本發(fā)明涉及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種多肽類熒光探針及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

唾液酸是一類含有羧基的九碳糖化合物?；苌?，其廣泛存在于細(xì)菌、魚類、哺乳動(dòng)物等多種生物體內(nèi)，它參與并調(diào)節(jié)許多重要的生命活動(dòng)如細(xì)胞識(shí)別、生物膜流動(dòng)和細(xì)胞內(nèi)吞作用等?，F(xiàn)如今科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)的唾液酸成員已多達(dá)50多個(gè)，主要包括n-乙?；窠?jīng)氨酸、n-羥乙?；窠?jīng)氨酸和脫氨神經(jīng)氨酸三種核心單體，其余的唾液酸均由這三種體衍生而來。由于唾液酸通常位于細(xì)胞膜的糖類部分和分泌的糖復(fù)合物(糖脂、糖蛋白和脂多糖)的關(guān)鍵位置，是糖復(fù)合物結(jié)構(gòu)和功能多樣化的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，因此對(duì)于血液中唾液酸的分析和檢測(cè)通常是一些重大疾病早期診斷和治療的關(guān)鍵。例如多聚脫氨神經(jīng)氨酸被視為肺癌腫瘤的重要標(biāo)示物之一。目前唾液酸的檢測(cè)和分析主要依賴于熒光輔助的高效液相和質(zhì)譜方法的聯(lián)用，但是由于唾液酸所處環(huán)境中其他糖類的干擾，這一檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度并不令人十分滿意。另外由于唾液酸種類繁多，且相互之間差異極小，因此對(duì)于單一唾液酸的有效檢測(cè)仍舊是一大難題。綜上所述，開發(fā)對(duì)血液中低濃度的唾液酸具有高靈敏度和高特異性的檢測(cè)手段，對(duì)于進(jìn)一步研究人體某些重大疾病的致病機(jī)理以及相關(guān)疾病早期生物標(biāo)示物的發(fā)現(xiàn)具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種多肽類熒光探針及其制備方法與應(yīng)用。該多肽類熒光探針可在類比于血液中低濃度條件下將唾液酸與其他中性單糖區(qū)分開來，或者組合利用該熒光探針可以進(jìn)一步確定唾液酸的種類。

本發(fā)明目的采用下述方案來實(shí)現(xiàn)：

一種多肽類熒光探針，所述多肽類熒光探針的結(jié)構(gòu)式如下：

所述多肽類熒光探針是通過多肽的氨基與異硫氰酸熒光素的異硫氰酸基鍵合所得，所述多肽為四肽dapd或者二肽，所述二肽為d、a、p這三種氨基酸中任意兩種氨基酸所形成的二肽。這些肽段均由不同氨基酸通過固相反應(yīng)合成。

上述方案中，所述二肽為pd、dp、da、dd、pa或ad。

上述方案中，包括以下步驟：在反應(yīng)容器中加入異硫氰酸熒光素，然后用甲醇或者水溶解，加入多肽，使異硫氰酸熒光素與多肽的摩爾比為1.2-1.5:1；恒溫20-40℃條件下，攪拌反應(yīng)4-25h后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑得粗產(chǎn)物；粗產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜分離、純化和干燥后得到所需純產(chǎn)物。

所述的多肽類熒光探針在識(shí)別唾液酸中的應(yīng)用。

上述方案中，包括以下步驟：

1)先配置濃度為2.0-20μm的dapd熒光探針?biāo)芤?，在激發(fā)波長470nm條件下測(cè)其發(fā)射的熒光光譜，記錄其500-550nm處的熒光強(qiáng)度i0；

2)往該溶液中加入單糖并混合均勻，所述單糖與所述dapd熒光探針的摩爾比為0.1-10，在激發(fā)波長470nm條件下測(cè)其發(fā)射的熒光光譜，記錄其在500-550nm處的熒光強(qiáng)度i1；

3)往步驟2)所得的溶液中繼續(xù)加入單糖并混合均勻，在激發(fā)波長470nm條件下測(cè)其發(fā)射的熒光光譜，記錄其在500-550nm處的熒光強(qiáng)度i2；

