本發(fā)明涉及生物樣本檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體涉及一種復(fù)合抗氧化劑及其制法，和一種抗氧化取樣管及其用途。
背景技術(shù)：
血液標(biāo)本的采集和血清的分離在臨床生化檢測(cè)中是至關(guān)重要的，同時(shí)也是造成實(shí)驗(yàn)室操作人員實(shí)驗(yàn)室“感染”的多發(fā)地段。真空采血管是近幾年應(yīng)用于臨床的檢驗(yàn)采血新產(chǎn)品，真空采血管在生產(chǎn)過(guò)程中預(yù)置了一定量的負(fù)壓，真空采血管按標(biāo)本采集類型分類可分為血清管、血漿管和全血管3類。根據(jù)不同的用途,不同真空采血管內(nèi)添加了不同的添加劑。添加劑包括多種成分,如抗凝劑、促凝劑、緩沖劑、保護(hù)劑、分離膠等。其品種、性能、濃度直接影響血樣的性狀和檢測(cè)結(jié)果。試管管帽標(biāo)有不同的色碼，適于不同的檢驗(yàn)項(xiàng)目；真空試管為密閉式；真空采血管分別為有刻度的，紅，紫，藍(lán)，黑，綠等不同顏色管帽的試管。經(jīng)過(guò)多年的應(yīng)用推廣，由于其潔凈安全、簡(jiǎn)單快捷、準(zhǔn)確可靠、安全有效等顯著優(yōu)點(diǎn)，正逐漸代替了傳統(tǒng)的注射器采血方法。
然而，在臨床使用過(guò)程中,有一些問(wèn)題的發(fā)生，影響了標(biāo)本的順利采集。在不同性能的采血管中，都不可避免的混入空氣，這樣一方面會(huì)使取樣量不精確，另外又容易使管中樣本氧化。氧化反應(yīng)過(guò)程可以產(chǎn)生游離自由基，然后這些游離自由基可以啟動(dòng)連鎖反應(yīng)，當(dāng)這些連鎖反應(yīng)發(fā)生在細(xì)胞中時(shí)，便會(huì)造成細(xì)胞的損傷或者凋亡。此外，在采集其他臨床標(biāo)本如體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等過(guò)程中，同樣會(huì)發(fā)生采集樣本被氧化的現(xiàn)象，嚴(yán)重影響了臨床數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。
針對(duì)上述文本，專利申請(qǐng)?zhí)枮?01510593451.5公開為一種提高樣本檢測(cè)精度和準(zhǔn)確性的生物樣本穩(wěn)定試劑，主要由dna酶抑制劑、rna酶抑制劑、固定劑/防腐劑、代謝抑制劑、抗氧化劑、三線態(tài)淬滅劑以及再水化強(qiáng)化劑制成，生物樣本穩(wěn)定試劑使用大量抑制劑、抗菌劑、防腐劑和能量來(lái)源的atp混合在一起作為保存基質(zhì)，以此提高樣本的穩(wěn)定，其適合更長(zhǎng)時(shí)間的保存試劑。然而其添加的抑制劑、抗菌劑等會(huì)影響樣本的準(zhǔn)確度，如對(duì)唾液、尿液等樣本中本身含有大量菌群，該試劑同樣會(huì)對(duì)樣本的自帶菌群帶來(lái)影響，從而影響樣本的檢測(cè)數(shù)據(jù)。
申請(qǐng)人結(jié)合試劑臨床取樣環(huán)境和取樣流程，研制出一種主要具有抗氧化作用，配方簡(jiǎn)單有效的復(fù)合抗氧化劑以及使用該復(fù)合抗氧化劑的采樣裝置。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提出一種復(fù)合抗氧化劑，可以防止樣本被氧化，使臨床數(shù)據(jù)更為精準(zhǔn)，減少誤差。本發(fā)明還提供了一種復(fù)合抗氧化采樣裝置，即實(shí)現(xiàn)精確標(biāo)記取樣量，又避免樣本氧化缺陷。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種復(fù)合抗氧化劑，所述復(fù)合抗氧化劑至少包括下述濃度的組分：
