本發(fā)明屬于特異性分子識別診斷試劑領(lǐng)域，具體涉及一種與aβ斑塊具有親和力的熒光化合物及制備與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

阿爾茨海默癥(alzheimer’sdisease,ad)是一種神經(jīng)退行性疾病。根據(jù)2016年一項最新調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，目前全球范圍內(nèi)有超過4700萬ad病人。而中國已提前進入老齡化社會，調(diào)查顯示我國已有超過800萬ad患者，數(shù)量居世界之首，且患病人數(shù)以每年30萬以上的速度遞增。ad不但嚴(yán)重影響老年人的身體健康，而且給社會和家庭帶來沉重的負(fù)擔(dān)。目前，臨床上可用于治療ad的藥物不能延緩、終止或者逆轉(zhuǎn)ad病情的發(fā)展，只能部分改善臨床癥狀。而且，由于ad病因復(fù)雜，確切的發(fā)病機理目前尚不清楚，臨床上主要通過評價患者的認(rèn)知能力損傷來診斷，確診患者多已進入病程的中晚期而延誤了治療。缺乏有效的檢測手段已成為ad早起診斷和治療的重大障礙。

在ad患者腦中，β-淀粉樣蛋白(amyloid,aβ)在腦中沉積是ad最為顯著的病理性標(biāo)志之一。aβ斑塊在ad發(fā)病前的數(shù)十年已開始出現(xiàn)，是ad最早的神經(jīng)組織退化標(biāo)志和重要病理學(xué)特征。近年來，aβ斑塊形成的預(yù)防和逆轉(zhuǎn)成為治療ad的目標(biāo)之一，抑制aβ斑塊在腦內(nèi)產(chǎn)生和蓄積的藥物和療法得到了廣泛研究。

除了ad外，aβ斑塊也存在于其他疾病中，例如腦淀粉樣血管病、淀粉樣心肌病、淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病、系統(tǒng)性老年淀粉樣變和伴有淀粉樣變的遺傳性腦出血等。因此，研發(fā)具有特異性結(jié)合aβ斑塊的aβ分子探針引人關(guān)注。利用aβ分子探針和分子成像技術(shù)進行aβ斑塊的顯像，可實現(xiàn)無創(chuàng)的、實時的aβ斑塊的體內(nèi)示蹤和檢測，進而為ad等疾病患者進行早期診斷、療效檢測以及治療藥物的研究等提供極大便利。

過去的數(shù)年間，已有較多放射性aβ分子探針進入臨床試驗階段，并有相關(guān)pet成像試劑上市，但是放射性顯像方法的應(yīng)用也受一些因素限制，比如放射性顯像劑所發(fā)出的射線對人體具有一定的輻射損傷、需要醫(yī)療機構(gòu)配套有生產(chǎn)放射性核素的回旋加速器、放射性顯像劑需專業(yè)技術(shù)人員標(biāo)記配制等。相比較之下，光學(xué)成像具有安全無放射性、數(shù)據(jù)采集時間短以及成本低廉等諸多優(yōu)勢，近年在醫(yī)學(xué)診斷等中的應(yīng)用受到廣泛重視。尤其是近紅外熒光成像技術(shù)，因其背景熒光干擾較低，在生物組織中穿透力強，因此，研發(fā)對aβ斑塊具有親和力的近紅外熒光顯像劑(分子探針)，將具有重要的科學(xué)意義和實際價值。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對以上現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點和不足之處，本發(fā)明的首要目的在于提供一種與aβ斑塊具有親和力的熒光化合物。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述與aβ斑塊具有親和力的熒光化合物的制備方法。

本發(fā)明的再一目的在于提供上述與aβ斑塊具有親和力的熒光化合物的應(yīng)用。

本發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

一種與aβ斑塊具有親和力的熒光化合物，所述熒光化合物具有式(i)所示的結(jié)構(gòu)通式：

其中，r為(所述熒光化合物簡稱為dcsc-1)或者(所述熒光化合物簡稱為dcsc-7)。

上述熒光化合物的制備方法，包括以下制備步驟：

(1)將2,3,3-三甲基吲哚和碘甲烷加入到乙醇混合攪拌均勻，在耐壓容器中加熱到60～100℃反應(yīng)，反應(yīng)完成后冷卻至室溫析出固體，抽濾，得到中間體1：