4)重復(fù)步驟3)n遍，分別得到熒光強(qiáng)度i3,…in；

5)以熒光強(qiáng)度i2,…in分別對(duì)應(yīng)的單糖的摩爾數(shù)與dapd熒光探針的摩爾數(shù)之比為橫坐標(biāo)，以i2,…in為縱坐標(biāo)，得到熒光響應(yīng)性曲線，若該曲線呈下降趨勢(shì)，則說明單糖溶液中含有唾液酸。

上述方案中，所述步驟1)中的dapd熒光探針?biāo)芤褐屑尤雝ris-hcl緩沖液調(diào)節(jié)ph＝5-9。

上述方案中，所述步驟2)中的單糖為唾液酸、半乳糖或葡萄糖。

上述方案中，包括以下步驟：

1)先配置x組濃度為2.0-20μm的ph＝5-9的不同種類的二肽類熒光探針?biāo)芤海龆臑閐、a、p這三種氨基酸中任意兩種氨基酸所形成的二肽，每組二肽類熒光探針?biāo)芤喊▂份相同種類的二肽類熒光探針?biāo)芤?，x的數(shù)目與二肽的種類數(shù)目相同，y的數(shù)目與已知唾液酸的種類數(shù)目相同，所述x大于等于3，在激發(fā)波長470nm條件下測(cè)其發(fā)射的熒光光譜，分別記錄一系列二肽熒光探針在500-550nm處的熒光強(qiáng)度i0；

2)往其中一種二肽類熒光探針?biāo)芤褐屑尤胍环N已知種類的唾液酸，使其濃度在10-200μm，并混合均勻，在激發(fā)波長470nm條件下，測(cè)得加入唾液酸后的二肽熒光探針?biāo)芤旱臒晒夤庾V，記錄其在500-550nm處的熒光強(qiáng)度i；

3)設(shè)定i/i0小于0.4時(shí)為“on”狀態(tài)，i/i0大于0.4時(shí)為“off”狀態(tài)；

4)重復(fù)步驟2)和3)，測(cè)定x組二肽類熒光探針?biāo)芤褐忻拷M的y份二肽類熒光探針?biāo)芤簩?duì)于y種不同種類的已知等量唾液酸得到的不同on和off組合的特定響應(yīng)規(guī)律；

5)以y種唾液酸為橫軸，以x種二肽類熒光探針?biāo)芤簽榭v軸建立on-off熒光變化正交矩陣；

6)參照步驟1)至步驟3)，測(cè)量未知種類唾液酸相對(duì)于x種二肽類熒光探針?biāo)芤旱玫降膞個(gè)i/i0值，即可以得到x個(gè)不同on和off組合的特定響應(yīng)規(guī)律，將所述未知唾液酸的特定響應(yīng)規(guī)律與步驟5)得到的已知唾液酸的正交矩陣進(jìn)行對(duì)比，如果重合即可判斷所述未知唾液酸的種類。

上述方案中，所述y為6，所述6種唾液酸為sa-1、sa-2、sa-3、sa-4、sa-5或sa-6，其結(jié)構(gòu)式如下：

上述方案中，所述x為6，所述6種二肽為pd、dp、da、dd、pa或ad。

本發(fā)明的有益效果為：

1、本發(fā)明制備的熒光探針在檢測(cè)唾液酸時(shí)，具有檢測(cè)精準(zhǔn)性高，檢測(cè)速度快且抗其他中性單糖干擾的優(yōu)點(diǎn)，非常適用于復(fù)雜生物體系中快速檢測(cè)唾液酸含量變化；

2、本發(fā)明制備的熒光探針組合使用時(shí)，對(duì)不同種類的唾液酸響應(yīng)性狀態(tài)不同，因此可以實(shí)現(xiàn)不同唾液酸分子的區(qū)分；

3、本發(fā)明制備的熒光探針設(shè)計(jì)來源于植物體內(nèi)的凝集素，其本質(zhì)是基于糖肽之間氫鍵的弱相互作用，可擴(kuò)展性較好。

綜上所述，本發(fā)明受植物體內(nèi)凝集素與糖的特異性結(jié)合啟發(fā)，從花生凝集素模型中提取了起關(guān)鍵性作用的核心四肽片段dapd，并用異硫氰酸熒光素進(jìn)行修飾，制備了對(duì)唾液酸具有特異性識(shí)別的熒光探針。另外通過進(jìn)一步簡化肽鏈結(jié)構(gòu)，制備了一系列基于二肽的熒光探針(pd、dp、da、dd、pa、ad)，并設(shè)計(jì)一系列正交實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了對(duì)其中6種有代表性的唾液酸的精確識(shí)別。本發(fā)明從仿生的角度出發(fā)，制備出的熒光探針能夠快速而精確地識(shí)別唾液酸，對(duì)生物化學(xué)、材料學(xué)和醫(yī)學(xué)，尤其是一些以唾液酸為重要標(biāo)示物的重大疾病的早期診斷與治療具有重要的理論和實(shí)際意義。