0.01～1mol/l的由弱酸及其共軛酸鹽組合成的緩沖溶液；
1～200μmol/l的含有至少兩種受阻酚類抗氧化劑的溶液；以及
1～100μmol/l含有至少一種抑制氧化低密度脂蛋白形成的物質(zhì)的溶液。
在進(jìn)一步的方案中，所述復(fù)合抗氧化劑還包括下述濃度的組分：
0.1～10mmol/l的含有ca2螯合劑的溶液；以及
1-100mmol/l的細(xì)胞保護(hù)劑溶液。
在一個(gè)具體的優(yōu)選方案中，所述緩沖溶液選自檸檬酸鹽溶液或磷酸鹽溶液；所述受阻酚類抗氧化劑選自bht、bha、tbhq、pg、生素c、維生素e和多酚；所述抑制氧化低密度脂蛋白形成的物質(zhì)選自雙嘧達(dá)莫和普羅布考。
在另一個(gè)具體的優(yōu)選方案中，所述ca2螯合劑為edta及其二鈉鹽；所述細(xì)胞保護(hù)劑為茶堿。
進(jìn)一步的，所述復(fù)合抗氧化劑由下述濃度的溶液混合而成：
0.03～5mol/l的緩沖溶液；
5～100μmol/l的含有兩種的受阻酚類抗氧化劑的溶液；
0.5～5mmol/l的含ca2螯合劑的溶液；
5～40μmol/l的含抑制氧化低密度脂蛋白形成的物質(zhì)的溶液；以及
3～30mmol/l的含細(xì)胞保護(hù)劑的溶液。
本發(fā)明還公開了一個(gè)復(fù)合抗氧化劑的優(yōu)選方案，所述復(fù)合抗氧化劑由下述濃度的溶液混合而成：
0.05～2mol/l檸檬酸鈉溶液、5～15μmol/lbht溶液、10～25μmol/l維生素e溶液、0.8～1.5mmol/ledta溶液、10～25μmol/l雙嘧達(dá)莫溶液以及10～20mmol/l茶堿溶液。
進(jìn)一步的，所述復(fù)合抗氧化劑中組分溶液濃度為：
0.1mol/l檸檬酸鈉溶液、10μmol/lbht溶液、20μmol/l維生素e溶液、1mmol/ledta溶液、20μmol/l雙嘧達(dá)莫溶液以及15mmol/l茶堿溶液。
本發(fā)明復(fù)合抗氧化劑中，檸檬酸鈉溶液為緩沖溶液，可降低樣本ph變動(dòng)幅度，同時(shí)其與edta協(xié)同除具有抗凝作用外，還具有一定的抗原修復(fù)作用，適用于細(xì)胞和組織的采??；bht和維生素e復(fù)用具有更佳的抗氧化效果，提高樣本穩(wěn)定性，而檸檬酸鈉和edta均有抗氧化作用，四者共同使用具有抗氧化協(xié)同增效作用。
雙嘧達(dá)莫(dipyridamole，又名雙嘧啶胺醇)，可抑制血小板第一相和第二相聚集，可逆性抑制磷酸二酯酶，減少血小板中的camp分解；雙嘧達(dá)莫可阻止氧化低密度脂蛋白(ox-ldl)的形成，有效發(fā)揮抗氧化作用，且抑制組織樣本中腫瘤壞死因子及白介素等炎癥因子的表達(dá)，提高組織樣本穩(wěn)定性；其與其他抗氧化劑協(xié)同使用，進(jìn)一步提高抗氧化效果。此外，茶堿有保護(hù)肥大細(xì)胞膜、抑制炎性介質(zhì)釋放的作用，穩(wěn)定樣本細(xì)胞。
在又一個(gè)優(yōu)選方案中，所述復(fù)合抗氧化劑由下述濃度的溶液混合而成：
0.05～2mol/l檸檬酸鈉溶液、5～15μmol/lbht溶液、10～25μmol/l維生素e溶液、0.8～1.5mmol/ledta溶液、10～25μmol/l普羅布考溶液以及10～20mmol/l茶堿溶液。
其中的普羅布考(probucol，又名丙丁酚)具有較強(qiáng)的抗氧化作用，其抗氧化作用主要來(lái)自氧離子捕捉和斷鏈抗氧化的特性，其含有的酚羥基有效降低血漿氧自由基濃度，抑制ox-ldl的形成。
本發(fā)明另一方面還提供了上述復(fù)合抗氧化劑的制法，所述制法包括：
步驟1、分別配制所述濃度的檸檬酸鈉溶液、edta溶液、bht溶液、維生素e溶液、雙嘧達(dá)莫溶液以及茶堿溶液；
