本發(fā)明屬于功能材料技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型的熒光編碼微球的制備方法。

背景技術(shù)：

高分子熒光編碼微球是指直徑在納米至微米級并負載有熒光物質(zhì)的聚合物微球，其外形可為任意形狀，一般為球形。聚合物熒光微球以其穩(wěn)定的形態(tài)結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定而高效的發(fā)光效率，在標記、示蹤、檢測、標準、固定化酶、免疫醫(yī)學(xué)、高通量藥物篩選等領(lǐng)域顯示出巨大的應(yīng)用潛力。因此，近年有關(guān)聚合物熒光微球高性能化的研究越來越受到國內(nèi)外科學(xué)工作者的關(guān)注，已成為本領(lǐng)域研究的熱點和難點。

目前，高分子熒光編碼微球的制備方法有乳液聚合、沉淀聚合、種子聚合、蒸餾沉淀聚合等。國內(nèi)外對高分子熒光編碼微球研究有很多，主要以聚苯乙烯微球、二氧化硅微球、聚丙烯酸微球為主。雖然這幾種熒光微球都可以達到較好的粒徑控制和單分散性，但其對熒光探針分子（熒光染料、量子點等）的固定能力較弱，探針分子很容易從熒光編碼微球中泄漏出來，使得編碼微球的熒光發(fā)光性能不穩(wěn)定，尤其在酸性和堿性環(huán)境中，微球負載的探針分子易隨著時間的推移發(fā)生流失或淬滅，大大影響了微球的發(fā)光性能和使用壽命。

相對于聚苯乙烯微球、二氧化硅微球、聚丙烯酸等熒光編碼微球，聚甲基丙烯酸縮水甘油酯（PGMA）微球富含大量環(huán)氧基，可以與許多熒光探針分子的特定官能團發(fā)生反應(yīng)，從而將熒光探針分子通過化學(xué)鍵穩(wěn)定的固定在微球內(nèi)部，因此，本發(fā)明提供了一種新型的高性能PGMA熒光編碼微球及其制備方法，與以上幾種微球相比，本發(fā)明制備的PGMA熒光編碼微球發(fā)光性能更加穩(wěn)定、持久。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種熒光編碼微球的制備方法，其制得的熒光編碼微球結(jié)構(gòu)規(guī)整、粒徑尺寸可控、單分散性，并具有穩(wěn)定、持久的發(fā)光特性，可穩(wěn)定分散在水和乙醇等溶劑中，在生物探針、熒光成像、固定化酶、免疫醫(yī)學(xué)、流式細胞生物分析等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種熒光微球的制備方法，是采用分散聚合原位包覆法，以GMA、PVP、AIBN和熒光探針分子為原料，在70℃下制得的高性能PGMA熒光編碼微球；其具體步驟如下：

1）將熒光探針分子溶于蒸餾水中，配成濃度為0.5 mg/mL的熒光探針分子溶液；

2）在50-200 mL乙醇-水混合溶劑中加入0.5-3.0 g PVP，并加入2-6 mL步驟1）配制的熒光探針分子溶液，混合攪拌直至PVP完全溶解；

3）將0.02-0.2 g AIBN溶于5 mL GMA中，并在氮氣保護下將其快速注射到步驟2）所得混合溶液中，混合攪拌0.5 h后升溫至70℃，反應(yīng)12 h；

4）將步驟3）所得產(chǎn)物離心分離，然后依次用蒸餾水、乙醇、蒸餾水各清洗三次，再在真空干燥箱內(nèi)干燥24 h。

所用熒光探針分子包括異硫氰酸熒光素（FITC）、羅丹明B（RB）、磺基羅丹明101（SRB 101）中的一種或幾種。

所述乙醇-水混合溶劑中乙醇與水的體積比為85:15。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點在于：

（1）本發(fā)明利用分散聚合原位包覆制備技術(shù)，以GMA為單體，AIBN為引發(fā)劑，PVP為表面活性劑，乙醇-水為混合溶劑，并在聚合反應(yīng)前加入熒光探針分子，利用聚合物成球的包合作用和微球內(nèi)部的環(huán)氧基團固定熒光探針分子，使得熒光分子不易泄露，從而使所得熒光編碼微球具有穩(wěn)定、持久的發(fā)光特性；同時，該熒光編碼微球表面含有大量的環(huán)氧基團，有利于進一步物理和化學(xué)改性，在生物探針、熒光成像、固定化酶、免疫醫(yī)學(xué)、流式細胞生物分析等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。

（2）本發(fā)明方法成球性能好，并具有反應(yīng)過程簡單、反應(yīng)條件溫和（反應(yīng)溫度70 ℃）的特點，所得熒光編碼微球為微米尺度，其結(jié)構(gòu)規(guī)整、粒徑尺寸可控、單分散性。