附圖說明

圖1為異硫氰酸熒光素化學(xué)結(jié)構(gòu)圖。

圖2為唾液酸分子sa-1～sa-6的化學(xué)結(jié)構(gòu)圖。

圖3為dapd熒光探針中加入不同摩爾比的sa-1后其熒光光譜的變化趨勢(shì)，插圖為514nm處熒光強(qiáng)度隨sa-1分子加入的變化趨勢(shì)圖。

圖4為dapd熒光探針中加入不同摩爾比的葡萄糖后其熒光光譜的變化趨勢(shì)，插圖為514nm處熒光強(qiáng)度隨葡萄糖分子加入的變化趨勢(shì)圖。

圖5為dapd熒光探針中加入不同摩爾比的半乳糖后其熒光光譜的變化趨勢(shì)，插圖為514nm處熒光強(qiáng)度隨半乳糖分子加入的變化趨勢(shì)圖。

圖6為dapd熒光探針中加入不同摩爾比的各種單糖后其熒光光譜514nm處熒光強(qiáng)度隨糖分子加入的變化趨勢(shì)圖。

圖7為dapd熒光探針中加入不同摩爾比的sa-1與葡萄糖的混合物(摩爾比分別為1:10、1:100和1:300)后其熒光光譜514nm處熒光強(qiáng)度隨糖分子加入的變化趨勢(shì)圖。

圖8為pd熒光探針中分別加入等量sa-1、sa-2、sa-3、sa-4、sa-5和sa-6后熒光光譜對(duì)比圖。

圖9為熒光強(qiáng)度變化幅度與“on-off”狀態(tài)界定示意圖。

圖10為熒光強(qiáng)度變化“on-off”狀態(tài)矩陣圖。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明的內(nèi)容、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合具體實(shí)施例和圖進(jìn)一步闡述本發(fā)明，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而本發(fā)明不僅限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例中所用原料及設(shè)備

各種多肽序列片段由上海強(qiáng)耀生物科技購得，均由固相合成法制得，純度在98％以上。異硫氰酸熒光素(5g，98％)，tris試劑(100g，97％)，各種糖類(純度均高于95％)均由sigma-aldrich公司購得。所用甲醇等色譜試劑均由美國天地色譜試劑公司購得，配制緩沖溶液所用鹽酸等試劑由國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司處購得。本發(fā)明中所用水均為milli-q超純水儀制備(電阻率為18.2mω·cm)。熒光光譜數(shù)據(jù)由perkinelmerls55熒光分光光度計(jì)采集而成。

實(shí)施例1

異硫氰酸熒光素修飾的多肽類熒光探針的制備方法

在圓底燒瓶中加入異硫氰酸熒光素，然后用25ml甲醇或者水溶解后，加入多肽dapd、pd、dp、da、dd、pa或者ad，保證異硫氰酸熒光素與多肽的摩爾比為1.2:1。恒溫30℃條件下，攪拌反應(yīng)12h后，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑得粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜分離、純化，真空冷凍干燥后得到所需純產(chǎn)物，即可用作唾液酸特異性識(shí)別的熒光探針?？梢岳斫獾氖牵景l(fā)明中的二肽并不局限于pd、dp、da、dd、pa或者ad，其可以是d、a、p這三種氨基酸中任意兩種氨基酸所形成的二肽。

實(shí)施例2

基于四肽dapd的熒光探針應(yīng)用在唾液酸的特異性識(shí)別中，具體步驟如下：

1)先配置濃度為2.0μm的dapd熒光探針?biāo)芤?加tris-hcl緩沖，調(diào)ph＝7.4)，以其為熒光主體分子，在激發(fā)波長470nm條件下測(cè)其發(fā)射的熒光光譜，記錄其在514nm處最高峰強(qiáng)i0；