步驟2、將配置好的上述各種溶液混合均勻，即得所述復(fù)合抗氧化劑。
在進(jìn)一步具體的步驟1中，配制各溶液的方法具體為：
將檸檬酸鹽加入蒸餾水配置成所述濃度的緩沖溶液；
將na2h2y·2h2o置于燒杯中加蒸餾水，微熱溶解后進(jìn)行稀釋，搖勻然后用caco3作為基準(zhǔn)物進(jìn)行標(biāo)定，即得所述濃度的edta溶液；
將bht標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶于甲醇溶液中，定容，得到所述濃度的bht溶液；
將維生素e置于棕色容量瓶中，用乙烷定容，即得維生素e溶液，避光保存；
取粉狀雙嘧達(dá)莫置于容器，加0.01mol/l鹽酸溶液適量，溶解完全后，繼續(xù)加入0.01mol/l鹽酸溶液定量稀釋制成所述濃度的雙嘧達(dá)莫溶液；
將茶堿加水微熱溶解后進(jìn)行稀釋成所述濃度，搖勻，即得茶堿溶液。
更進(jìn)一步的為使復(fù)合抗氧化溶液更好的涂布在采樣裝置內(nèi)壁上，形成三維空間結(jié)構(gòu)，從而使復(fù)合抗氧化劑與檢測(cè)樣品更充分結(jié)合，所述步驟2中混合各種溶液時(shí)，還加入1～50g/l可溶性的增粘劑，所述增粘劑選自聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇6000、瓊脂糖和果膠酸鈣中的一種或幾種。
本發(fā)明還提供了一種抗氧化采樣裝置，其為帶蓋體的封閉式容器，其中上述的抗氧化劑容納在所述容器中。
在進(jìn)一步的方案中，所述容器為管狀或袋狀，所述抗氧化劑涂覆于所述管狀容器或袋裝容器的內(nèi)壁；或者涂覆于所述管狀容器或袋狀容器的內(nèi)壁和蓋體內(nèi)壁上。
為合理設(shè)置復(fù)合抗氧化劑的涂布量，所述涂覆面積不少于內(nèi)壁總面積的3/4。
在一個(gè)具體的優(yōu)選方案中，所述抗氧化采樣裝置為采樣管，所述制備方法包括：將抗氧化劑溶液倒入管狀容器內(nèi)，蓋上密封蓋，翻轉(zhuǎn)晃蕩，直至所述管狀容器內(nèi)壁均勻掛漿，隨后將多余溶液倒出，即用或者管壁溶液干燥后待用。
本發(fā)明再進(jìn)一步公開了本發(fā)明抗氧化采集裝置在生化檢驗(yàn)、免疫檢驗(yàn)、微生物檢驗(yàn)、血液檢驗(yàn)以及寄生蟲檢驗(yàn)中的用途。
具體的，該抗氧化采樣裝置在血液、血清、血漿、洗嗽液、汗液、粘液、陰道分泌物、毛發(fā)、體腔的體液、細(xì)胞、活組織取樣中的用途。
本發(fā)明的復(fù)合抗氧化劑的應(yīng)用范圍廣，可用于生化檢驗(yàn)、免疫檢驗(yàn)、微生物檢驗(yàn)、血液檢驗(yàn)以及寄生蟲檢驗(yàn)，其適應(yīng)性好。該符合抗氧化劑通過(guò)多種抗氧化劑復(fù)合發(fā)揮協(xié)同增效作用，防止樣本被氧化，穩(wěn)定樣本濃度，提高樣品檢測(cè)精度和準(zhǔn)確性。本發(fā)明采用的抗氧化采樣裝置通過(guò)復(fù)合抗氧化劑在其內(nèi)壁涂覆，使抗氧化劑與檢測(cè)樣本接觸更充分，更好的溶于檢測(cè)樣本中，提高抗氧化劑效果；且該涂布方法直接在現(xiàn)有的采樣裝置(如采樣管和采樣袋)中使用，操作簡(jiǎn)單。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明實(shí)施例公開了一種復(fù)合抗氧化劑及抗氧化采樣裝置。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)。