本發(fā)明涉及一種針對水中鎘離子檢測的快速可視化比率熒光探針的制備與檢測方法。

(二)

背景技術(shù)：

鎘是一種有毒重金屬，普遍存在于工業(yè)、被污染的農(nóng)產(chǎn)品以及我們?nèi)粘Ｉ钪小．?dāng)環(huán)境受到鎘污染后，鎘可在生物體內(nèi)富集。鎘可以通過食物鏈進入人體，與蛋白質(zhì)上的巰基結(jié)合，形成鎘硫蛋白，選擇性地蓄積肝、腎中，造成一系列急、慢性疾病，如骨質(zhì)疏松、肺癌等。因此我們迫切需要發(fā)展一種方便可行的方法來檢測Cd²⁺。傳統(tǒng)的Cd²⁺檢測方法，如原子吸收光譜、電感耦合等離子質(zhì)譜、粒子誘發(fā)X射線熒光分析、色譜法和伏安法測試費高，樣品前處理復(fù)雜，測試時間長。

采用熒光的方法來檢測重金屬離子具有簡單方便、靈敏度高、響應(yīng)時間短等優(yōu)點，常常用于快速可視化檢測。然而，目前大多數(shù)的熒光探針只用單一的化學(xué)信號來進行檢測，檢測時，容易受到入射光、探針濃度以及環(huán)境變化的影響，而造成結(jié)果失真，靈敏度下降。近年來，科學(xué)工作者們發(fā)展了比率型探針。比率探針擁有兩個互相獨立的信號，既提高了靈敏度，又實現(xiàn)了自我矯正和可視化識別分析物的功能。有機染料和量子點常常用來提供比率探針的熒光信號，相比于有機染料，量子點具有量子效率高、耐光性好、發(fā)射光譜窄而對稱、吸收光譜寬、尺寸可控等優(yōu)點。因此，在過去的幾年中，基于量子點的比率探針得到了較快的發(fā)展，并常用于檢測金屬離子。

截至目前，有關(guān)鎘離子的比率探針的中國專利報道有(CN102936501A)，該方法是一種“關(guān)/開”模型探針。該探針檢測鎘離子時，無法有效地區(qū)分鋅離子與鎘離子。分子印跡是用來提高選擇性的一種好方法，可以用來特異性識別化合物。分子印跡探針具有穩(wěn)定性好、制備簡單、價格便宜等優(yōu)點，近年來常常用來檢測農(nóng)藥、殺蟲劑、爆炸物等。受此啟發(fā)，為了提高鎘離子檢測的選擇性，我們設(shè)計合成了一種離子印跡探針。據(jù)我們了解，目前還沒有報道過基于離子印跡的量子點比率熒光探針來檢測鎘離子。

(三)

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是克服目前基于量子點的鎘離子探針的不足，提供一種制備簡單，成本低廉，檢測方便，選擇性較好的檢測鎘離子的比率熒光探針，實現(xiàn)對鎘離子的選擇性快速可視化檢測。

本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

本發(fā)明提供一種基于離子印跡的比率熒光探針，所述熒光探針以紅色量子點為核心并包埋于二氧化硅納米粒中，再對二氧化硅納米粒表面進行氨基化修飾，然后再在氨基化修飾后的表面共價偶聯(lián)上綠色量子點，得到基于離子印跡的比率熒光探針。

