本發(fā)明屬于納米檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種碳量子點(diǎn)的制備方法及其檢測(cè)汞離子和顯現(xiàn)指紋的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

碳元素是地球和宇宙中含量較為豐富的元素，重要的是地球上的生命都是以碳元素為基礎(chǔ)的，所以碳的納米材料與其它元素的納米材料相比，對(duì)生物體的毒性要低很多，生物安全性也較高，基本不會(huì)帶來環(huán)境問題。逐漸地，碳量子點(diǎn)（也稱為碳點(diǎn)）成為碳納米家族中一顆耀眼的新星。然而，它之所以越來越受人們的關(guān)注，是因?yàn)樗c傳統(tǒng)的半導(dǎo)體量子點(diǎn)和有機(jī)染料相比，熒光碳量子點(diǎn)具有更好的水溶性、耐光漂白性、低毒、生物相容性等等。因此它可以被應(yīng)用在生物標(biāo)記、檢測(cè)等領(lǐng)域。

日常生活和生產(chǎn)中的重金屬元素未經(jīng)處理或處理未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)就被排放到環(huán)境中，它們不僅不能被生物降解，而且會(huì)在生物放大作用下，通過大氣、水體、食物鏈等傳播，不斷富集，最后進(jìn)入人體。重金屬元素在人體內(nèi)和蛋白質(zhì)等發(fā)生強(qiáng)烈的相互作用，使蛋白質(zhì)失去活性。同時(shí)，重金屬元素也可能在人體的某些器官中累積，造成慢性中毒。目前，在環(huán)境監(jiān)測(cè)分析中，重金屬離子的測(cè)定方法主要有：絡(luò)合滴定法、電化學(xué)分析法、高效液相色譜法、離子色譜法、氣相色譜法、熒光分析法、原子吸收光譜法和質(zhì)譜法等[Evans E.H., Day J.A., Palmer C.D., et al. Journal of analytical atomic spectrometry. 2005, 20(6): 562-590; Evans E.H., Dawson J.B., Fisher A., et al. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 2002, 17(6): 622-651; Butler O.T., Cook J.M., Davidson C.M., et al. Journal of Analytical Atomic Spectrometry. 2009, 24(2): 131-177; Michalski R. Critical Reviews in Analytical Chemistry. 2009, 39(4): 230-250.]。雖然這些方法靈敏而且可靠，但是存在一些不足之處：1）需要昂貴的大型儀器設(shè)備；2）樣品制備和處理過程較為復(fù)雜；3）選擇性差；4）無法及時(shí)實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)等。近年來，人們致力于檢測(cè)重金屬離子的化學(xué)傳感器研究，并且發(fā)展了一些有關(guān)重金屬離子的熒光傳感方法（即熒光探針法）。熒光探針法具有線性動(dòng)態(tài)范圍寬、光譜干擾少、靈敏度高以及多元素檢測(cè)功能強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，并且用于檢測(cè)熒光光譜的熒光分光光度計(jì)設(shè)備費(fèi)用較低，可以同時(shí)檢測(cè)固體或液體樣品，樣品的制備簡(jiǎn)單，無需繁瑣處理，成為目前廣泛應(yīng)用的分析方法。

汞是一種具有劇毒卻又普遍存在于自然界的污染物。汞污染會(huì)造成對(duì)腦、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、腎臟嚴(yán)重的傷害。水溶性的二價(jià)汞離子(Hg²⁺)是汞污染物中最平常和最穩(wěn)定的形式之一。因此，環(huán)境中的水溶性的Hg²⁺的檢測(cè)和監(jiān)測(cè)的研究逐漸成為各國環(huán)境工作者研究的熱點(diǎn)。熒光光譜法具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)、用樣量少、方法簡(jiǎn)便、工作曲線線性范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。因此，研發(fā)新型熒光傳感器并應(yīng)用于環(huán)境水樣中Hg²⁺的監(jiān)測(cè)具有十分重要的意義，此外，在活體細(xì)胞中檢測(cè)重金屬汞離子，能夠準(zhǔn)確判斷汞離子的污染程度，從而全面進(jìn)行生態(tài)分析，對(duì)環(huán)境的保護(hù)和治理具有至關(guān)重要的作用。