(2)將dmf和二氯甲烷混合均勻，冰浴并氮氣保護，然后滴加三氯氧磷，攪拌20～40min后加入環(huán)己酮，升溫至50～100℃回流反應(yīng)，反應(yīng)完成后冷卻至室溫，將反應(yīng)液加入冰水中，析出固體，抽濾，得到中間體2：

(3)將中間體1和中間體2溶于有機溶劑中，升溫至80～130℃回流反應(yīng)，反應(yīng)完成后旋蒸除去溶劑，柱層析分離得到中間體3：

(4)將中間體3和丙二腈溶于有機溶劑中，加入哌啶或碳酸鉀甲醇飽和溶液，室溫攪拌析出固體，抽濾，得到與aβ斑塊具有親和力的熒光化合物dcsc-1；或?qū)⒅虚g體3和氰基乙酸乙酯溶于有機溶劑中，加入哌啶或碳酸鉀飽和溶液，室溫攪拌反應(yīng)后，柱層析分離，得到與aβ斑塊具有親和力的熒光化合物dcsc-7。

優(yōu)選地，步驟(3)中所述的有機溶劑為正丁醇與甲苯的混合溶劑。

優(yōu)選地，步驟(4)中所述的有機溶劑為甲醇。

優(yōu)選地，步驟(4)中所述中間體3與丙二腈或氰基乙酸乙酯的摩爾比為1:(5～15)。

上述制備方法的合成路線圖如圖1所示。

上述與aβ斑塊具有親和力的熒光化合物在制備aβ斑塊顯像診斷組合物中的應(yīng)用，所述組合物包括式(i)所示的熒光化合物與藥學(xué)上可接受的載體，所述“藥學(xué)上可接受的載體”包括各種賦形劑和稀釋劑。所述“藥學(xué)上可接受的載體”可包括液體，如水、生理鹽水、甘油或乙醇。

上述與aβ斑塊具有親和力的熒光化合物在制備aβ斑塊診斷試劑或與aβ沉積相關(guān)疾病的治療藥物中的應(yīng)用。

進一步地，所述與aβ沉積相關(guān)疾病是指阿爾茨海默癥或腦淀粉樣血管病。

本發(fā)明的熒光化合物具有如下優(yōu)點及有益效果：

本發(fā)明的熒光化合物，其結(jié)構(gòu)中的給電子基團和吸電子基團形成了推-拉電子作用的共軛結(jié)構(gòu)，并通過碳碳雙鍵增加躍遷的共軛體系，使化合物分子產(chǎn)生的熒光向近紅外區(qū)移動，同時本類化合物均具有良好的熒光性質(zhì)，發(fā)射波長達(dá)到了近紅外區(qū)。所得熒光化合物在體外實驗表現(xiàn)出對aβ斑塊具有親和力，能夠成功用于aβ斑塊的近紅外熒光顯像，具有安全無放射性、成本低廉、背景熒光干擾較低、在生物組織中穿透力強等優(yōu)點。

附圖說明

圖1是本發(fā)明熒光化合物(i)的合成路線圖；

圖2是本發(fā)明實施例所得熒光化合物dcsc-1的¹h-nmr譜圖；

圖3是本發(fā)明實施例所得熒光化合物dcsc-1的¹³c-nmr譜圖；

圖4是本發(fā)明實施例所得熒光化合物dcsc-7的¹h-nmr譜圖；

圖5是本發(fā)明實施例所得熒光化合物dcsc-7的¹³c-nmr譜圖；

圖6是本發(fā)明所得熒光化合物dcsc-1和dcsc-7制備的探針(i)與aβ1-42聚集體混合前后的熒光發(fā)射光譜圖；

圖7是本發(fā)明所得熒光化合物dcsc-1溶液探針由尾靜脈注入ad轉(zhuǎn)基因小鼠和正常小鼠后60min內(nèi)不同時間點腦部活體成像圖。

具體實施方式

下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

以下實施例對于未特別注明的參數(shù)，可參照常規(guī)技術(shù)進行。核磁譜采用瑞士bruker公司avanceiii400mhz核磁共振儀測定，氘代氯仿或氘代dmso做溶劑。