進一步，優(yōu)選所述紅色量子點為碲化鎘量子點。

進一步，優(yōu)選所述綠色量子點為硒化鎘量子點。

進一步，優(yōu)選所述包埋二氧化硅納米粒的紅色量子點粒徑為40-100nm，優(yōu)選40～60nm。

本發(fā)明還提供一種所述基于離子印跡的比率熒光探針的制備方法，所述方法為：(1)將紅色量子點分散于氨水(質(zhì)量濃度25％)、氫氧化鈉和去離子水中，5～45℃攪拌0.1～1h(優(yōu)選25℃攪拌0.5h)，形成量子點堿溶液；所述紅色量子點與氫氧化鈉質(zhì)量比為1：0.2～1(優(yōu)選1:0.6)，所述氨水體積用量以紅色量子點質(zhì)量計為4～40ml/g(優(yōu)選22ml/g)，去離子水體積用量以紅色量子點質(zhì)量計為500～1000ml/g(優(yōu)選978ml/g)；(2)將環(huán)己烷、正己醇和曲拉通混合并攪拌至透明，然后加入5～20mM聚二烯二丙基氯化銨水溶液及氨水(質(zhì)量濃度25％)，形成微乳體系；所述微乳體系中，環(huán)己烷、正己醇、曲拉通、聚二烯二丙基氯化銨水溶液及氨水的體積終濃度分別為60～90％、6～20％、10～25％、0.01～1％、0.1～1％；(3)將步驟(1)量子點堿溶液加入到步驟(2)微乳體系中，5～45℃攪拌10～60min(優(yōu)選25℃攪拌0.5h)，形成反相微乳體系；然后向反相微乳體系中加入正硅酸四乙酯(TEOS)，接著5～45℃攪拌1～4天(優(yōu)選25℃攪拌2d)后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，繼續(xù)攪拌混合12～24h，離心，沉淀依次用異丙醇、無水乙醇、去離子水洗滌1～2次，得到包埋紅色量子點的二氧化硅納米粒子(即CdTe@SiO₂-NH₂)；所述量子點堿溶液與微乳體系體積比為1：5～30(優(yōu)選1:11.17)；所述正硅酸四乙酯與量子點堿溶液體積比為0.01～2：1(優(yōu)選0.1:1)；所述3-氨丙基三乙氧基硅烷與量子點堿溶液體積比為0.001～0.1：1(優(yōu)選0.01:1)；(4)將步驟(3)制備的包埋紅色量子點的二氧化硅納米粒子分散到去離子水中形成分散液，并加入綠色量子點和pH＝7.0的PB緩沖液，黑暗攪拌8個小時，離心，沉淀用去離子水洗滌，獲得所述基于離子印跡的鎘離子比率熒光探針；所述綠色量子點與包埋紅色量子點的二氧化硅納米粒子質(zhì)量比為0.05～1：1(優(yōu)選0.3:1)，所述PB緩沖液體積用量以包埋紅色量子點的二氧化硅納米粒子質(zhì)量計為10～100ml/g(優(yōu)選38.4ml/g)。

進一步，優(yōu)選步驟(1)所述紅色量子點與氫氧化鈉質(zhì)量比為1：0.6～0.8，所述氨水體積用量以紅色量子點質(zhì)量計為20～25ml/g。

進一步，優(yōu)選步驟(2)所述微乳體系中，環(huán)己烷、正己醇、曲拉通、聚二烯二丙基氯化銨水溶液及氨水的體積終濃度分別為60～70％、15～20％、15～18％、0.2～0.4％、0.5～0.6％。

進一步，優(yōu)選步驟(3)所述量子點堿溶液與微乳體系體積比為1：10～15；所述正硅酸四乙酯與量子點堿溶液體積比為0.1～0.5：1；所述3-氨丙基三乙氧基硅烷與量子點堿溶液體積比為0.01～0.02：1。

進一步，優(yōu)選步驟(4)所述綠色量子點與包埋紅色量子點的二氧化硅納米粒子質(zhì)量比為0.3～0.5：1，所述PB緩沖液體積用量以包埋紅色量子點的二氧化硅納米粒子質(zhì)量計為35～40ml/mg。

此外，本發(fā)明還提供一種所述基于離子印跡的比率熒光探針在檢測鎘離子中的應(yīng)用。具體方法為：200μL濃度區(qū)間0～0.2g/ml的比例探針，pH區(qū)間6.0～10.0的Tris-HCl緩沖液200μL及80μL濃度區(qū)間0～10μM的EDTA水溶液加入取樣管中，加入含有濃度0～30μM的Cd²⁺的水樣，最后用去離子水稀釋到2mL，10分鐘后在與上述相同的檢測條件下進行熒光測試。

為了進一步探究本發(fā)明基于離子印跡的鎘離子比率熒光探針的選擇性，我們在探針的分散液中加入一系列的金屬離子，包括Zn²⁺、Mg²⁺、Ba²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Hg²⁺、Co²⁺、K⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Ag⁺和Mn²⁺，并進行熒光光譜檢測，相比之下，Mg²⁺、Ba²⁺、Ni²⁺、Co²⁺、K⁺、Ca²⁺和Zn²⁺對離子印跡探針的熒光影響不大，Cu²⁺、Hg²⁺、Fe³⁺、Ag⁺、Mn²⁺會造成熒光的猝滅，熒光顏色變成深紅色。因此，我們合成的比率探針仍然能夠選擇性地檢測Cd²⁺。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：

1、利用反相微乳法制備紅光發(fā)射的包埋量子點的二氧化硅納米粒子，相比stober方法，具有更好的分散性，有利于紅光發(fā)射的包埋量子點的二氧化硅納米粒子表面綠色量子點層的構(gòu)建，并將量子點形成堿溶液，進行孵化，提高了熒光性能。

