本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種尿嘧啶化的吲哚七甲川花菁染料及其制備方法，該吲哚七甲川花菁染料可用于細(xì)胞線粒體Hg²⁺的檢測(cè)。

背景技術(shù)：

汞是一種對(duì)人體具有很強(qiáng)毒性的環(huán)境污染物。其中二價(jià)汞離子(Hg²⁺)是其毒性的主要形式，它可以在某些水生生物中累積，隨著其它的食肉動(dòng)物的食用而進(jìn)入食物鏈。Hg²⁺一旦被人體攝入，迅速地被分布到各個(gè)組織和器官，其中細(xì)胞中的線粒體是Hg²⁺的主要積累部位。Hg²⁺降低了線粒體膜電位，與多種蛋白發(fā)生結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。近年來，國(guó)內(nèi)外發(fā)展了各種高靈敏度、高選擇性的Hg²⁺檢測(cè)方法，如紫外吸收光度法、紅外分析法、電化學(xué)法等。但是據(jù)我們所知，在這些檢測(cè)方法中，基于細(xì)胞器定位的Hg²⁺熒光探針僅有兩篇。

吲哚七甲川菁染料是一種傳統(tǒng)的有機(jī)染料，其特點(diǎn)是其最大吸收和發(fā)射波長(zhǎng)在近紅外區(qū)(700-900nm)，可用于熒光標(biāo)記和金屬離子檢測(cè)，包括Hg²⁺。然而據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研，該類染料用于細(xì)胞線粒體Hg²⁺的檢測(cè)還未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種尿嘧啶化的吲哚七甲川菁染料及制備方法和應(yīng)用。所述吲哚七甲川菁染料可用于制備檢測(cè)細(xì)胞中線粒體中Hg²⁺濃度的試劑盒中的熒光探針，該探針具有線粒體靶向、近紅外光吸收、熒光顯影與特異性接合Hg²⁺的特點(diǎn)。

實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案：

一種尿嘧啶化的吲哚七甲川菁染料，有以下結(jié)構(gòu)：

其中，R為H或F,當(dāng)R為H時(shí)，所示結(jié)構(gòu)為IR-DT；當(dāng)R為F時(shí)，所示結(jié)構(gòu)為IR-DFT。。

尿嘧啶化的吲哚七甲川菁染料制備方法，有以下步驟：

(1)N,N-二甲基甲酰胺(DMF)為反應(yīng)試劑和溶劑，環(huán)己酮與三氯氧磷(POCl₃)發(fā)生Vilsmeimer-Haack甲?；磻?yīng)，反應(yīng)6小時(shí)后，反應(yīng)液經(jīng)異丙醚沉淀，抽濾，濾餅經(jīng)有機(jī)溶劑A重結(jié)晶后得化合物3；

(2)六甲基二硅胺(HMDS)為反應(yīng)溶劑，在126℃下，尿嘧啶或氟尿嘧啶與三甲基氯硅烷(TMSCl)反應(yīng)5h，得到羰基被硅基保護(hù)的中間體，直接減壓濃縮除去六甲基二硅胺；接著，硅基保護(hù)的尿嘧啶或氟尿嘧啶中間體與1,3-二溴丙烷發(fā)生單取代反應(yīng)，反應(yīng)液經(jīng)過水洗、氯仿萃取、無水硫酸鎂干燥、抽濾、濃縮，柱分離純化得末端溴代的化合物(1a，1b)；

(3)乙腈為溶劑，將步驟(2)所得末端溴代化合物(1a，1b)與2,3,3-三甲基3H吲哚發(fā)生鹵代烴反應(yīng)，制得含N-嘧啶基團(tuán)側(cè)鏈的2,3,3-三甲基3H吲哚季銨鹽(2a，2b)，經(jīng)有機(jī)溶劑B沉淀、抽濾、干燥后直接進(jìn)行步驟(4)；

(4)無水乙醇為有機(jī)溶劑，在無水醋酸鈉催化下，雙醛氯代環(huán)己烯中間體3與含有N-嘧啶基團(tuán)側(cè)鏈的2,3,3-三甲基3H吲哚季銨鹽(2a，2b)縮合反應(yīng)，經(jīng)硅膠柱層析、有機(jī)溶劑C重結(jié)晶得純品(IR-DT，IR-DFT)。