特別需要指出的是，所有類似的替換替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是顯而易見的，他們都被視為包括在本發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明的復(fù)合抗氧化劑、其制備方法以及抗氧化采樣裝置、其制備方法已經(jīng)通過(guò)較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本發(fā)明內(nèi)容、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的抗氧化劑和采樣裝置進(jìn)行改動(dòng)或適當(dāng)變更與組合，來(lái)實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，采用如下技術(shù)方案。
一種復(fù)合抗氧化劑，所述復(fù)合抗氧化劑至少包括下述濃度的組分：
0.01～1mol/l的由弱酸及其共軛酸鹽組合成的緩沖溶液；
1～200μmol/l的含有至少兩種受阻酚類抗氧化劑的溶液；以及
1～100μmol/l含有至少一種抑制氧化低密度脂蛋白形成的物質(zhì)的溶液。
本發(fā)明抗氧化劑主要由多種抗氧化劑復(fù)合而成，其中受阻酚類抗氧化劑和天然抗氧化劑復(fù)合具有協(xié)同增效作用，添加抑制氧化低密度脂蛋白形成的抗氧化物質(zhì)針對(duì)性強(qiáng)且更為有效；該復(fù)合抗氧化劑還通過(guò)緩沖溶液校正樣本的ph，以此進(jìn)一步穩(wěn)定樣本。
在一些實(shí)施例中，所述緩沖溶液為ph6～10的緩沖溶液，可以為有機(jī)緩沖溶液和/或無(wú)極緩沖溶液；在更優(yōu)選的實(shí)施例中，緩沖溶液具體選自檸檬酸鹽溶液或磷酸鹽溶液。
所述受阻酚類抗氧化劑作為主抗氧化劑，是一類在苯環(huán)上羥基的一側(cè)或兩側(cè)有取代基的化合物。由于羥基受到空間障礙，h原子容易從分子脫落下來(lái)，與過(guò)氧化自由基、烷氧自由基、羥自由基等結(jié)合使之失去活性，從而使熱氧老化的鏈反應(yīng)終止。在一些具體實(shí)施例中，所述受阻酚類抗氧化劑選自bht、bha、tbhq、pg、維生素c、維生素e和多酚。在一些更優(yōu)選的實(shí)施例中，bht作為主抗氧化劑，維生素e作為輔助抗氧化劑，將兩者并用，配成有效的復(fù)合穩(wěn)定劑。
在一些實(shí)施例中，所述抑制氧化低密度脂蛋白形成的物質(zhì)選自雙嘧達(dá)莫和普羅布考。這兩者藥物具有較強(qiáng)的抗氧化作用，其含有的酚羥基有效降低血漿氧自由基濃度，抑制ox-ldl的形成。
本發(fā)明另一個(gè)技術(shù)方案中，在上述方案的基礎(chǔ)上，所述復(fù)合抗氧化劑還包括下述濃度的組分：
0.1～10mmol/l的含有ca2螯合劑的溶液；以及
1-100mmol/l的細(xì)胞保護(hù)劑溶液。
在一些實(shí)施例中，ca2螯合劑為edta及其二鈉鹽；所述細(xì)胞保護(hù)劑為茶堿。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明復(fù)合抗氧化劑的配方進(jìn)行說(shuō)明。
實(shí)施例1
所述復(fù)合抗氧化劑由下述濃度的溶液混合而成：
0.1mol/l檸檬酸鈉溶液、10μmol/lbht溶液、20μmol/l維生素e溶液、1mmol/ledta溶液、20μmol/l雙嘧達(dá)莫溶液以及15mmol/l茶堿溶液。
實(shí)施例2
所述復(fù)合抗氧化劑由下述濃度的溶液混合而成：
0.05mol/l檸檬酸鈉溶液、5μmol/lbht溶液、10μmol/l維生素e溶液、0.8mmol/ledta溶液、10μmol/l雙嘧達(dá)莫溶液以及10mmol/l茶堿溶液。
實(shí)施例3
所述復(fù)合抗氧化劑由下述濃度的溶液混合而成：
2mol/l檸檬酸鈉溶液、15μmol/lbht溶液、25μmol/l維生素e溶液、1.5mmol/ledta溶液、25μmol/l雙嘧達(dá)莫溶液以及20mmol/l茶堿溶液。
實(shí)施例4
