本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種熒光標(biāo)記的糖分子及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

糖類化合物尤其是多糖由于結(jié)構(gòu)復(fù)雜，沒有特定的紫外吸收光譜，使得糖類藥物的微量檢測成為難點，進而限制了糖類分子體內(nèi)藥代動力學(xué)研究并成為糖藥物開發(fā)的瓶頸。傳統(tǒng)的糖類藥物代謝動力學(xué)研究方法有同位素標(biāo)記法、免疫學(xué)法、色譜分析法等，由于過程繁瑣，靈敏度低，結(jié)果重復(fù)性差而受到限制。

熒光標(biāo)記及活體成像檢測技術(shù)由于靈敏度高，檢測結(jié)果直觀，已廣泛用于生命科學(xué)研究及藥物開發(fā)中。研究表明，cy7可對姜黃素進行熒光標(biāo)記，并利用活體成像技術(shù)對姜黃素在小鼠體內(nèi)分布情況進行實時檢測，表明該技術(shù)可對姜黃素在小鼠體內(nèi)代謝進行研究(孫永等，南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2011，27(6):539-541)。但是，對于糖類化合物是否能采用類似技術(shù)進行熒光標(biāo)記，并研究其在活體內(nèi)的藥代動力學(xué)特點及組織和器官分布尚無專利或文獻報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對糖類分子體內(nèi)代謝和組織器官分布研究方法不靈敏問題，本發(fā)明的目的在于提供一種熒光標(biāo)記的糖分子及其制備方法和應(yīng)用，本發(fā)明為糖類分子提供了簡單的熒光標(biāo)記技術(shù)，并利用活體成像技術(shù)檢測熒光標(biāo)記糖分子在活體動物體內(nèi)的代謝動力學(xué)及組織器官分布，彌補了現(xiàn)有技術(shù)存在的不足之處。所提供的熒光標(biāo)記及純化方法簡單，效率高，熒光信號強，檢測靈敏度高，并且結(jié)果直觀可視性好，尤其是對于未知結(jié)構(gòu)的糖分子代謝研究更具有明顯的優(yōu)勢，易在糖類藥物開發(fā)及臨床研究中應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

本發(fā)明提供了一種熒光標(biāo)記的糖分子，所述熒光標(biāo)記的糖分子經(jīng)過如下標(biāo)記過程獲得：

其中所述r為多糖、低聚糖、寡糖或糖衍生物分子，n=2-10，所述熒光分子為n-羥基琥珀酰亞胺酯活化的花青染料cy3、cy5和cy7中的至少一種。

本發(fā)明還提供了所述的熒光標(biāo)記的糖分子的制備方法，它包括以下步驟：

(1)還原胺化：將糖分子溶解在含有二氨基試劑的乙酸溶液中，再加入還原劑，形成反應(yīng)體系，攪拌反應(yīng)5h～24h，反應(yīng)結(jié)束后用1kda～10kda透析袋透析，透析液減壓濃縮后冷凍干燥，得到糖分子還原胺化產(chǎn)物；

(2)熒光標(biāo)記：將步驟(1)糖分子還原胺化產(chǎn)物用磷酸鹽緩沖液溶解后加入熒光標(biāo)記試劑形成總反應(yīng)溶液，避光反應(yīng)，對糖分子進行熒光標(biāo)記，獲得所述熒光標(biāo)記的糖分子。

進一步的：所述步驟(1)中二氨基試劑為1,5-戊二胺、1,6-己二胺、1,7-庚二胺、1,8-辛二胺、1,9-辛二胺和1,10-壬二胺中的至少一種，所述二氨基試劑在反應(yīng)體系中的摩爾濃度為糖分子在反應(yīng)體系中摩爾濃度的10～200倍。

進一步的：所述步驟(1)中加入的還原劑為硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉、硼氫化鋰、三甲胺硼烷、三乙胺硼烷、嗎啉硼烷和4-甲基嗎啉硼烷中的至少一種，所述還原劑在反應(yīng)體系中的摩爾濃度為糖分子在反應(yīng)體系中摩爾濃度的10～200倍。