（3）本發(fā)明所得熒光編碼微球在488 nm波長激發(fā)下，熒光發(fā)光穩(wěn)定且具有高度的可分辨特性和熒光編碼信號。

附圖說明

圖1為實施例1制備的負載FITC熒光探針編碼微球的熒光照片（a）及其在488nm波長下激發(fā)的熒光編碼光譜信號（b）。

圖2為實施例2制備的負載RB熒光探針編碼微球的熒光照片（a）及其在488nm波長下激發(fā)的熒光編碼光譜信號（b）。

圖3為實施例3制備的負載SRB101熒光探針編碼微球的熒光照片（a）及其在488nm波長下激發(fā)的熒光編碼光譜信號（b）。

圖4為實施例4制備的負載FITC和RB混合熒光探針編碼微球的熒光照片（a）及其在488nm波長下激發(fā)的熒光編碼光譜信號（b）。

具體實施方式

（1）將FITC、RB和SRB101等熒光探針分子中的一種或幾種溶于蒸餾水中，配成濃度為0.5 mg/mL的熒光探針分子溶液；

（2）在四口燒瓶中加入50-200 mL乙醇-水混合溶劑（體積比為85:15），隨即加入0.5-3.0 g PVP，并加入2-6 mL步驟（1）配制的熒光探針分子溶液，混合攪拌直至PVP完全溶解；

（3）將0.02-0.2 g AIBN 溶于5 mL GMA中，并在氮氣保護下將其快速注射到步驟（2）所得混合溶液中，混合攪拌0.5 h后升溫至70 ℃，反應(yīng)12 h；

（4）將步驟（3）所得產(chǎn)物離心分離，然后依次用蒸餾水、乙醇、蒸餾水各清洗三次，再在真空干燥箱內(nèi)干燥24 h，即自熒光微球。

為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。

實施例1 負載FITC探針分子的編碼微球

（1）將FITC熒光探針分子溶于蒸餾水中，配成濃度為0.5 mg/mL的熒光探針分子溶液；

（2）在四口燒瓶中加入100mL乙醇-水混合溶劑（體積比為85:15），隨即加入1.0 g PVP，并加入2 mL步驟（1）配制的熒光探針分子溶液，混合攪拌直至PVP完全溶解；

（3）將0.1 g AIBN 溶于5 mL GMA中，并在氮氣保護下將其快速注射到步驟（2）所得混合溶液中，混合攪拌0.5 h后升溫至70 ℃，反應(yīng)12 h；

（4）將步驟（3）所得產(chǎn)物離心分離，然后依次用蒸餾水、乙醇、蒸餾水各清洗三次，再在真空干燥箱內(nèi)干燥24 h。

實施例2 負載RB探針分子的編碼微球

（1）將RB熒光探針分子溶于蒸餾水中，配成濃度為0.5 mg/mL的熒光探針分子溶液；

（2）在四口燒瓶中加入50mL乙醇-水混合溶劑（體積比為85:15），隨即加入0.5 g PVP，并加入6 mL步驟（1）配制的熒光探針分子溶液，混合攪拌直至PVP完全溶解；

（3）將0.02 g AIBN 溶于5 mL GMA中，并在氮氣保護下將其快速注射到步驟（2）所得混合溶液中，混合攪拌0.5 h后升溫至70 ℃，反應(yīng)12 h；

（4）將步驟（3）所得產(chǎn)物離心分離，然后依次用蒸餾水、乙醇、蒸餾水各清洗三次，再在真空干燥箱內(nèi)干燥24 h。

實施例3 負載SRB101探針分子的編碼微球

（1）將SRB101熒光探針分子溶于蒸餾水中，配成濃度為0.5 mg/mL的熒光探針分子溶液；

（2）在四口燒瓶中加入100mL乙醇-水混合溶劑（體積比為85:15），隨即加入2.0 g PVP，并加入3 mL步驟（1）配制的熒光探針分子溶液，混合攪拌直至PVP完全溶解；

（3）將0.05 g AIBN 溶于5 mL GMA中，并在氮氣保護下將其快速注射到步驟（2）所得混合溶液中，混合攪拌0.5 h后升溫至70 ℃，反應(yīng)12 h；

（4）將步驟（3）所得產(chǎn)物離心分離，然后依次用蒸餾水、乙醇、蒸餾水各清洗三次，再在真空干燥箱內(nèi)干燥24 h。

實施例4 負載FITC、RB混合熒光探針的編碼微球

（1）將FITC、RB熒光探針分子溶于蒸餾水中，配成濃度為0.5 mg/mL的混合熒光探針分子溶液；

（2）在四口燒瓶中加入200mL乙醇-水混合溶劑（體積比為85:15），隨即加入3.0 g PVP，并加入4 mL步驟（1）配制的混合熒光探針分子溶液，混合攪拌直至PVP完全溶解；

（3）將0.2 g AIBN 溶于5 mL GMA中，并在氮氣保護下將其快速注射到步驟（2）所得混合溶液中，混合攪拌0.5 h后升溫至70 ℃，反應(yīng)12 h；

（4）將步驟（3）所得產(chǎn)物離心分離，然后依次用蒸餾水、乙醇、蒸餾水各清洗三次，再在真空干燥箱內(nèi)干燥24 h。

圖1-4分別為實施例1-4所制備熒光探針編碼微球的熒光照片（a）及其在488nm波長下激發(fā)的熒光編碼光譜信號（b）。從圖（a）中可以看出，本發(fā)明制備的PGMA熒光編碼微球的形貌規(guī)整、單分散；而從圖（b）中可以看出，本發(fā)明制備的PGMA熒光編碼微球在488nm波長激發(fā)下均具有穩(wěn)定熒光發(fā)射峰，其中，實施例1-3制備的編碼微球分別在526nm、567nm、608nm處有單一的熒光編碼信號，而實施例4制備的編碼微球在526nm和578nm處有雙重?zé)晒饩幋a信號，證明編碼微球的熒光編碼信號具有高度的可分辨性，在熒光編碼微球高通量生物檢測、流式細胞生物分析等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。