所述復(fù)合抗氧化劑由下述濃度的溶液混合而成：
0.05mol/l檸檬酸鈉溶液、5μmol/lbht溶液、10μmol/l維生素e溶液、0.8mmol/ledta溶液、10μmol/l普羅布考溶液以及10mmol/l茶堿溶液。
實(shí)施例5
所述復(fù)合抗氧化劑由下述濃度的溶液混合而成：
2mol/l檸檬酸鈉溶液、15μmol/lbht溶液、25μmol/l維生素e溶液、1.5mmol/ledta溶液、25μmol/l普羅布考溶液以及20mmol/l茶堿溶液。
實(shí)施例6
所述復(fù)合抗氧化劑由下述濃度的溶液混合而成：
5mol/l磷酸鹽溶液、50μmol/lbha溶液、50μmol/l維生素c溶液、5mmol/ledta溶液、40μmol/l普羅布考溶液以及30mmol/l茶堿溶液。
實(shí)施例7
0.03mol/l磷酸鹽溶液、3μmol/ltbhq溶液、2μmol/lbha溶液、0.5mmol/ledta溶液、5μmol/l雙嘧達(dá)莫溶液以及3mmol/l茶堿溶液。
實(shí)施例8
所述復(fù)合抗氧化劑由下述濃度的溶液混合而成：
0.1mol/l檸檬酸鈉溶液、10μmol/lbht溶液、20μmol/l維生素e溶液以及20μmol/l雙嘧達(dá)莫溶液。
實(shí)施例9
0.01mol/l硼酸鹽溶液、1μmol/lbht溶液、0.5μmol/lbha溶液、1μmol/l雙嘧達(dá)莫。
實(shí)施例10
1mol/l三羥甲基氨基甲烷溶液、110μmol/pg溶液、95μmol/l多酚溶液、100μmol/l雙嘧達(dá)莫。
第二方面，本發(fā)明復(fù)合抗氧化劑的制法將各類抗氧化劑和保護(hù)劑分別用溶劑配制成特定濃度的溶液，混合均勻，即可。
在一個(gè)具體的實(shí)施例中，所述制法包括下述步驟：
步驟1、分別配制所述濃度的檸檬酸鈉溶液、edta溶液、bht溶液、維生素e溶液、雙嘧達(dá)莫溶液以及茶堿溶液；
步驟1.1將檸檬酸鹽加入蒸餾水配置成所述濃度的緩沖溶液；
步驟1.2將na2h2y·2h2o置于燒杯中加蒸餾水，微熱溶解后進(jìn)行稀釋，搖勻然后用caco3作為基準(zhǔn)物進(jìn)行標(biāo)定，即得所述濃度的edta溶液；
步驟1.3將bht標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶于甲醇溶液中，定容，得到所述濃度的bht溶液；
步驟1.4將維生素e置于棕色容量瓶中，用乙烷定容，即得維生素e溶液，避光保存；
步驟1.5取粉狀雙嘧達(dá)莫置于容器，加0.01mol/l鹽酸溶液適量，溶解完全后，繼續(xù)加入0.01mol/l鹽酸溶液定量稀釋制成所述濃度的雙嘧達(dá)莫溶液；
步驟1.6將茶堿加水微熱溶解后進(jìn)行稀釋成所述濃度，搖勻，即得茶堿溶液。
步驟2、將配置好的上述各種溶液混合均勻，即得所述復(fù)合抗氧化劑。
在另一個(gè)實(shí)施例中，為了使后續(xù)所述復(fù)合抗氧化劑涂布掛壁效果更佳，在上述步驟2中，混合各種溶液時(shí)，還加入1～50g/l可溶性的增粘劑，所述增粘劑選自聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇6000、瓊脂糖和果膠酸鈣中的一種或幾種。在一些實(shí)施例中，增粘劑優(yōu)選為聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇6000。在實(shí)際情況中，具體的可溶性增粘劑的加入量根據(jù)復(fù)合抗氧化劑的濃度在上述范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整。聚乙烯吡咯烷酮具有一定的粘接性，極易溶于水及含鹵代烴類溶劑、醇類、胺類、硝基烷烴及低分子脂肪酸等；聚乙二醇是水溶性高分子，且與聚乙烯吡咯烷酮協(xié)同作為粘接劑，具有較合適的粘度，適應(yīng)于本發(fā)明所述采集裝置。