步驟(1)中所述其中環(huán)己酮：POCl₃：DMF的摩爾比是1：4：5。

步驟(2)中所述單取代反應(yīng)條件：105℃加熱，反應(yīng)時(shí)間為2h。

步驟(3)中所述鹵代烴反應(yīng)條件：在氬氣保護(hù)下，81℃加熱回流，反應(yīng)23h。

步驟(1)所述有機(jī)溶劑A為甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯的任意一種或幾種組合的混合溶劑；步驟(3)所述有機(jī)溶劑B為乙醚、異丙醚或二甲醚的任意一種；步驟(4)中有機(jī)溶劑C為乙醇、甲醇、正丁醇或甲苯中的一種或幾種的混合溶劑。

步驟(4)所述縮合反應(yīng)溫度為85℃。

步驟(4)所述雙醛氯代環(huán)己烯中間體3與含有N-嘧啶基團(tuán)側(cè)鏈的2,3,3-三甲基3H吲哚季銨鹽(2a，2b)的摩爾比為1:2。

上述尿嘧啶化的吲哚七甲川菁染料在制備檢測(cè)細(xì)胞中線粒體中Hg²⁺濃度的試劑盒中的應(yīng)用。

所述應(yīng)用是尿嘧啶化的吲哚七甲川菁染料作為近紅外熒光探針，其發(fā)射波長(zhǎng)為700－900nm。

所述尿嘧啶化的吲哚七甲川花菁染料分子具有近紅外熒光成像、細(xì)胞線粒體靶向蓄積和特異性檢測(cè)Hg²⁺作用，可用于制備檢測(cè)細(xì)胞中線粒體中Hg²⁺濃度的試劑盒中的熒光探針。

所述細(xì)胞線粒體中Hg²⁺檢測(cè)，是指以細(xì)胞線粒體Hg²⁺為靶標(biāo)，在700-900nm的單光源激光照射下，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞線粒體Hg²⁺濃度的檢測(cè)。

本發(fā)明所述尿嘧啶化的吲哚七甲川花菁染料是含有不同末端官能團(tuán)的N-烷基側(cè)鏈的小分子，具有近紅外熒光、細(xì)胞線粒體靶向蓄積、特異性檢測(cè)Hg²⁺等多功能活性。申請(qǐng)人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所制備的尿嘧啶化的吲哚七甲川花菁染料，可用于細(xì)胞線粒體中Hg²⁺濃度的檢測(cè)。

申請(qǐng)人前期合成了一系列的吲哚七甲川花菁染料，其具有良好的細(xì)胞線粒體聚集的特點(diǎn)，相關(guān)的構(gòu)效關(guān)系研究也表明適宜的親脂性陽(yáng)離子結(jié)構(gòu)是其具有線粒體定位的主要原因。另外，嘧啶類汞離子比色傳感器的特點(diǎn)是能高選擇性地與Hg²⁺配位，形成穩(wěn)定的T-Hg-T絡(luò)合物。據(jù)此，將含有嘧啶結(jié)構(gòu)的尿嘧啶功能基團(tuán)引入至這類線粒體靶向的吲哚七甲川花菁染料，可特異性地結(jié)合線粒體中的Hg²⁺，通過誘導(dǎo)分子內(nèi)聚集，導(dǎo)致花菁分子的熒光強(qiáng)度改變，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)線粒體中的Hg²⁺的檢測(cè)。本發(fā)明采用尿嘧啶化結(jié)構(gòu)，通過分子內(nèi)F-F鍵、F-H鍵，促進(jìn)T-Hg-T絡(luò)合物形成和加劇分子內(nèi)聚集，進(jìn)一步提高對(duì)汞離子檢測(cè)的靈敏度。