進一步的：所述步驟(2)中熒光標(biāo)記試劑在總反應(yīng)溶液的最終摩爾濃度為糖分子在總反應(yīng)溶液摩爾濃度的2～10倍。

進一步的：將步驟(2)所述熒光標(biāo)記的糖分子進行如下純化步驟：取所述熒光標(biāo)記的糖分子用凝膠色譜柱純化，以蒸餾水為流動相，收集示差檢測器和熒光檢測器重合的檢測信號峰，減壓濃縮干燥，得純化后的熒光標(biāo)記的糖分子。

進一步的：所述凝膠色譜柱填料為sephadexg-10、sephadexg-15、sephadexg-25或biogelp2、p4、p6。

本發(fā)明還提供了所述的熒光標(biāo)記的糖分子在制備用于檢測糖分子在體內(nèi)代謝的檢測劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明還提供了所述的熒光標(biāo)記的糖分子在制備用于檢測糖分子在組織器官中分布的檢測劑中的應(yīng)用。

進一步的：所述熒光標(biāo)記的糖分子的檢測時間為0.01～24h。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點及積極效果是：本發(fā)明提供的糖分子的熒光標(biāo)記技術(shù)操作簡單，適用于任一具有還原端的多糖、低聚糖、寡糖及其衍生物分子，具有普遍適用性，且標(biāo)記產(chǎn)物純度高，標(biāo)記后保持分子原型。本發(fā)明制備的熒光標(biāo)記糖分子經(jīng)動物活體成像技術(shù)檢測在動物體內(nèi)的組織及器官分布證實具有熒光信號強，檢測靈敏度高，可視性強等優(yōu)點，容易說明糖分子在動物體內(nèi)的代謝時間及代謝類型、組織及器官分布特點，為糖類藥物活體代謝研究提供了新的途徑，在糖藥物的開發(fā)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

結(jié)合附圖閱讀本發(fā)明的具體實施方式后，本發(fā)明的其它優(yōu)點和特點將變得更加清晰。

附圖說明

圖1為本發(fā)明低聚褐藻淀粉還原胺化產(chǎn)物高效薄層硅膠層析分析圖，其中a、己二胺；b、還原胺化產(chǎn)物；c、熒光標(biāo)記產(chǎn)物。

圖2為本發(fā)明熒光標(biāo)記的低聚褐藻淀粉純化與高效液相色譜分析圖。

圖3為本發(fā)明低聚褐藻淀粉還原胺化及熒光標(biāo)記產(chǎn)物分子量分析圖。

圖4為本發(fā)明熒光標(biāo)記低聚褐藻淀粉在小鼠體內(nèi)不同時間的組織器官分布圖。

圖5為本發(fā)明熒光標(biāo)記灰樹花多糖在小鼠體內(nèi)不同時間的組織器官分布圖。

圖6位本發(fā)明熒光標(biāo)記的灰樹花多糖在小鼠器官的分布圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明的技術(shù)方案做進一步的詳細(xì)說明。

本發(fā)明采用還原胺化的方法在糖分子還原端引入含氨基分子，再與含羧基熒光試劑偶聯(lián)，獲得熒光標(biāo)記糖分子。具體標(biāo)記過程如下所示：

其中所述r為具有還原端的多糖、低聚糖、寡糖或糖衍生物分子，所述n=2-10，所述熒光分子為n-羥基琥珀酰亞胺酯活化的花青染料cy3、cy5和cy7中的至少一種。

實施例1：低聚褐藻淀粉的熒光標(biāo)記

1、取100mg低聚褐藻淀粉溶解在5ml含有2mol/l1,6-己二胺的5%-20%（體積比）乙酸溶液中，再加入5ml4mol/l氰基硼氫化鈉攪拌反應(yīng)5h，反應(yīng)結(jié)束后用3kda透析袋透析24h，透析內(nèi)液經(jīng)減壓濃縮后冷凍干燥得低聚褐藻淀粉還原胺化產(chǎn)物。