第三方面，本發(fā)明提供了一種供用于生化檢測(cè)樣本的復(fù)合抗氧化劑使用的抗氧化采集裝置，其為帶蓋體的封閉式容器，本發(fā)明所述的復(fù)合抗氧化劑容納在所述容器中。
本發(fā)明的采集裝置可以盛裝液態(tài)、固態(tài)或固液混合生化樣品的容器。一般的，可設(shè)計(jì)成采集管或者采集袋的形式。在一些實(shí)施例中，所述采集管采用玻璃或塑料制成；所述采集袋采用塑料制成。進(jìn)一步優(yōu)選的，玻璃材質(zhì)為硅硼玻璃或石英玻璃；塑料材質(zhì)為pft、pbt或者pen等。采集管的蓋體為配套使用的膠塞、管蓋或者鋁塑膜，可以為插入式或者旋擰式的，實(shí)現(xiàn)密封目的。在一些實(shí)施例中，本發(fā)明使用的采樣裝置為現(xiàn)有的真空采血管。
在一些實(shí)施例中，所述復(fù)合抗氧化劑涂覆于所述管狀容器或袋裝容器的內(nèi)壁；或者涂覆于所述管狀容器或袋狀容器的內(nèi)壁和蓋體內(nèi)壁上。
在一些實(shí)施例中，所述涂覆面積不少于內(nèi)壁總面積的3/4；在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，所述涂覆面積與容器內(nèi)壁面積相等；或者所述涂覆面積與容器內(nèi)壁面積和蓋體內(nèi)壁面積之和相等；這兩種情況都屬于完全涂覆；形成三維空間結(jié)構(gòu)，在加入生化檢測(cè)樣本時(shí)能夠與復(fù)合抗氧化劑更充分的結(jié)合。
第四方面，本發(fā)明用于生化檢測(cè)標(biāo)本的抗氧化采樣裝置的制備方法大致為：直接將復(fù)合抗氧化劑倒入容器中，翻轉(zhuǎn)晃蕩，使內(nèi)壁均勻充分覆蓋復(fù)合抗氧化劑，將多余的復(fù)合抗氧化劑倒出即可。
在一個(gè)實(shí)施例中，所述抗氧化采樣裝置為采樣管，所述制備方法包括：將復(fù)合抗氧化劑溶液倒入管狀容器內(nèi)，蓋上密封蓋，翻轉(zhuǎn)晃蕩，直至所述管狀容器內(nèi)壁均勻掛漿，隨后將多余溶液倒出，即用或者管壁溶液干燥后待用。其中干燥的方式可以室溫下空氣干燥，或是適當(dāng)高溫下空氣干燥，或是真空干燥，或是其他。
第五方面，本發(fā)明提供了一種抗氧化采樣裝置的用途，其廣泛應(yīng)用于生化檢驗(yàn)、免疫檢驗(yàn)、微生物檢驗(yàn)、血液檢驗(yàn)以及寄生蟲檢驗(yàn)。在一些實(shí)施例中，該抗氧化采樣裝置用在血液、血清、血漿、洗嗽液、汗液、粘液、陰道分泌物、毛發(fā)、體腔的體液、細(xì)胞、活組織取樣中。
下面針對(duì)本發(fā)明復(fù)合抗氧化劑的抗氧化能力作出相關(guān)的抗氧化性能試驗(yàn)，并借此驗(yàn)證最佳配方的抗氧化性能。首先設(shè)置一組對(duì)照實(shí)施例：
對(duì)照實(shí)施例1
所述復(fù)合抗氧化劑由下述濃度的溶液混合而成：
0.1mol/l檸檬酸鈉溶液、10μmol/lbht溶液以及20μmol/l維生素e溶液。
試驗(yàn)例1添加不同配方的復(fù)合抗氧化劑的血液抗氧化活性測(cè)定
將添加抗氧化劑的血液作為試驗(yàn)對(duì)象，具體方法如下。
試驗(yàn)兔子若干只，靜脈采血，每只兔子所采集的血液分成7組，其中6組分別放置加入有3ml本發(fā)明實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例4、實(shí)施例8、實(shí)施例10以及對(duì)照實(shí)施例1的復(fù)合抗氧化劑，1組作為空白對(duì)照組；每個(gè)組別放入5ml血液，混合均勻，存放于室溫下或4℃環(huán)境中。分別在24小時(shí)后以及5天后，取血液，靜置或置37℃環(huán)境中促其凝固，待血液凝固后，將其平衡后離心(一般為3000rpm，離心5～10min)，得到的上清液即為血清。