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件或按照制造廠商所建議的條件。

附圖說明

圖1為IR-DT(a)及IR-DFT(b)對(duì)不同金屬離子的熒光淬滅程度；

圖2為IR-DT(a)及IR-DFT(b)對(duì)不同Hg²⁺濃度的檢測(cè)；

圖3為IR-DFT共聚焦定位實(shí)驗(yàn)圖(a)和對(duì)細(xì)胞線粒體中不同濃度Hg2+的熒光成像(b)。

具體實(shí)施例

實(shí)施例中所采用的試劑：

所述試劑和溶劑均采用市售的分析純，其中試劑二氯甲烷、甲醇、乙醇、N,N-二甲基甲酰胺、三氯氧磷、三乙胺需經(jīng)過蒸餾純化與干燥處理。

實(shí)施例中所采用的儀器和設(shè)備：

所有反應(yīng)均以薄層層析跟蹤，使用煙臺(tái)市芝罘黃務(wù)硅膠開發(fā)試驗(yàn)廠所生產(chǎn)的高效薄層層析硅膠板(型號(hào)CF-254)，磷鉬酸、茚三酮、溴甲酚綠或碘顯色。

柱層析用煙臺(tái)市芝罘黃務(wù)硅膠開發(fā)試驗(yàn)廠生產(chǎn)的層析硅膠(10－40μ)，層析用有機(jī)溶劑均為分析純，且經(jīng)過重蒸干燥處理。熔點(diǎn)用上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)的WRR熔點(diǎn)儀測(cè)定。

所有化合物¹HNMR和¹³CNMR由美國(guó)Varian公司生產(chǎn)的MercuryPlus-400核磁共振譜儀測(cè)定，TMS作內(nèi)標(biāo)，未經(jīng)特殊說明，均用CDCl₃作溶劑，δ值單位為ppm。

質(zhì)譜由HP5989A型質(zhì)譜儀測(cè)定，IR由Testscan SchimadzuFTIR 8000series測(cè)定。

實(shí)施例1雙醛氯代環(huán)己烯(2-氯-3-羥甲烯-1-甲?；h(huán)己烯)的制備

將向盛有60ml無水DMF的反應(yīng)器中，攪拌下緩慢滴入20ml POCl₃，并控制內(nèi)溫不高于5℃。滴畢后加入5ml環(huán)己酮，控制內(nèi)溫不超過10℃。滴畢，油欲加熱使內(nèi)溫升至80℃，并攪拌反應(yīng)3.5h。停止反應(yīng)，反應(yīng)液傾至水中，攪拌3h后.大量黃色固體析出，抽濾，濾餅用冷水洗至中性。粗品用乙酸乙酯精制得黃色粒狀晶體5.2g,收率65.3％,。避光低溫(4℃)保存。熔點(diǎn)：130-131℃(文獻(xiàn)熔點(diǎn)：130-131℃)薄層層析檢測(cè)：環(huán)己烷：乙酸乙酯(3：1)，Rf值約為0.4。UV(甲醇)：λmax＝408nm[OHC-C＝C]；

¹H NMR(400MHz,DMSO-d):10.85(s,1H),3.35(s,2H),2.36-2.34(t,J＝8Hz,4H),1.57(m,2H).MS(ESI+):173.1(M+H⁺)calcd exactMass:172.03。

實(shí)施例2 1-(3-溴丙基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮(化合物1)的制備

向50mL的反應(yīng)瓶中加入12.0mmol尿嘧啶或氟尿嘧啶，氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入六甲基二硅胺(HMDS，48.0mmol)及0.25mL三甲基氯硅烷，完畢后于126℃下加熱攪拌反應(yīng)。5h后，直接減壓濃縮除去溶劑。殘留物加入10mL1,3-二溴丙烷，于105℃下加熱攪拌反應(yīng)。5h后直接減壓濃縮，殘留物用二氯甲烷溶解，水洗，飽和食鹽水洗滌，分液，有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥，抽濾，濃縮，柱分離純化(洗脫條件：CH₂Cl₂/CH₃OH＝50/1)得化合物1a或1b。

1a(82％):¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ11.352(s,1H),7.47-7.45(d,J＝8Hz,1H),7.27-7.26(d,J＝8Hz,1H),7.04-6.98(m,2H),6.88-6.85(m,1H),5.77-5.75(d,J＝8Hz,1H),1.63-1.58(m,2H),1.42(s,3H),1.32-1.28(t,J＝6Hz,1H),1.24(s,6H)；

1b(76％):¹H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.41(s,1H),4.09(t,J＝2.4Hz,4H),3.39(t,J＝2.4Hz,2H),2.86(m,2H).