2、取步驟1的還原胺化產(chǎn)物1mg，加入0.1ml蒸餾水溶解，分別取0.2μl溶液分別點在2塊高效薄層硅膠板上，在正丙醇/h2o=3/1(體積/體積)的體系中層析，層析結(jié)束后分別用茚三酮(0.2%茚三酮乙醇溶液)和苯胺-二苯胺液顯色，兩種顯色方法均呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，表明還原胺化成功。

3、取步驟1所述的還原胺化產(chǎn)物用ph7.2磷酸鹽緩沖液溶解，加入占低聚褐藻淀粉還原胺化產(chǎn)物3倍摩爾質(zhì)量的n-羥基琥珀酰亞胺活化的cy7，在37℃恒溫?fù)u床中避光反應(yīng)12h，反應(yīng)結(jié)束后對產(chǎn)物進行冷凍干燥，獲得熒光標(biāo)記的低聚褐藻淀粉。

4、取步驟3所述熒光標(biāo)記的低聚褐藻淀粉用2ml蒸餾水溶解，用sephadexg-10凝膠凝膠色譜柱純化，以蒸餾水為流動相，示差檢測器和熒光檢測器同時檢測，收集示差檢測器和熒光檢測器重合的檢測信號峰，減壓濃縮干燥，得純化后的熒光標(biāo)記的低聚褐藻淀粉。

5、取步驟1所述的低聚褐藻淀粉及其還原胺化產(chǎn)物，以及步驟4所述熒光標(biāo)記產(chǎn)物進行分子量分析，色譜柱為ohpaksb-802hq凝膠色譜柱，以0.1mol/l硫酸鈉水溶液為流動相，采用示差檢測器-多角激光散射儀聯(lián)用在線檢測，計算多糖標(biāo)記過程中的重均分子量(mw)和數(shù)均分子量(mn)。

本實施例所述的1,6-己二胺可改用1,5-戊二胺、1,7-庚二胺，1,8-辛二胺，1,9-辛二胺或1,10-壬二胺。所述的氰基硼氫化鈉可改用硼氫化鈉、硼氫化鋰、三甲胺硼烷、三乙胺硼烷、嗎啉硼烷或4-甲基嗎啉硼烷。所述的n-羥基琥珀酰亞胺活化cy7可改用n-羥基琥珀酰亞胺酯活化的cy3、cy5或其它可用于動物成像檢測的熒光試劑。所述的純化用凝膠色譜柱填料可改用sephadexg-15、sephadexg-25或biogelp2、p4、p6。所述分子量測定用的凝膠色譜柱可改用ohpaksb-802.5hq、ohpaksb-804hq、ohpaksb-806hq、tsk-gelg3000pw/g3000pwxl或splaquagel-ohmixed中的一種或兩種串聯(lián)。

本發(fā)明利用糖分子還原端通過還原胺化反應(yīng)與二氨基化合物反應(yīng)引入游離氨基，進一步通過氨基與熒光試劑分子中的羧基發(fā)生縮合反應(yīng)，從而將熒光分子引入糖分子實現(xiàn)糖分子的熒光標(biāo)記，由于反應(yīng)產(chǎn)物水溶性強，可以通過透析對還原胺化產(chǎn)物進行純化，利用凝膠柱層析對熒光標(biāo)記多糖進行純化和檢測，反應(yīng)效率高，操作簡單。

本發(fā)明中低聚褐藻淀粉還原胺化產(chǎn)物高效薄層色譜檢測圖如圖1所示。其中，采用苯胺-二苯胺對糖顯色時，低聚褐藻淀粉和其還原胺化產(chǎn)物均呈陽性反應(yīng)，而采用茚三酮顯色時，還原胺化產(chǎn)物顯色呈陽性反應(yīng)，表明分子中成功引入了氨基基團，同時以己二胺為對照，表明采用的透析技術(shù)可以成功的除去反應(yīng)中多余的己二胺。

