的熒光有效敏化配體都是可用的；

2、所采用的Eu稀土配合物，基于鋱離子(Tb³⁺)的稀土配合物也具有很強(qiáng)的熒光，其發(fā)射峰在540nm左右，因此能夠敏化鋱離子構(gòu)成可以發(fā)出熒光的Tb稀土配合物都能夠作為三色熒光編碼微球的備用的熒光物質(zhì)，另外兩種采用熒光物質(zhì)相應(yīng)的稀土配合物(如Dy³⁺、Sm³⁺)或者染料或者量子點(diǎn)均可；

3、所采用的方式是將Eu稀土配合物裝載在介孔納米顆粒中，應(yīng)該指出稀土配合物的載體不限于上述步驟的制備方法，如SBA-15介孔顆粒、反相微乳液法制備的二氧化硅球、或者采用溶脹法制備得到摻雜稀土配合物的聚苯乙烯微球等都可以作為三色熒光編碼微球中稀土配合物的有效載體；

4、稀土配合物編碼微球表面功能化的方法不僅限于以上所述的偶聯(lián)氨基丙基三乙氧基甲硅烷(APTES)或者靜電吸附含有羧基或者含有氨基的高分子聚合物，凡是可以將編碼微球表面官能化連接上如羧基、氨基、巰基等官能團(tuán)的修飾方法都是可以的。

以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例。應(yīng)當(dāng)理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無需創(chuàng)造性勞動(dòng)就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實(shí)驗(yàn)可以得到的技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護(hù)范圍內(nèi)。