實(shí)施例3N-胸腺嘧啶吲哚季銨溴鹽(2a、2b)的制備

取25mL的反應(yīng)瓶(含冷凝回流裝置)，加入化合物1a或1b(1.83mmol)，吲哚(3.66mmol)。氮?dú)獗Ｗo(hù)，加入無水乙腈(6mL)溶解，于81℃下加熱攪拌反應(yīng)。22h后停止反應(yīng)，反應(yīng)液冷卻至室溫后，直接減壓得暗紅色粘稠物。將該粘稠物用異丙醚洗滌，干燥得目標(biāo)化合物粗品(2a、2b)。不需進(jìn)一步純化即可進(jìn)行下一步反應(yīng)。

實(shí)施例4N-嘧啶基團(tuán)側(cè)鏈的熒光探針(IR-DT、IR-DFT)的合成

25mL反應(yīng)瓶中加入500mg吲哚季銨鹽(0.71mmol),0.31mmol縮合劑(實(shí)施例1產(chǎn)物)，及0.71mmol乙酸鈉。以無水乙醇(10mL)作溶劑，于80℃下加熱回流反應(yīng)。2h后反應(yīng)液冷至室溫，減壓蒸餾除去溶劑得暗紅色粘稠物，經(jīng)硅膠柱層析純化的墨綠色固體。

IR-DT(38％):¹H NMR(600MHz,DMSO-d)δ11.27(s,2H),8.24-8.22(d,J＝12Hz,2H),7.69-7.68(d,J＝6Hz,2H),7.62-7.61(d,J＝6Hz,2H),7.46-7.40(m,4H),7.28-7.26(t,J＝6Hz,2H),6.23-6.21(d,J＝12Hz,2H),5.57-5.56(s,J-6Hz,2H),4.23(m,4H),3.82-3.80(t,J＝6Hz,4H),2.64(m,4H),2.03(m,2H),1.84-1.82(m,2H),1.65(s,12H).MS(ESI+):759.4(M-Br)calcd exactMass:759.3

IR-DFT(30％):¹H NMR(400MHz,DMSO-d):δ8.70-8.66(d,J＝16Hz,2H),8.58-8.56(d,J＝8Hz,2H),8.07-8.05(d,J＝8Hz,2H),7.92-7.84(m,4H),7.74-7.70(t,J＝8Hz,2H),6.69-6.66(d,J＝12Hz,2H),4.70-4.66(m,4H),4.24-4.21(t,J＝6Hz,4H),3.82(s,2H),3.09(s,6H),2.10(s,12H).¹³C NMR(400MHz,DMSO-d6):δ174.223,172.180,171.925,147.948,147.930,142.004,141.021,128.598,126.156,125.134,122.478,111.489,101.573,48.945,43.629,33.402,27.434,26.680,25.788,25.597,24.123,20.971,and 20.339.¹⁹F NMR(400MHz,DMSO-d6):δ-168.73ppm.HRMS:795.32(M-Br)calcd exactMass:795.3.

實(shí)施例5化合物IR-DT、IR-DFT的近紅外熒光特性

在萬分之一天平上精確稱量樣品，配成10mM的DMSO溶液，備用。測(cè)試時(shí)，先用精密移液槍取2μL此溶液于10mL棕色容量瓶中，然后分別用甲醇和血清稀釋至刻度，即得到2μM的染料溶液。最大吸收光譜和發(fā)射光譜分別用Shimadzu UV-3600紫外近紅外分光光度計(jì)和Varian Cary Eclipse Fluorometer熒光光譜儀測(cè)定。用朗伯-比爾定律計(jì)算化合物的摩爾吸光系數(shù)。計(jì)算公式為A＝εab，式中A代表吸收強(qiáng)度，ε表示摩爾消光系數(shù)，a為化合物的濃度(單位為mol/L)，b為石英池的厚度(單位為cm)。測(cè)試結(jié)果表明，所有化合物的最大吸收波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)均在近紅外區(qū)(780-820nm)，摩爾吸光系數(shù)在99000-300000，具有較優(yōu)良的近紅外熒光特性。