本發(fā)明中低聚褐藻淀粉熒光標(biāo)記產(chǎn)物純化及檢測圖如圖2所示。其中，示差檢測器信號只出現(xiàn)產(chǎn)物熒光標(biāo)記多糖的信號，雖然糖分子中熒光標(biāo)記物的含量較少，但熒光檢測器可以同時檢測到熒光標(biāo)記糖分子與殘留的熒光試劑信號，說明通過sephadexg-10柱可以成功的將熒光標(biāo)記低聚褐藻淀粉與殘留的熒光試劑及其它雜質(zhì)去除。根據(jù)色譜圖中出峰的順序?qū)Ξa(chǎn)物進行回收，凍干后可獲得目標(biāo)產(chǎn)物熒光標(biāo)記低聚褐藻淀粉。

本發(fā)明中低聚褐藻淀粉熒光標(biāo)記過程中分子量分析圖如圖3所示。其中，低聚褐藻淀粉、其還原胺化產(chǎn)物及熒光標(biāo)記低聚褐藻淀粉的激光檢測器信號和示差檢測器信號重疊性好，表明低聚褐藻淀粉在標(biāo)記過程中未發(fā)生降解，保持了分子原型。

本發(fā)明中低聚褐藻淀粉熒光標(biāo)記過程中分子量測定結(jié)果如表1所示。低聚褐藻淀粉分子量為5.54kda，分散指數(shù)為1.15，還原胺化產(chǎn)物的分子量為5.83kda，分散指數(shù)為1.15，熒光標(biāo)記低聚褐藻淀粉分子量為6.23kda，分散指數(shù)為1.16，表明標(biāo)記過程中分子量有少量增加，這是由于引入含有氨基的連接臂和熒光分子的緣故，由于分散指數(shù)未發(fā)生明顯的變化，進一步表明本發(fā)明方法標(biāo)記過程中糖分子未發(fā)生降解，保持了分子原型，適合糖類分子的熒光標(biāo)記。

表1熒光標(biāo)記過程中糖分子量及分子量分散指數(shù)

實施例2：熒光標(biāo)記的低聚褐藻淀粉在檢測糖分子代謝動力學(xué)和組織及器官分布中的應(yīng)用

1、將所述熒光標(biāo)記的低聚褐藻淀粉用生理鹽水配制為1mg/ml溶液，生理鹽水作為空白組，按照0.1ml/10g體重劑量裸鼠尾靜脈注射。

2、步驟1注射后分別于0、0.5、1、2、4和8h麻醉實驗鼠，使用小動物活體成像系統(tǒng)對各實驗組受試藥在小鼠體內(nèi)的組織分布情況進行觀察，分別拍照記錄裸鼠腹部和背部不同時間的熒光信號。

本發(fā)明中熒光標(biāo)記的低聚褐藻淀粉不同時間在實驗鼠體內(nèi)分布情況如圖4所示，從圖4可以看出標(biāo)記的糖分子靜脈注射進入小鼠體內(nèi)后，0.5h~8h內(nèi)均可以檢測到熒光信號，0.5h時主要分布于肺部和腎臟，隨著作用時間的增加，在1h~2h時逐漸向腎臟和膀胱聚集，呈現(xiàn)腎排泄的特點，4h后逐漸排出體外，8h在膀胱處有微弱的熒光信號。同時發(fā)現(xiàn)在標(biāo)記的低聚褐藻淀粉在體內(nèi)8h以內(nèi)，糖分子與熒光分子未發(fā)生脫離，表明該熒光標(biāo)記方法適合代謝過程中藥物分子的示蹤檢測。根據(jù)需要，標(biāo)記糖分子的代謝和組織器官分布情況可以連續(xù)檢測24h。

實施例3：灰樹花多糖的熒光標(biāo)記及其在組織和器官分布檢測中的應(yīng)用

1、取50mg灰樹花多糖溶解在2ml含有1mol/l1,7-庚二胺的10%（體積比）乙酸溶液中，再加入2ml2mol/l硼氫化鈉攪拌反應(yīng)8h，反應(yīng)結(jié)束后用7kda透析袋透析36h，透析內(nèi)液經(jīng)減壓濃縮后冷凍干燥得灰樹花多糖還原胺化產(chǎn)物。