本發(fā)明提供aβ斑塊的顯像方法。在本顯像方法的第一步中，將可檢測量的式(i)所示的化合物引入組織或患者中?；衔锿ǔＪ窃\斷組合物的部分并且通過本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法給藥至組織或患者。如以可檢測量的式(i)所示的化合物引入患者并且在足以使化合物與aβ斑塊結(jié)合的時間之后，非創(chuàng)傷性地檢測化合物?；?qū)⑹?i)所示的化合物引入患者，經(jīng)足量的時間以使化合物與aβ斑塊結(jié)合，自患者取組織樣品，并脫離患者檢測組織中的化合物?；蜃曰颊呷〗M織樣品并且將式(i)所示的化合物引入該組織樣品。在足以使該化合物結(jié)合至aβ斑塊的時間之后，檢測化合物。

可以通過整體的或局部的給藥途徑將式(i)所示的化合物給藥至患者。例如，可以將化合物給藥至患者以使其遞送至全身?？蛇x地，可以將化合物給藥至關(guān)注的特定的器官或者組織。例如，為了診斷或追蹤患者的ad的進程，需要定位和定量腦內(nèi)的淀粉樣斑塊。

術(shù)語“患者”是指人類和其他動物。本領(lǐng)域技術(shù)人員也熟知如何確定足以使化合物與aβ斑塊結(jié)合的時間。通過將可檢測量的式(i)所示的化合物引入患者，然后在給藥后的各時間處檢測化合物，可以容易地測定所需的時間。

術(shù)語“結(jié)合”是指化合物和aβ斑塊之間的化學(xué)相互作用。結(jié)合的實例包括共價鍵、離子鍵、親水-親水相互作用、疏水-疏水相互作用和絡(luò)合物。

本發(fā)明所述的顯像手段為光學(xué)顯像。

實施例1

本實施例的一種熒光化合物(i)的合成，具體合成步驟如下：

(1)合成中間體1

將4.77g的2,3,3-三甲基吲哚(30mmol)與3.22ml碘甲烷(7.08g,50mmol)在60ml乙醇中攪拌均勻，密封耐壓容器，80℃反應(yīng)12h。反應(yīng)完成后，冷至室溫，析出固體，抽濾，得到析出固體7.7g，即得中間體1；

(2)合成中間體2

將17.5mldmf(16.54g,225mmol)與18ml二氯甲烷混合均勻，冰浴并氮氣保護下，逐滴慢慢滴加15ml三氯氧磷(24.68g,160mmol)，攪拌20-40min后，加入4.6ml環(huán)己酮(4.37g,45mmol)，升溫到80℃回流反應(yīng)4h后，冷至室溫，將反應(yīng)液緩慢倒入冰水中，析出固體，抽濾，得到7.5g固體，即中間體2；

(3)合成中間體3

將7.5g中間體1(25mmol)和7g中間體2(40mmol)溶于140ml正丁醇與60ml甲苯混合溶劑中，升溫到80-130℃反應(yīng)4h后，除去溶劑，柱層析分離，得到2.5g中間體3；

(4)合成熒光化合物dcsc-1

將400mg中間體3(1.2mmol)和800μl丙二腈(12mmol)溶于32ml甲醇中，再加入320μl飽和的碳酸鉀甲醇溶液，室溫攪拌3h，抽濾，得到202mg析出固體，即得dcsc-1，產(chǎn)率44.9％。所得產(chǎn)物的核磁氫譜圖和碳譜圖分別如圖2和圖3所示。產(chǎn)物鑒定數(shù)據(jù)如下：

¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.00(d,j＝13.8hz,1h),7.82(s,1h),7.48(d,j＝6.9hz,1h),7.33(t,j＝7.7hz,1h),7.20(d,j＝7.6hz,1h),7.10(t,j＝7.4hz,1h),5.90(d,j＝12.9hz,1h),3.47(s,3h),2.81(t,j＝8.7hz,2h),2.60(t,j＝9.3hz,2h),1.85–1.73(m,2h),1.60(s,6h)；

¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ166.28,153.40,148.14,143.74,139.64,137.59,128.17,124.81,123.96,122.35,121.94,117.37,115.59,107.87,95.15,72.11,47.32,29.82,29.71,28.34,27.49,25.86,20.96。

(5)合成熒光化合物dcsc-7

將400mg中間體3(1.2mmol)和1.28ml氰基乙酸乙酯(12mmol)溶于32ml甲醇中，再加入100μl哌啶，室溫攪拌12h后，柱層析分離，即得126mg的dcsc-7，產(chǎn)率24.9％。所得產(chǎn)物的核磁氫譜圖和碳譜圖分別如圖4和圖5所示。產(chǎn)物鑒定數(shù)據(jù)如下：

¹hnmr(400mhz,dmso)δ8.45(s,1h),7.86(d,j＝14.1hz,1h),7.42(d,j＝7.6hz,1h),7.28(t,j＝8.2hz,1h),7.09(d,j＝8.7hz,1h),7.02(t,j＝7.1hz,1h),5.75(d,j＝12.9hz,1h),4.25(q,j＝14.5,7.5hz,2h),3.37(s,3h),2.88(t,j＝5.8hz,2h),2.60(t,j＝8.3hz,2h),1.79(m,2h),1.59(s,6h),1.26(t,j＝7.5hz,3h)；

¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ165.13,164.59,164.31,164.12,151.40,147.50,147.22,144.13,139.45,134.67,134.38,128.00,125.24,124.41,121.85,121.55,107.26,94.28,61.93,52.85,46.85,29.71,29.58,28.32,26.02,21.25,14.29。

實施例2

本實施例的一種熒光化合物(i)的合成，具體合成步驟如下：

(1)合成中間體1

將4.77g的2,3,3-三甲基吲哚(30mmol)與3.22ml碘甲烷(7.08g,50mmol)在60ml乙醇中攪拌均勻，密封耐壓容器，80℃反應(yīng)12h。反應(yīng)完成后，冷至室溫，析出固體，抽濾，得到析出固體7.7g，即得中間體1；

(2)合成中間體2

將17.5mldmf(16.54g,225mmol)與18ml二氯甲烷混合均勻，冰浴并氮氣保護下，逐滴慢慢滴加15ml三氯氧磷(24.68g,160mmol)，攪拌20-40min后，加入4.6ml環(huán)己酮(4.37g,45mmol)，升溫到80℃回流反應(yīng)4h后，冷至室溫，將反應(yīng)液緩慢倒入冰水中，析出固體，抽濾，得到7.5g固體，即中間體2；

(3)合成中間體3

將7.5g中間體1(25mmol)和7g中間體2(40mmol)溶于140ml正丁醇與60ml甲苯混合溶劑中，升溫到80-130℃反應(yīng)4h后，除去溶劑，柱層析分離，得到2.5g中間體3；

(4)合成熒光化合物dcsc-1

將400mg中間體3(1.2mmol)和800μl丙二腈(6mmol)溶于16ml甲醇中，再加入160μl飽和的碳酸鉀甲醇溶液，室溫攪拌3h，抽濾，得到184mg析出固體，即得dcsc-1，產(chǎn)率40.9％。產(chǎn)物鑒定數(shù)據(jù)同實施例1。

(5)合成熒光化合物dcsc-7

將400mg中間體3(1.2mmol)和1.28ml氰基乙酸乙酯(6mmol)溶于16ml甲醇中，再加入50μl哌啶，室溫攪拌12h后，柱層析分離，即得121mgdcsc-7，產(chǎn)率23.7％。產(chǎn)物鑒定數(shù)據(jù)同實施例1。

實施例3

本實施例的一種熒光化合物(i)的合成，具體合成步驟如下：

(1)合成中間體1

將4.77g的2,3,3-三甲基吲哚(30mmol)與3.22ml碘甲烷(7.08g,50mmol)在60ml乙醇中攪拌均勻，密封耐壓容器，80℃反應(yīng)12h。反應(yīng)完成后，冷至室溫，析出固體，抽濾，得到析出固體7.7g，即得中間體1；