實(shí)施例6化合物IR-DT、IR-DFT的特異性結(jié)合Hg²⁺

分別稱取一定量的AlCl₃，CoCl₂，Pb(CH₃COO)₂，KCl，MnSO₄，LiCl，ZnCl₂，CaCl₂，F(xiàn)eCl₂，MgSO₄，Cu(NO)₂，NaCl，HgSO₄，用超純水配成10mM的溶液。稱取一定量的檸檬酸三鈉，配成10mM的水溶液，同時(shí)調(diào)節(jié)pH到6.65，在檸檬酸三鈉的緩沖液中加入5％的無水甲醇，用此溶液將IR-DT或IR-DFT的濃度配成10uM，分別加入不同的金屬離子，使金屬離子的終濃度為10uM，分別用熒光光譜儀測(cè)量溶液的發(fā)射光譜。并用不同離子的淬滅系數(shù)(1-F0/F)表示IR-DT或IR-DFT對(duì)Hg²⁺的特異性結(jié)合能力(參見圖1)。其中，F(xiàn)₀和F分別為染料加金屬離子前和后，發(fā)射波長(zhǎng)為800nm時(shí)的熒光強(qiáng)度。其結(jié)果表明IR-DT和IR-DFT對(duì)Hg²⁺都有很好的特異性結(jié)合能力。

實(shí)施例7化合物IR-DFT對(duì)不同Hg²⁺濃度熒光強(qiáng)度變化

稱取一定量的檸檬酸三鈉，配成10mM的水溶液，同時(shí)調(diào)節(jié)pH到6.65，在檸檬酸三鈉的緩沖液中加入5％的無水甲醇，用此溶液將IR-DT或IR-DFT的濃度配成10uM，分別加入不同量的Hg²⁺溶液，使Hg²⁺的濃度分別為0uM，0.32uM，0.63uM,1.25uM，2.5uM，5uM，10uM，20uM，40uM，分別用熒光光譜儀測(cè)量溶液的發(fā)射光譜。其結(jié)果表明當(dāng)染料濃度為一定時(shí)，其熒光強(qiáng)度(發(fā)射波長(zhǎng)為800nm)隨Hg²⁺濃度的增加而下降，且在一定范圍內(nèi)具有很好的線性關(guān)系(參見圖2)。

實(shí)施例8IR-DFT共聚焦定位實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞線粒體中不同濃度的Hg²⁺熒光成像

細(xì)胞株選用人乳腺癌癌細(xì)胞株MCF-7(購(gòu)自美國(guó)ATCC公司)，以含10％胎牛血清和1％青霉素/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基于37℃，5％CO₂條件下培養(yǎng)，隔天更換一次培養(yǎng)液。取生長(zhǎng)良好，達(dá)70-80％融合的細(xì)胞，消化離心后接種于35mm共聚焦顯微鏡觀察用的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過夜。次日棄去培養(yǎng)基，于培養(yǎng)皿中分別加入濃度為5μM、體積為1ml的IR-DFT，于37℃，5％CO₂條件下孵育2小時(shí)。棄去染液，以PBS緩沖液漂洗三次，以濃度為1:6000的線粒體探針Mito-traker孵育細(xì)胞，作用15分鐘。棄去染液，以PBS緩沖液漂洗三次后于共聚焦顯微鏡下觀察IR-DFT的熒光信號(hào)與Mito-traker的熒光信號(hào)的重疊情況(參見圖3a)。為了獲得MCF-7細(xì)胞在加Hg²⁺和不加Hg²⁺時(shí)的熒光成像，我們將培育好的含IR-DFT(10uM)細(xì)胞分別加或不加Hg²⁺(10uM)，并在37℃的培養(yǎng)基中繼續(xù)孵育1h，棄去染液，以PBS緩沖液漂洗三次后于共聚焦顯微鏡下觀察IR-DFT的熒光信號(hào)強(qiáng)度的變化(參見圖3b)。結(jié)果表明，IR-DF在體外培養(yǎng)條件下可被活體細(xì)胞高效攝取，顯示出很強(qiáng)的紅色熒光信號(hào)；紅色熒光信號(hào)可與來自線粒體的綠色熒光信號(hào)完全重合，證實(shí)化合物進(jìn)入細(xì)胞后，主要分布于細(xì)胞線粒體內(nèi)；另一方面，IR-DFT對(duì)細(xì)胞線粒體中不同濃度的Hg²⁺顯示了不同強(qiáng)度的熒光成像，且其淬滅的熒光強(qiáng)度可在加入EDTA后恢復(fù)。