1、dpph自由基清除能力的測(cè)定：
量取7組實(shí)驗(yàn)組的血清1ml于試管中，加入0.4mmol/l的dpph自由基溶液(用無(wú)水乙醇配制)0.2ml和2.0ml的蒸餾水，混勻反應(yīng)體系后，將其置于常溫下30min后于517nm波長(zhǎng)處測(cè)定各個(gè)管的吸光度a1。用相同體積的無(wú)水乙醇代替dpph溶液為空白組，記為a2；用相同體積的蒸餾水代替樣品溶液作為對(duì)照組，記為a0。所有測(cè)定值均為三次結(jié)果的平均值，根據(jù)以下公式計(jì)算自由基的清除率。
式中：a0為對(duì)照試驗(yàn)(水代樣品溶液)的吸光度；a1為樣品試驗(yàn)的吸光度；a2為樣品干擾試驗(yàn)(無(wú)水乙醇代dpph溶液)的吸光度。
2、羥自由基(·oh)清除能力測(cè)定：
采用鄰二氮菲法。準(zhǔn)確量取0.75mmol/l的鄰二氮菲溶液1.0ml置于干凈的試管中，再依次加入ph為7.4的pbs緩沖液2.0ml以及蒸餾水1.0ml，混勻反應(yīng)體系，加入1.0ml的0.75mmol/lfeso4溶液，然后用0.12％的雙氧水(現(xiàn)配現(xiàn)用)1.0ml啟動(dòng)反應(yīng)，立刻震蕩混和均勻，記為ap；用同體積的蒸餾水代替0.12％的雙氧水，其余的條件均同ap處理方法，記為ab；用相同體積的7組實(shí)驗(yàn)組的樣品溶液代替1.0ml的蒸餾水，其余條件均同ap處理方法，記為as。三個(gè)管ap、ab、as置于37℃水浴鍋中保溫1h，反應(yīng)結(jié)束后，用蒸餾水調(diào)零，在波長(zhǎng)為536nm的條件下測(cè)定各個(gè)管的吸光度，并將測(cè)得的吸光值代入到以下公式中計(jì)算羥自由基的清除率。
式中：ap為1ml鄰二氮菲+2mlpbs+1mllfeso4+1mlh2o2+1mlh2o的吸光值；ab為1ml鄰二氮菲+2mlpbs+1mllfeso4+2mllh2o的吸光值；as為1ml鄰二氮菲+2mlpbs+1mlfeso4+1mlh2o2+1ml樣品溶液的吸光值。
3、超氧陰離子(o2-·)清除率的測(cè)定：
取4.5ml、0.5mol/l、ph＝8.2的tris-hcl緩沖液于干凈的試管中，將其置于25℃的水浴鍋中保持溫度20min，然后向每個(gè)管內(nèi)加入1ml的7組實(shí)驗(yàn)組的血清，后準(zhǔn)確加入同樣經(jīng)25℃水浴預(yù)熱后的2.5mmol/l鄰苯三酚溶液0.4ml，混合均勻后置于25℃水浴鍋中，準(zhǔn)確反應(yīng)4min后立即加入1ml，8mol/l的hcl以終止該氧化反應(yīng)，以蒸餾水調(diào)零，于320nm波長(zhǎng)處測(cè)定各個(gè)管內(nèi)液體的吸光度，記為a樣；空白對(duì)照組以相同體積的上述tris-hcl緩沖液代替樣品溶液，其余條件均同樣品管處理方法，其吸光度記為a空。每個(gè)試管做三個(gè)平行管，取平均值，并將所得到的最終吸光值代入到以下公式中計(jì)算超氧陰離子的清除率。
式中：a空為空白對(duì)照組溶液的吸光值；a樣為樣品溶液的吸光值。
4、金屬離子(fe2+)螯合能力的比較：
分別取1ml的7組實(shí)驗(yàn)組的血清于試管中，依次準(zhǔn)確加入50μl的2.0mmol/l的氯化亞鐵溶液，200μl的5.0mmol/l的菲咯嗪溶液以及2.75ml的蒸餾水。振蕩混和均勻反應(yīng)體系，然后將其置于室溫下保存10min以后，以蒸餾水調(diào)零，于562nm的波長(zhǎng)處測(cè)定各個(gè)管的吸光度，記為a1；對(duì)照試驗(yàn)以相同體積的蒸餾水代替樣品血溶液，其余條件均同樣品管處理方法，其吸光度為a0；樣品干擾試驗(yàn)以相同體積的蒸餾水代替氯化亞鐵溶液，其余條件均同樣品管，其吸光度為a2。并將所測(cè)得的吸光度值取平均值后代入到以下公式中計(jì)算鐵離子的螯合率。