2)往該溶液中加入dapd熒光探針的唾液酸(sa-1)作為客體分子，其中加入的sa-1摩爾量是dapd熒光探針的0.1-5倍，并混合均勻，在激發(fā)波長470nm條件下測(cè)其發(fā)射的熒光光譜，記錄其在514nm處最高峰強(qiáng)i1；

3)往步驟2)所得的溶液中繼續(xù)加入sa-1并混合均勻，在激發(fā)波長470nm條件下測(cè)其發(fā)射的熒光光譜，記錄其在500-550nm處的熒光強(qiáng)度i2；

4)重復(fù)步驟3)n遍，分別得到熒光強(qiáng)度i3,…in；

5)以熒光強(qiáng)度i2,…in分別對(duì)應(yīng)的sa-1的摩爾數(shù)與dapd熒光探針的摩爾數(shù)之比為橫坐標(biāo)，以i2,…in為縱坐標(biāo)，得到熒光響應(yīng)性曲線。從圖3可以看出，該曲線呈下降趨勢(shì)，則說明單糖溶液中含有唾液酸。在本實(shí)施例中，n為10-40。

實(shí)施例3-4

按實(shí)施例2所述將步驟2)中客體分子唾液酸(sa-1)分別換成葡萄糖和半乳糖，其他條件不變的情況下測(cè)得dapd熒光探針中加入不同摩爾比的葡萄糖或者半乳糖后其熒光光譜。所得熒光光譜變化趨勢(shì)如圖4和圖5所示。

實(shí)施例5-8

按實(shí)施例2所述將步驟2)中客體分子唾液酸(sa-1)分別換成n-乙?；咸烟前贰-乙?；?、甘露糖和巖藻糖，其他條件不變的情況下分別測(cè)得dapd熒光探針中加入不同摩爾比的糖類客體分子后其熒光光譜。各熒光圖譜中514nm處發(fā)射譜峰熒光強(qiáng)度變化趨勢(shì)如圖6所示。

由圖3-6可知只有當(dāng)dapd熒光探針中加入不同比例唾液酸sa-1時(shí)，其熒光強(qiáng)度會(huì)隨著sa-1的加入而呈現(xiàn)熒光“猝滅”的現(xiàn)象，而當(dāng)dapd熒光探針中加入不同比例的其他中性單糖時(shí)，其熒光強(qiáng)度則會(huì)隨著糖分子的加入而呈現(xiàn)熒光增強(qiáng)的現(xiàn)象，由此我們可以有效地將唾液酸從其他中性單糖中區(qū)分出來。

實(shí)施例9-11

按實(shí)施例2所述將步驟1)中主體分子dapd探針換成pd探針，步驟2)中客體分子唾液酸(sa-1)換成sa-1與葡萄糖的混合物(sa-1與葡萄糖的摩爾比分別為1:10、1:100和1:300)，其他條件不變的情況下分別測(cè)得dapd熒光探針中加入不同摩爾比的糖類客體分子后其熒光光譜。各熒光圖譜中514nm處發(fā)射譜峰熒光強(qiáng)度變化趨勢(shì)如圖7所示。

由圖7可知dapd熒光探針對(duì)sa-1的響應(yīng)性幾乎不受同時(shí)加入的葡萄糖分子影響，這充分說明了該類熒光探針抗干擾的能力，有望應(yīng)用于更加復(fù)雜的實(shí)際生物樣本體系。

實(shí)施例12

二肽熒光探針用于區(qū)分不同種類的唾液酸，具體步驟如下：

1)先配置x組濃度為2.0-20μm的ph＝5-9的不同種類的二肽類熒光探針?biāo)芤?，所述二肽為d、a、p這三種氨基酸中任意兩種氨基酸所形成的二肽，每組二肽類熒光探針?biāo)芤喊▂份相同種類的二肽類熒光探針?biāo)芤?，x的數(shù)目與二肽的種類數(shù)目相同，y的數(shù)目與已知唾液酸的種類數(shù)目相同，在激發(fā)波長470nm條件下測(cè)其發(fā)射的熒光光譜，分別記錄一系列二肽熒光探針在500-550nm處的熒光強(qiáng)度i0；

2)往其中一種二肽類熒光探針?biāo)芤褐屑尤胍环N已知種類的唾液酸，使其濃度在10-200μm，并混合均勻，在激發(fā)波長470nm條件下，測(cè)得加入唾液酸后的二肽熒光探針?biāo)芤旱臒晒夤庾V，記錄其在500-550nm處的熒光強(qiáng)度i；