2、采用雙穩(wěn)定的CdSe量子點作為表層量子點，相比傳統(tǒng)的碲化鎘量子點，探針穩(wěn)定性好。

3、相比其它的比率探針，本探針在檢測時，基于量子點的比率型離子印跡來檢測金屬離子，具有相當(dāng)優(yōu)秀的特異性。并且穩(wěn)定性好、制備簡單、價格便宜等優(yōu)點，而且大大縮短了反應(yīng)時間，對鎘離子的檢測低至25nM，對快速可視化檢測提供了方便。

(四)附圖說明

圖1為實施例1中紅光發(fā)射的包埋量子點的二氧化硅納米粒子的TEM圖。

圖2為實施例1中比率探針的TEM圖。

圖3為實施例3中熒光光譜圖。

圖4為實施例3中365nm紫外燈下相應(yīng)的熒光照片，從左至右Cd²⁺濃度依次為0、1、2、3、4、5、6、7、8、9μM。

圖5為實施例4中熒光光譜圖。

圖6為實施例4中365nm紫外燈下相應(yīng)的熒光照片，從左至右依次為空白、10μM的Cd²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Ba²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Hg²⁺、Co²⁺、K⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Ag⁺、Mn²⁺。

(五)具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進行進一步描述，但本發(fā)明的保護范圍并不僅限于此：

本發(fā)明實施例所用聚二丙烯二乙基氯化銨分子量均為100000～200000。

實施例1：

1、紅色量子點的制備

將0.2284g氯化鎘(CdCl₂·2.5H₂O)加入到500mL去離子水中，通氮氣20min，隨后加入0.1mL巰基丙酸，再用1M的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至11.00，然后繼續(xù)加入0.538g檸檬酸鈉(含結(jié)晶水)，0.0444g亞碲酸鈉，0.2g硼氫化鈉，最后進行加熱回流。回流8h后得到發(fā)射紅色熒光的巰基丙酸穩(wěn)定的碲化鎘量子點水溶液(即紅色量子點溶液)，發(fā)射峰在628納米，濃度為4.3×10^-6mol/L。

取4mL已合成的紅色量子點溶液，加入4mL無水乙醇，靜置沉淀，離心，沉淀用無水乙醇洗滌1～2次，獲得碲化鎘紅色量子點3mg。

2、包埋紅色量子點的二氧化硅納米粒子

取1mg紅色量子點分散于0.022ml氨水(25wt％)和0.6mg氫氧化鈉，0.978mL的去離子水中，25℃攪拌30min，即為紅色量子點堿溶液1ml，其中氨水質(zhì)量終濃度為0.6wt％，氫氧化鈉終濃度為15.9mmol/L，紅色量子點終濃度為1mg/ml。取環(huán)己烷7.5mL，正己醇1.8mL，曲拉通1.77mL混合并攪拌形成透明混合溶液，然后在透明混合溶液中加入60μL氨水(25wt％)，40μL濃度為1.78mmol/L的聚二烯二丙基氯化銨水溶液，形成微乳體系11.17ml。然后將紅色量子點堿溶液1ml加入到上述11.17ml微乳體系中，25℃攪拌30min，得到透明的反相微乳體。然后向反相微乳體系中加入100μL正硅酸四乙酯，25℃攪拌兩天后加入10μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，繼續(xù)攪拌24h后離心，沉淀依次用異丙醇、無水乙醇、去離子水洗滌1～2次，得到包埋紅色量子點的二氧化硅納米粒子(即CdTe@SiO₂-NH₂)0.012g，粒徑40～60nm(形貌圖見圖1)。將得到的包埋紅色量子點的二氧化硅納米粒子分散在去離子水中，備用。

3、基于離子印跡的鎘離子比率熒光探針

2mL的CdSe水溶液(來源于5mL CdSe量子點原液加水稀釋，質(zhì)量為0.004g)加入到2mL CdTe@SiO₂-NH₂(13mg)分散液中，接著加入0.5mL pH＝7.0的緩存PB緩沖液，在黑暗條件下攪拌8h。反應(yīng)結(jié)束后，離心，取沉淀并用去離子水洗滌3次，除去多余的量子點，得到1mg/ml的CdTe@SiO₂@CdSe比率探針，365nm紫外燈下，熒光呈綠色(形貌圖見圖2)。最后將得到的CdTe@SiO₂@CdSe納米微球分散在去離子水中，并保存在4℃的冰箱中，備用。