我們所制備的熒光碳量子點(diǎn)不但可以檢測(cè)Hg²⁺，同時(shí)也可用于指紋的顯現(xiàn)與識(shí)別。指紋是重要的個(gè)體識(shí)別特征，通過提取指紋，在事故的調(diào)查和處理中，能提供確切的身份識(shí)別；在法庭科學(xué)和刑事訴訟過程中，起著重要的證據(jù)作用。因此，科學(xué)正確地發(fā)現(xiàn)、提取、顯現(xiàn)鑒定指紋對(duì)于開展偵查工作、懲治犯罪具有重要的實(shí)踐作用。

在本發(fā)明中，我們研究了一種利用一鍋法合成的熒光碳量子點(diǎn)的方法，并且研究了利用碳量子點(diǎn)作為熒光探針來檢測(cè)重金屬汞離子并應(yīng)用于指紋的顯現(xiàn)與識(shí)別，且不需要經(jīng)過表面修飾或改性可直接用于活體細(xì)胞熒光成像，可通過熒光成像實(shí)現(xiàn)對(duì)活體細(xì)胞中汞離子的檢測(cè)。我們提供的熒光碳量子點(diǎn)的合成方法是簡(jiǎn)單的一次性綠色合成路線，因此，本發(fā)明提供的方法具備成本低、合成方法簡(jiǎn)單、易操作的特點(diǎn)。利用熒光碳量子點(diǎn)溶液作為檢測(cè)探針檢測(cè)汞離子，是一種操作簡(jiǎn)單、快速定量檢測(cè)重金屬離子汞的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種碳量子點(diǎn)的制備方法及其檢測(cè)汞離子和顯現(xiàn)指紋的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種碳量子點(diǎn)的制備方法：

首先將1-3 g的檸檬酸三鈉與2-4 g的尿素放入到不銹鋼反應(yīng)釜中，再向其中加入10-15 mL的二甲基甲酰胺，反應(yīng)釜封閉后，將混合物加熱至150°C-200°C，反應(yīng)進(jìn)行約6-8 h之后，將混合溶液冷卻到室溫，在約6000-8000轉(zhuǎn)的條件下離心約10 min，去除上清液將固體沉淀烘干得到熒光碳量子點(diǎn)粉末。

所制得的熒光碳量子點(diǎn)粉末在紫外光源下呈現(xiàn)綠色光發(fā)射，其熒光光譜在420 nm的波長下激發(fā)，碳量子點(diǎn)在530 nm有強(qiáng)的熒光發(fā)射峰（附圖1），將碳量子點(diǎn)粉末溶于水得到的熒光碳量子點(diǎn)溶液在370 nm的激發(fā)下，發(fā)射峰在446 nm處熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，通過透射電鏡觀察，碳量子點(diǎn)的粒徑大小約為3-5 nm左右（附圖3）；

2. 如權(quán)利要求1所述熒光碳量子點(diǎn)溶液通過熒光檢測(cè)的方法，可檢測(cè)出水溶液樣品中含有的微量的重金屬離子Hg²⁺，通過熒光成像法還可以實(shí)現(xiàn)在活體細(xì)胞中檢測(cè)汞離子的效果。

熒光碳量子點(diǎn)作為熒光探針檢測(cè)Hg²⁺的過程中，過程如下：

（1）檢測(cè)靈敏度

為檢驗(yàn)使用熒光碳量子點(diǎn)（C-dots）作為熒光探針檢測(cè)Hg²⁺的靈敏度，需要先配制0.001-100 μM的Hg²⁺溶液，將不同濃度的Hg²⁺溶液分別與C-dots熒光探針反應(yīng)，然后分別測(cè)試樣品的熒光光譜來驗(yàn)證探針的靈敏度。從熒光光譜（附圖4a）中可以看出，所有混合溶液的熒光發(fā)射峰都在446 nm處，與熒光探針C-dots的特征發(fā)射一致，并且隨著Hg²⁺濃度的升高，混合溶液中碳量子點(diǎn)溶液的熒光強(qiáng)度是逐漸降低的?；旌先芤涸谧贤鉄粝聼晒獍l(fā)射隨Hg²⁺濃度的增大而降低逐漸被淬滅（附圖4c）。進(jìn)行檢測(cè)靈敏度的反應(yīng)，熒光碳量子點(diǎn)作為檢測(cè)探針的熒光強(qiáng)度與Hg²⁺的濃度在1 nM-5 μM范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系（附圖4b）。因此，熒光碳量子點(diǎn)可以作為檢測(cè)汞離子的熒光探針快速并定量地檢測(cè)水溶液中汞離子的存在，對(duì)汞離子的檢測(cè)限可達(dá)到1 nM。