式中：a0為對(duì)照試驗(yàn)(水代樣品)管的吸光度；a1為樣品試驗(yàn)管的吸光度；a2為樣品干擾試驗(yàn)(水代氯化亞鐵)管的吸光度。
上述試驗(yàn)結(jié)果見表1。
表1不同配方的抗氧化采樣管對(duì)血液組分抗氧化活性的影響
由表1可知，實(shí)施例1-10的復(fù)合抗氧化劑具有良好的抗氧化性能，其中實(shí)施例1配方的復(fù)合抗氧化劑具有最佳抗氧化性能，其次是實(shí)施例2、實(shí)施例4。實(shí)施例1和實(shí)施例2比對(duì)，表明實(shí)施例1配方用量比更為優(yōu)選；實(shí)施例1和實(shí)施例8比較可知，再添加的edta和茶堿可提高抗氧化能力。實(shí)施例8和對(duì)照實(shí)施例1比較可知，添加雙嘧達(dá)莫的抗氧化劑抗氧化能力更佳。
試驗(yàn)例2不同配方的復(fù)合抗氧化劑采集的dna樣品的穩(wěn)定性隨時(shí)間的變化
對(duì)同一合成的目標(biāo)dna樣品(320bp)，設(shè)置14組，其中12組為加入復(fù)合抗氧化劑的試驗(yàn)組，2組為對(duì)照組。
其中6組試驗(yàn)組分別與水按體積比5:0.1加入實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例4、實(shí)施例9、實(shí)施例10和對(duì)照實(shí)施例1的復(fù)合抗氧化劑備用；目標(biāo)dna(320對(duì)堿基對(duì))，無(wú)菌去離子水溶解，加入上述備用的復(fù)合抗氧化劑溶液，再加dna酶i至終量為0.1u，4℃下冷藏24小時(shí)。1組對(duì)照組：目標(biāo)dna(4320對(duì)堿基對(duì))，無(wú)菌去離子水溶解，加入dna酶i至終量為0.1u，4℃冷藏24小時(shí)。
另其中6組試驗(yàn)組分別與水按體積比5:0.1加入實(shí)施例1、實(shí)施例2、實(shí)施例4、實(shí)施例9、實(shí)施例10和對(duì)照實(shí)施例1的復(fù)合抗氧化劑備用；目標(biāo)dna(320對(duì)堿基對(duì))，無(wú)菌去離子水溶解，加入上述備用的復(fù)合抗氧化劑溶液，再加dna酶i至終量為0.1u，4℃下冷藏5天。1組對(duì)照組：目標(biāo)dna(320對(duì)堿基對(duì))，無(wú)菌去離子水溶解，加入dna酶i至終量為0.1u，4℃冷藏5天。
將不同試驗(yàn)組處理后的目標(biāo)dna進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，瓊脂糖含量為2％，著色劑染色，記錄結(jié)果。
結(jié)果依據(jù)dna分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)。結(jié)果為：其中2組對(duì)照組分布有兩個(gè)條帶；2組對(duì)照組實(shí)施例1的試驗(yàn)組分布有兩個(gè)條帶；10組實(shí)施例的試驗(yàn)組僅一個(gè)條帶；說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案可在室溫下將目標(biāo)dna進(jìn)行穩(wěn)定保存，且保存時(shí)間長(zhǎng)至5天。
以上所述的實(shí)施方式，并不構(gòu)成對(duì)該技術(shù)方案保護(hù)范圍的限定。任何在上述實(shí)施方式的精神和原則之內(nèi)所作的修改、等同替換和改進(jìn)等，均應(yīng)包含在該技術(shù)方案的保護(hù)范圍之內(nèi)。