2、取步驟1所述灰樹花多糖還原胺化產(chǎn)物用ph7.2磷酸鹽緩沖液溶解，加入占灰樹花多糖還原胺化產(chǎn)物5倍摩爾質(zhì)量的n-羥基琥珀酰亞胺活化的cy7分子，在37℃恒溫?fù)u床中避光反應(yīng)10h，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)移至截留分子量為10kda的透析袋中透析36h，透析內(nèi)液經(jīng)減壓濃縮后冷凍干燥得灰樹花多糖cy7熒光標(biāo)記產(chǎn)物。

3、將步驟2所述灰樹花多糖熒光標(biāo)記產(chǎn)物用生理鹽水溶解為5mg/ml溶液，以生理鹽水作為空白對照組，按照0.05ml/10g體重劑量裸鼠尾靜脈注射。

4、步驟3注射后分別于0、15min、30min、45min、60min、1.5h、2h、2.5h和3h麻醉實驗鼠，使用小動物活體成像系統(tǒng)對各實驗組受試藥在小鼠體內(nèi)的組織分布情況進行觀察，分別拍照記錄裸鼠腹部和背部不同時間的熒光信號。

5、將步驟4的實驗鼠處死后解剖，分別取腦、心臟、肺臟、肝臟和腎臟采用活體成像系統(tǒng)觀察拍照，記錄不同器官熒光信號。

本實施例所述的1,7-庚二胺可改用1,5-戊二胺、1,6-己二胺、，1,8-辛二胺，1,9-辛二胺或1,10-壬二胺。所述的硼氫化鈉可改用氰基硼氫化鈉、硼氫化鋰、三甲胺硼烷、三乙胺硼烷、嗎啉硼烷或4-甲基嗎啉硼烷。所述的n-羥基琥珀酰亞胺活化cy5可改用n-羥基琥珀酰亞胺酯活化的cy3、cy7或其它可用于動物成像檢測的熒光試劑。

本實施例中熒光標(biāo)記灰樹花多糖靜脈注射進入小鼠體內(nèi)后，組織和器官分布檢測結(jié)果如圖5所示。15min~3h內(nèi)均可以檢測到熒光信號，30min時主要在肝臟和腎臟分布，隨著時間的延長，60min以后逐漸向腎臟和膀胱聚集，呈現(xiàn)出神代謝的特診。同時觀察到標(biāo)記的灰樹花多糖在體內(nèi)3h以內(nèi)，多糖與熒光分子沒有發(fā)生脫離，表明該熒光標(biāo)記方法適合用于糖分子藥物的體內(nèi)代謝檢測。

本發(fā)明標(biāo)記灰樹花多糖在各器官的熒光信號分布檢測結(jié)果如圖6所示。從圖6結(jié)果可進一步說明標(biāo)記灰樹花多糖主要分布于小鼠的肝臟和腎臟，3h以后主要集中于腎臟和膀胱部位。根據(jù)需要，標(biāo)記糖分子的代謝和組織器官分布情況可以連續(xù)檢測24小時。

綜上，本發(fā)明所述方法通過還原胺化反應(yīng)在糖分子的還原端引入游離氨基，通過氨基與熒光分子中的羧基偶聯(lián)反應(yīng)，并通過透析及凝膠柱層析純化，實現(xiàn)了對糖分子的快速熒光標(biāo)記，利用動物活體成像技術(shù)檢測了糖分子在活體動物中的藥代動力學(xué)特征及組織和器官分布。

本發(fā)明建立的糖分子熒光標(biāo)記方法適用于任何具有還原端的糖分子，具有普適性，利用糖分子的熒光標(biāo)記技術(shù)實現(xiàn)了糖分子在活體動物中的代謝動力學(xué)及組織和器官分布研究，具有靈敏度高，結(jié)果直觀可靠等特點，具有廣闊的應(yīng)用前景。

以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對其進行限制；盡管參照前述實施例對本發(fā)明進行了詳細(xì)的說明，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，依然可以對前述實施例中所記載的技術(shù)方案進行修改，或者對其中部分技術(shù)特征進行等同替換；而這些修改或替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明所要求保護的技術(shù)方案的精神和范圍。