（2）檢測(cè)選擇性

使用熒光碳量子點(diǎn)溶液作為熒光探針檢測(cè)Hg²⁺，需要考察其對(duì)Hg²⁺檢測(cè)的選擇性。相同條件下，濃度為100 μM的其它金屬溶液離子包括Cd²⁺，Cr³⁺，Cr⁶⁺，Ba²⁺，Zn²⁺，Ca²⁺，Mn²⁺，Mg²⁺，Co²⁺，F(xiàn)e³⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Pb²⁺，Ag⁺的溶液，分別與C-dots熒光檢測(cè)探針混合反應(yīng)后測(cè)試樣品的熒光光譜，并在紫外燈下觀測(cè)其熒光強(qiáng)度。從熒光光譜圖中可以看出，加入其它離子后，C-dots的熒光發(fā)射峰都在446 nm處，沒有發(fā)生位移。其中Cd²⁺，Cr³⁺，Cr⁶⁺，Ba²⁺，Zn²⁺，Ca²⁺，Mn²⁺，Mg²⁺，Co²⁺，F(xiàn)e³⁺，Ni²⁺，Cu²⁺，Ag⁺，Pb²⁺的熒光光譜強(qiáng)度較高（附圖5a），在紫外燈照射下，可觀察到C-dots熒光檢測(cè)探針呈現(xiàn)綠光發(fā)射，沒有出現(xiàn)淬滅現(xiàn)象。而與Hg²⁺混合的C-dots溶液的熒光光譜強(qiáng)度降低，同樣在紫外燈下，與Hg²⁺混合的C-dots熒光檢測(cè)探針會(huì)出現(xiàn)淬滅現(xiàn)象（附圖5b）。通過比較熒光光譜和其在紫外燈下的熒光發(fā)射可說明C-dots熒光檢測(cè)探針對(duì)Hg²⁺具有很高的選擇性。

利用熒光成法檢測(cè)活體細(xì)胞中汞離子的存在對(duì)判斷環(huán)境污染的程度具有重要作用。在本實(shí)驗(yàn)中，我們對(duì)Hela細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)過程中利用測(cè)試活體細(xì)胞存活率常用的方法噻唑藍(lán)比色法（MTT法）測(cè)試碳量子點(diǎn)的毒性，其細(xì)胞的生存能力均能達(dá)到86%以上，說明碳量子點(diǎn)對(duì)生物細(xì)胞的毒性可忽略不計(jì)。將合成的熒光碳量子點(diǎn)直接用于細(xì)胞成像，不需要事先表面修飾，碳量子點(diǎn)即可通過細(xì)胞的吞噬作用進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)，在熒光顯微鏡下可呈現(xiàn)清晰的熒光圖像，實(shí)現(xiàn)對(duì)活體細(xì)胞中汞離子的檢測(cè)。

所述碳量子點(diǎn)作為熒光探針可以檢測(cè)重金屬汞離子并應(yīng)用于指紋的顯現(xiàn)與識(shí)別，且不需要經(jīng)過表面修飾或改性可直接用于活體細(xì)胞熒光成像，并通過熒光成像法實(shí)現(xiàn)對(duì)活體細(xì)胞中汞離子的檢測(cè)。下面結(jié)合附圖及實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明：

有益效果：

1、本發(fā)明提供了熒光碳量子點(diǎn)熒光檢測(cè)探針的制備方法，制得的熒光碳量子點(diǎn)具有強(qiáng)的綠光發(fā)射，碳量子點(diǎn)粉末可用于指紋的識(shí)別，碳量子點(diǎn)溶液提供的熒光檢測(cè)探針靈敏度高、選擇性好，檢測(cè)限低，還可實(shí)現(xiàn)活體細(xì)胞中汞離子的檢測(cè)。

2、不需要大型儀器，通過熒光光譜，即可識(shí)別檢測(cè)結(jié)果。

3、本發(fā)明易制備和保存；在4°C條件下可保存8～15個(gè)月不發(fā)生變化。

4、本發(fā)明所用試劑和操作過程均無毒副作用。

5、本發(fā)明方法簡(jiǎn)單、快速、易操作，可進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)原位快速檢測(cè)。

附圖說明

附圖1是熒光碳量子點(diǎn)粉末（C-dots）的熒光光譜圖；

附圖2是熒光碳量子點(diǎn)溶液（C-dots）的紫外光譜圖(左)與熒光光譜圖（右）；

附圖3(a) 碳量子點(diǎn)的透射電鏡照片，插圖為高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）圖；(b) 粒徑分布圖；