(2)合成中間體2

將17.5mldmf(16.54g,225mmol)與18ml二氯甲烷混合均勻，冰浴并氮氣保護下，逐滴慢慢滴加15ml三氯氧磷(24.68g,160mmol)，攪拌20-40min后，加入4.6ml環(huán)己酮(4.37g,45mmol)，升溫到80℃回流反應(yīng)4h后，冷至室溫，將反應(yīng)液緩慢倒入冰水中，析出固體，抽濾，得到7.5g固體，即中間體2；

(3)合成中間體3

將7.5g中間體1(25mmol)和7g中間體2(40mmol)溶于140ml正丁醇與60ml甲苯混合溶劑中，升溫到80-130℃反應(yīng)4h后，除去溶劑，柱層析分離，得到2.5g中間體3；

(4)合成熒光化合物dcsc-1

將400mg中間體3(1.2mmol)和800μl丙二腈(18mmol)溶于48ml甲醇中，再加入150μl飽和的碳酸鉀甲醇溶液，室溫攪拌3h，抽濾，得到196mg析出固體，即得dcsc-1，產(chǎn)率43.6％。產(chǎn)物鑒定數(shù)據(jù)同實施例1。

(5)合成熒光化合物dcsc-7

將400mg中間體3(1.2mmol)和1.28ml氰基乙酸乙酯(18mmol)溶于48ml甲醇中，再加入150μl哌啶，室溫攪拌12h后，柱層析分離，即得115mgdcsc-7，產(chǎn)率22.7％。產(chǎn)物鑒定數(shù)據(jù)同實施例1。

本發(fā)明所得熒光化合物(i)應(yīng)用性能測試：

(1)熒光化合物制備的探針與aβ1-42聚集體的體外結(jié)合實驗：

實驗方法：取本發(fā)明所得熒光化合物dcsc-1或dcsc-7溶于二甲亞砜中，配制成10mm儲備液，用pbs溶液稀釋成1μm的待測液(探針(i)。先測得探針(i)的激發(fā)和發(fā)射光譜性質(zhì)。選用aβ1-42蛋白在37℃水浴中培育aβ聚集體，用于模擬人腦內(nèi)的aβ蛋白聚集體。將探針(i)與aβ1-42聚集體(5μm)混合，應(yīng)用熒光分光光度計進行熒光檢測。所得探針(i)與aβ1-42聚集體混合前后的熒光光譜圖見圖6。由圖6可以看出，本發(fā)明的熒光化合物(i)的近紅外熒光性質(zhì)良好，達(dá)到了近紅外區(qū)。其中，熒光化合物dcsc-1與aβ聚集體結(jié)合后，最大發(fā)射波長為685nm左右。熒光化合物dcsc-1與aβ1-42聚集體混合后的熒光強度大幅增強。

(2)熒光化合物(i)探針應(yīng)用于ad轉(zhuǎn)基因小鼠活體成像：

實驗步驟：將熒光化合物dcsc-1制備成溶液探針(4mg/kg，10％吐溫80，20％dmso，70％pbs)由尾靜脈注射入ad轉(zhuǎn)基因小鼠(tg，app/ps1雙轉(zhuǎn)，10月齡)和正常小鼠(wt，c57bl6，10月齡)體內(nèi)，在異氟烷的持續(xù)麻醉下分別在10min、30min、60min進行小鼠動物成像圖像采集(caliperlifescience，ivisluminaxr，激發(fā)波長取630nm，發(fā)射波長取685nm)，分析結(jié)果。采用livingimagingsoftware進行成像結(jié)果分析。所得成像實驗結(jié)果如圖7所示。結(jié)果顯示，熒光化合物(i)可以透過血腦屏障，腦部的熒光信號在10分鐘左右達(dá)到峰值。10分鐘之后，ad轉(zhuǎn)基因小鼠的腦部熒光信號強度要強于正常小鼠。熒光化合物dcsc-1在ad轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的清除速率明顯要慢于正常小鼠，表明探針與小鼠腦內(nèi)的aβ斑塊結(jié)合后滯留在小鼠腦部，使ad小鼠腦部的熒光信號明顯高于正常小鼠，適用于活體的熒光成像。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其它的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。