實施例2：

1、紅色量子點的制備

將0.2284g氯化鎘(CdCl₂·2.5H₂O)加入到500mL去離子水中，通氮氣20min，隨后加入0.1mL巰基丙酸，再用1M的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至11.00，然后繼續(xù)加入0.538g檸檬酸鈉(含結(jié)晶水)，0.0444g亞碲酸鈉，0.2g硼氫化鈉，最后進行加熱回流?；亓?h后得到發(fā)射紅色熒光的巰基丙酸穩(wěn)定的碲化鎘量子點水溶液(即紅色量子點溶液)，發(fā)射峰在628納米，濃度為4.3×10^-6mol/L。

取4mL已合成的紅色量子點溶液，加入4mL無水乙醇，靜置沉淀，離心，沉淀用無水乙醇洗滌1～2次，獲得碲化鎘紅色量子點3mg。

2、包埋紅色量子點的二氧化硅納米粒子

取1mg紅色量子點分散于0.022ml氨水(25wt％)和0.8mg氫氧化鈉，0.978mL的去離子水中，25℃攪拌30min，即為紅色量子點堿溶液1ml，其中氨水質(zhì)量終濃度為0.6wt％，氫氧化鈉終濃度為21.2mmol/L，紅色量子點終濃度為1mg/ml。取環(huán)己烷6.8mL，正己醇2.2mL，曲拉通2.0mL混合并攪拌形成透明混合溶液，然后在透明混合溶液中加入60μL氨水(25wt％)，40μL濃度為1.78mmol/L的聚二烯二丙基氯化銨水溶液，形成微乳體系11.1ml。然后將紅色量子點堿溶液1ml加入到上述11.1ml微乳體系中，25℃攪拌30min，得到透明的反相微乳體。然后向反相微乳體系中加入500μL正硅酸四乙酯，25℃攪拌兩天后加入20μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，繼續(xù)攪拌24h后離心，沉淀依次用異丙醇、無水乙醇、去離子水洗滌1～2次，得到包埋紅色量子點的二氧化硅納米粒子(即CdTe@SiO₂-NH₂)0.012g，粒徑40～60nm。將得到的包埋紅色量子點的二氧化硅納米粒子分散在去離子水中，備用。

3、基于離子印跡的鎘離子比率熒光探針

2mL的CdSe水溶液(來源于8mL CdSe量子點原液，質(zhì)量為0.0065g)加入到2mL CdTe@SiO₂-NH₂(13mg)分散液中，接著加入0.5mL pH＝7.0的緩存PB緩沖液，在黑暗條件下攪拌8h。反應(yīng)結(jié)束后，離心，取沉淀并用去離子水洗滌3次，除去多余的量子點，得到1mg/ml的CdTe@SiO₂@CdSe比率探針，365nm紫外燈下，熒光呈綠色。最后將得到的CdTe@SiO₂@CdSe納米微球分散在去離子水中，并保存在4℃的冰箱中，備用。

實施例3：

1、紅色量子點的制備

將0.4568g氯化鎘(CdCl₂·2.5H₂O)加入到500mL去離子水中，通氮氣20min，隨后加入0.2mL巰基丙酸，再用1M的氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)pH至11.00，然后繼續(xù)加入1.076g檸檬酸鈉(含結(jié)晶水)，0.0888g亞碲酸鈉，0.4g硼氫化鈉，最后進行加熱回流。回流8h后得到發(fā)射紅色熒光的巰基丙酸穩(wěn)定的碲化鎘量子點水溶液(即紅色量子點溶液)，發(fā)射峰在628納米，濃度為6.5×10^-6mol/L。

取2mL已合成的紅色量子點溶液，加入2mL無水乙醇，靜置沉淀，離心，沉淀用無水乙醇洗滌1～2次，獲得碲化鎘紅色量子點2.8mg。

2、包埋紅色量子點的二氧化硅納米粒子

取1mg紅色量子點分散于0.025ml氨水(25wt％)和0.6mg氫氧化鈉，0.975mL的去離子水中，25℃攪拌30min，即為紅色量子點堿溶液1ml，其中氨水質(zhì)量終濃度為0.625wt％，氫氧化鈉終濃度為15.9mmol/L，紅色量子點終濃度為1mg/ml。取環(huán)己烷7.8mL，正己醇1.7mL，曲拉通1.7mL混合并攪拌形成透明混合溶液，然后在透明混合溶液中加入60μL氨水(25wt％)，40μL濃度為1.78mmol/L的聚二烯二丙基氯化銨水溶液，形成微乳體系11.3ml。然后將紅色量子點堿溶液1ml加入到上述11.3ml微乳體系中，25℃攪拌30min，得到透明的反相微乳體。然后向反相微乳體系中加入500μL正硅酸四乙酯，25℃攪拌兩天后加入10μL 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，繼續(xù)攪拌24h后離心，沉淀依次用異丙醇、無水乙醇、去離子水洗滌1～2次，得到包埋紅色量子點的二氧化硅納米粒子(即CdTe@SiO₂-NH₂)0.012g，粒徑40～60nm。將得到的包埋紅色量子點的二氧化硅納米粒子分散在去離子水中，備用。