附圖4 (a) 碳量子點(diǎn)溶液中加入不同濃度的Hg²⁺溶液(箭頭方向順序0、0.001、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、15、20、40、60、80、100 μM)；(b) 熒光強(qiáng)度與Hg²⁺濃度的線性關(guān)系; (c) 相應(yīng)的熒光照片；

附圖5 (a) 碳量子點(diǎn)中分別加入100 μM Hg²⁺和100 μM 其它離子溶液的熒光光譜圖；(b) 相應(yīng)的熒光照片；

附圖6湖水樣品的靈敏度檢測(cè)熒光光譜圖(a) 碳量子點(diǎn)溶液中加入不同濃度的Hg²⁺溶液(箭頭方向順序0、0.001、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、15、20、40、60、80、100 μM)；(b) 相應(yīng)的熒光照片；

附圖7湖水樣品的選擇性檢測(cè)熒光光譜圖 (a) 碳量子點(diǎn)中分別加入100 μM Hg²⁺和100 μM 其它離子溶液的熒光光譜圖；(b) 相對(duì)熒光強(qiáng)度譜圖；(c) 相應(yīng)的熒光照片；

附圖8是熒光碳量子點(diǎn)粉末用于指紋的識(shí)別照片。

附圖9碳量子點(diǎn)與Hela細(xì)胞共培養(yǎng)3 h后的熒光顯微成像 (a) 細(xì)胞成像的明場(chǎng)圖；(b) 細(xì)胞成像熒光圖；(c) 加入100 μM Hg²⁺的細(xì)胞成像熒光圖；標(biāo)尺為200 μm

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。

實(shí)施例1、一種碳量子點(diǎn)的制備方法：

首先將1 g的檸檬酸三鈉與2 g的尿素放入到不銹鋼反應(yīng)釜中，再向其中加入10-15 mL的二甲基甲酰胺，將混合物加熱至160°C，反應(yīng)進(jìn)行約6 h之后，將混合溶液冷卻到室溫，在約8000轉(zhuǎn)的條件下離心約10 min，去除上清液將固體沉淀烘干得到熒光碳量子點(diǎn)粉末。

所制得的熒光碳量子點(diǎn)粉末在紫外光源下呈現(xiàn)綠色光發(fā)射，其熒光光譜，在420 nm的波長下激發(fā)，熒光碳量子點(diǎn)在530 nm有強(qiáng)的發(fā)射峰（附圖1），插圖對(duì)應(yīng)日光燈與紫外光下的碳量子點(diǎn)粉末照片。熒光碳量子點(diǎn)溶液在370 nm的激發(fā)下，發(fā)射峰在446 nm處熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，紫外吸收光譜中可以看出它的特征峰在346 nm左右（附圖2），附圖3a是碳量子點(diǎn)透射電鏡圖片，插圖為高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）圖，碳量子點(diǎn)的晶面間距約為0.21 nm，是典型石墨相（100）晶面，粒徑大小平均為3.52 nm（附圖3b）。

實(shí)施例2、所述合成的熒光碳量子點(diǎn)溶液通過熒光檢測(cè)的方法應(yīng)用于環(huán)境水樣中：

熒光碳量子點(diǎn)作為探針檢測(cè)Hg²⁺的過程中，待測(cè)的樣品與C-dots熒光檢測(cè)探針按體積比為1:1的量混合，即150 μL的Hg²⁺的溶液樣品加入150 μL C-dots熒光檢測(cè)探針中，所有的靈敏度實(shí)驗(yàn)和選擇性實(shí)驗(yàn)都按以上的比例進(jìn)行，具體實(shí)驗(yàn)過程如下：

為了證實(shí)碳量子點(diǎn)溶液作為熒光探針檢測(cè)Hg²⁺的實(shí)用性，我們采集了實(shí)際環(huán)境中的水樣，如取校園中的淡水湖的樣品進(jìn)行測(cè)試，通過0.2 μm隔膜過濾，然后將湖水配制不同濃度（0.001-100 μM）的Hg²⁺溶液及其它金屬離子溶液進(jìn)行測(cè)試，附圖6a為碳量子點(diǎn)溶液與不同濃度Hg²⁺的混合的熒光光譜圖，可以看出隨著Hg²⁺濃度的增加，碳量子點(diǎn)溶液的熒光強(qiáng)度逐漸降低，附圖6b為對(duì)應(yīng)紫外燈下的熒光照片。附圖7a是利用碳量子點(diǎn)溶液進(jìn)行湖水選擇性檢測(cè)，從熒光光譜圖中，我們可以觀察到含有Hg²⁺的碳量子點(diǎn)溶液的熒光強(qiáng)度大幅度下降。附圖7b為碳量子點(diǎn)溶液中加入各離子后的熒光強(qiáng)度與碳量子點(diǎn)溶液熒光強(qiáng)度的比，也能看出熒光探針對(duì)Hg²⁺的專一性。附圖7c是相對(duì)應(yīng)的紫外光源下的熒光照片。