3)設(shè)定i/i0小于0.4時(shí)為“on”狀態(tài)，i/i0大于0.4時(shí)為“off”狀態(tài)；

4)重復(fù)步驟2)和3)，測(cè)定x組二肽類熒光探針?biāo)芤褐忻拷M的y份二肽類熒光探針?biāo)芤簩?duì)于y種不同種類的已知等量唾液酸得到的不同on和off組合的特定響應(yīng)規(guī)律；

5)以y種唾液酸為橫軸，以x種二肽類熒光探針為縱軸建立on-off熒光變化正交矩陣；

6)參照步驟1)至步驟3)，測(cè)量未知種類唾液酸相對(duì)于x種二肽類熒光探針?biāo)芤旱玫降膞個(gè)i/i0值，即可以得到x個(gè)不同on和off組合的特定響應(yīng)規(guī)律，將所述未知唾液酸的特定響應(yīng)規(guī)律與步驟5)得到的已知唾液酸的正交矩陣進(jìn)行對(duì)比，如果重合即可判斷所述未知唾液酸的種類。

在本實(shí)施例中，x為6，y為6，具體步驟如下：

1)先配置18ml濃度為2μm的pd熒光探針?biāo)芤?加tris-hcl緩沖，調(diào)ph＝7.4)，在激發(fā)波長470nm條件下測(cè)其發(fā)射的熒光光譜，記錄其在514nm處熒光強(qiáng)度i0。

2)將pd溶液等分為6份，然后分別往這6份溶液中加等量(300μmol)的唾液酸sa-1、sa-2、sa-3、sa-4、sa-5和sa-6，并分別混合均勻。

3)在激發(fā)波長470nm條件下，分別測(cè)得這6種混合溶液的熒光光譜，記錄其在514nm處熒光強(qiáng)度i。熒光光譜對(duì)比如圖8所示。

由圖8可知，sa-1、sa-2、sa-3、sa-4、sa-5和sa-6的加入均會(huì)導(dǎo)致pd溶液呈現(xiàn)熒光“猝滅”的現(xiàn)象，只是熒光強(qiáng)度下降的程度各有不同，依此可初步分辨不同的唾液酸。

實(shí)施例13-17

按照實(shí)施例12所述方法，將所述步驟1)中pd熒光探針分別換成dp、da、dd、pa和ad，其他條件不變。規(guī)定當(dāng)i/i0小于0.4時(shí)為“on”狀態(tài)，反之則為“off”狀態(tài)，如圖9所示。以6種唾液酸為橫軸、以6種二肽熒光探針為縱軸建立on-off熒光變化正交矩陣，如圖10所示(圖中深灰色為“off”狀態(tài)，淺灰色為“on”狀態(tài))。

結(jié)合圖10我們可以清晰地看出，每一種唾液酸均有一個(gè)針對(duì)于6種二肽熒光探針的特征“on-off”狀態(tài)轉(zhuǎn)變規(guī)律，根據(jù)該轉(zhuǎn)變規(guī)律圖可以很快鑒定出樣品屬于哪一種唾液酸。進(jìn)一步觀察可以發(fā)現(xiàn)，實(shí)際上我們僅需要pd、da和dd三種二肽熒光探針就足以區(qū)分這6種唾液酸，這更加展示了我們所設(shè)計(jì)的多肽類熒光探針在精確識(shí)別更多更復(fù)雜的唾液酸分子中的潛在應(yīng)用。

綜上所述，本發(fā)明仿生的角度出發(fā)，制備出的熒光探針能夠快速而精確地識(shí)別唾液酸，不僅能夠區(qū)分唾液酸和其他中性單糖，而且對(duì)于不同種類的唾液酸亦能加以精確區(qū)分。同時(shí)與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比具有檢測(cè)速度快、成本低廉和抗干擾能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。因此有望將其應(yīng)用于復(fù)雜生物體系中大規(guī)模、高通量、高精度的唾液酸檢測(cè)和鑒定。另外，本發(fā)明制備的熒光探針設(shè)計(jì)來源于植物體內(nèi)的凝集素，其本質(zhì)是基于糖肽之間氫鍵的弱相互作用，可擴(kuò)展性較好，對(duì)仿生生物傳感材料的發(fā)展具有一定的啟示作用。