3、基于離子印跡的鎘離子比率熒光探針

2mL的CdSe水溶液(來源于5mL CdSe量子點原液，質(zhì)量為0.004g)加入到2mL CdTe@SiO₂-NH₂(12mg)分散液中，接著加入0.5mL pH＝7.0的緩存PB緩沖液，在黑暗條件下攪拌8h。反應(yīng)結(jié)束后，離心，取沉淀并用去離子水洗滌3次，除去多余的量子點，得到1mg/ml的CdTe@SiO₂@CdSe比率探針，365nm紫外燈下，熒光呈綠色。最后將得到的CdTe@SiO₂@CdSe納米微球分散在去離子水中，并保存在4℃的冰箱中，備用。

實施例4：緩沖液中Cd²⁺的檢測

在取樣管中加入200μL濃度為0.5mg/mL的實施例1制備的比率探針去離子水懸液，200μL濃度為100mM、pH＝9的Tris-HCl緩沖液，以及80μL濃度為0.02mM的EDTA水溶液，接著加入不同終濃度的Cd²⁺(0、1、2、3、4、5、6、7、8、9μM)，最后用去離子水稀釋到2mL，并搖勻。10分鐘后將混合液轉(zhuǎn)移到3mL比色皿中進行熒光檢測，根據(jù)取樣管中顏色的對比，可以判斷不同取樣管中Cd²⁺的濃度，Cd²⁺的濃度越大，熒光越偏向于綠色(熒光圖見圖3，365nm紫外燈下相應(yīng)的熒光照片見圖4)。所有的操作均在室溫下進行，熒光檢測的條件如下：激發(fā)波長為380nm，激發(fā)光和發(fā)射光的狹縫寬度均為3nm，掃描范圍從450nm到740nm。

實施例5：實際水體樣品中Cd²⁺的檢測

為了評估比率探針的實用性，我們用湖水和自來水兩種實際水樣進行Cd²⁺檢測實驗。實驗中所用的湖水取自西湖音樂噴泉南方100米處的岸邊，在實驗前用0.22μm濾頭過濾2次，除去西湖水中的懸浮物。自來水樣品直接從實驗室的水龍頭中獲得，不做任何前處理。實際檢測時，將200μL濃度為0.5mg/mL的實施例1制備的比率探針去離子水懸液，200μL濃度為100mM、pH＝9的Tris-HCl緩沖液，以及80μL濃度為0.02mM的EDTA水溶液加入到取樣管中，然后加入1mL含有不同濃度的Cd²⁺的自來水和西湖水樣品(西湖水樣品在使用之前先過濾掉水中的固體懸浮物，自來水樣在使用前不經(jīng)過任何處理，然后各自加入一定量的Cd²⁺，使樣品含Cd²⁺濃度為2.0、5.0和8.0μM)，最后用去離子水稀釋到2mL，10分鐘后在與上述相同的檢測條件下進行熒光測試，根據(jù)取樣管的熒光顏色，即可判斷Cd²⁺的濃度，Cd²⁺的濃度越大，熒光越偏向于綠色。

實施例6離子印跡比率探針的選擇性

為了進一步探究Cd²⁺印跡比率探針的選擇性，我們在探針的分散液中加入一系列的金屬離子，包括Zn²⁺、Mg²⁺、Ba²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Hg²⁺、Co²⁺、K⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Ag⁺和Mn²⁺，并通過熒光光譜，記錄下熒光比率的變化情況。

取14只取樣管，在取樣管中分別加入200μL濃度為0.5mg/mL的實施例1制備的比率探針去離子水懸液，0.01M、pH9.0的Tris-HCl緩沖液和80μL濃度為0.02mM的EDTA水溶液，接著以第一只取樣管為空白對照，其他取樣管中分別加入金屬離子終濃度依次為10μM的Cd²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Ba²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Hg²⁺、Co²⁺、K⁺、Ca²⁺、Fe³⁺、Ag⁺、Mn²⁺，最后用去離子水稀釋到2mL，并搖勻。10分鐘后將混合液轉(zhuǎn)移到3mL的比色皿中進行熒光檢測(熒光光譜圖見圖5，365nm紫外燈下相應(yīng)的熒光照片見圖6)，通過相應(yīng)的熒光照片，可以看出只有加了Cd²⁺的樣品，熒光才由紅色變到綠色，也相應(yīng)證明了該離子印跡比率探針對Cd²⁺的選擇性。