通過以上實(shí)驗(yàn)說明湖水中可能存在一些未知的物質(zhì)，但對(duì)碳量子點(diǎn)溶液檢測(cè)探針影響不大，仍可以達(dá)到我們對(duì)Hg²⁺的檢測(cè)目的，所以可以將此種檢測(cè)方法運(yùn)用到日常生活中。

實(shí)施例3、所述合成的熒光碳量子點(diǎn)粉末用于指紋的識(shí)別：

首先用瑪瑙研缽將碳量子點(diǎn)固體研磨成粉末狀，然后準(zhǔn)備好干凈的硅片，將手指在硅片上按上指紋，用抖顯法將粉末借助紙槽散在印有潛指紋的樣品上并輕輕磕樣品載體硅片，將碳量子點(diǎn)粉末回收到起來，有指紋樣品的區(qū)域由于指紋汗液成分中的皮脂等對(duì)碳量子點(diǎn)粉末有一定的吸附作用，殘留在潛指紋表面 的碳量子點(diǎn)粉末會(huì)顯現(xiàn)出清晰的指紋圖像，可重復(fù)幾次，然后在紫外燈下觀察。附圖8是熒光碳量子點(diǎn)粉末顯示過的潛指紋成像照片，從中可以看出在紫外光激發(fā)下顯現(xiàn)后的潛指紋可以發(fā)射出明亮的綠色熒光，指紋紋路清晰連貫且與基底反差明顯。原因是潛指紋中的某些有機(jī)組分，例如油脂與碳量子點(diǎn)外圍的胺端基發(fā)生了靜電吸附或者胺解反應(yīng)使得碳量子點(diǎn)靶向結(jié)合在指紋的乳突紋上。光致發(fā)光技術(shù)提高了潛指紋的顯現(xiàn)靈敏度， 其顯出的指紋清晰、與背景之間的反差好。指紋具有人各不同，在法庭科學(xué)和刑事訴訟過程中，起著重要的證據(jù)作用。因此，科學(xué)正確地發(fā)現(xiàn)、提取、顯現(xiàn)鑒定指紋對(duì)于開展偵查工作、懲治犯罪具有重要的實(shí)踐作用，具有良好的應(yīng)用前景。

實(shí)施例4、所述合成的熒光碳量子點(diǎn)用于細(xì)胞熒光成像：

我們所合成的熒光碳量子點(diǎn)具有較強(qiáng)的綠色熒光、粒子較小、穩(wěn)定性高、很好的相容性，所以可以將其應(yīng)用到細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)中。附圖9a所示，將溫度控制在37°C，在含有5%CO₂的加濕培養(yǎng)箱中，用含有10%牛血清和100 μg/mL的青霉素的培養(yǎng)基培養(yǎng)HeLa細(xì)胞。然后，將HeLa細(xì)胞接種到6孔板中與培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)24 h，接著將濃度為1 mg/mL碳量子點(diǎn)溶液加入到孔板中，繼續(xù)放在加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后移除培養(yǎng)基，用PH=7.4的磷酸鹽緩沖溶液將細(xì)胞洗滌3次，放到熒光顯微鏡下（加藍(lán)色濾光片）拍攝熒光照片，細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)明顯的橙黃色熒光如附圖9b所示。

在碳量子點(diǎn)熒光探針檢測(cè)水溶液中的Hg²⁺的基礎(chǔ)上，我們探究了利用碳量子點(diǎn)通過活細(xì)胞熒光標(biāo)記成像的方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的Hg²⁺。向整個(gè)細(xì)胞體系中加入100 μM Hg²⁺之后，觀察細(xì)胞熒光成像變化如附圖9c所示，可以明顯的看到細(xì)胞內(nèi)的熒光亮度發(fā)生了明顯的減弱現(xiàn)象，說明碳量子點(diǎn)在活的細(xì)胞內(nèi)仍然能對(duì)Hg²⁺實(shí)現(xiàn)高效的檢測(cè)，從而證明了該熒光探針有望被應(yīng)用于活的生物體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)的Hg²⁺檢測(cè)。