本發(fā)明涉及型熒光化合物技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種穴狀多羥基熒光化合物及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

熒光分析是一種靈敏性高、選擇性強、使用簡便的分析方法，被廣泛應(yīng)用于分析化學(xué)、生物分析、環(huán)境工程、材料科學(xué)、醫(yī)藥等領(lǐng)域。熒光化合物是一種具有特殊光學(xué)性能的物質(zhì)，當(dāng)吸收紫外、可見光等能量后，電子躍遷至激發(fā)態(tài)，然后發(fā)生輻射衰變回復(fù)到基態(tài)，放出光子，產(chǎn)生熒光。近年來，人們以杯芳烴——一類由亞甲基橋連苯酚單元所形成的新型空穴狀化合物為分子平臺，研制出各種熒光探針化合物，在臨床診斷、分子生物學(xué)等醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著廣闊的潛在應(yīng)用價值。例如，杯芳烴衍生物可作為金屬離子熒光識別試劑測定人體血漿內(nèi)na⁺、k⁺、ca²⁺和mg²⁺等金屬離子。

鐵，是人體必需的微量元素之一，豐富存在于生物體內(nèi)。在許多生化反應(yīng)中，fe³⁺扮演著非常重要的角色，它的缺乏與過量都會使機體的功能發(fā)生紊亂，例如，阿爾茲海默癥、帕金森綜合征和貧血等疾病的發(fā)生發(fā)展都與體內(nèi)鐵離子濃度的異常有密切關(guān)系。因此，開發(fā)用于定量檢測人體內(nèi)fe³⁺的選擇性熒光探針，對于保證生命健康具有重要意義。目前鐵離子熒光探針有金屬有機骨架材料(如tb-mof)、羅丹明類、納米材料(如s-gqds、gsh@agnc)等，但是這些熒光探針合成方法繁瑣，毒副作用較差。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種穴狀多羥基熒光化合物，其易于合成，選擇性高，無明顯細胞毒性，可以根據(jù)熒光強度的變化檢測出體內(nèi)fe³⁺的含量。

為實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種穴狀多羥基熒光化合物，具有如式i所示的結(jié)構(gòu)。

作為一種優(yōu)選方案，具有如式i所示結(jié)構(gòu)的穴狀多羥基熒光化合物對li⁺、na⁺、k⁺、ca²⁺、mg²⁺、al³⁺、pb²⁺、zn²⁺、cd²⁺、co²⁺、ni²⁺和fe³⁺均具有選擇性。

作為一種優(yōu)選方案，具有如式i所示結(jié)構(gòu)的穴狀多羥基熒光化合物對fe³⁺的檢測極限達到4.47ppm。

一種穴狀多羥基熒光化合物的制備方法，包括以下步驟，

1).將鄰苯三酚充分溶于乙醇和鹽酸中，形成混合物a；

2).將混合物a冰凍，并在冰凍后的混合物a上逐滴滴加丁醛，形成混合物b；

3).將混合物b溫?zé)嶂潦覝?，再在氬氣保護下加熱回流22-26小時；

4).待冷卻至室溫后，使混合物b在溫度為-20℃的條件下放置22-26小時，經(jīng)抽濾后，得到固體；

5).用冰凍的乙醇反復(fù)對由步驟4)制得的固體進行洗滌，直至廢液變澄清；

6).將經(jīng)洗滌后的固體放置在溫度為80℃-120℃的條件下真空干燥14-18小時，得到淡粉紅色粉末即穴狀多羥基熒光化合物。

作為一種優(yōu)選方案，步驟1)混合物a中的鄰苯三酚、乙醇和鹽酸的質(zhì)量比為10:40-50:3-8，所述乙醇的體積濃度為95％，鹽酸的質(zhì)量分數(shù)為36％。

作為一種優(yōu)選方案，步驟2)中的丁醛與混合物a的質(zhì)量比為1:9-11。

作為一種優(yōu)選方案，步驟3)和4)中的室溫的溫度范圍為18℃-25℃。

作為一種優(yōu)選方案，步驟5)中乙醇的體積濃度為95％。

作為一種優(yōu)選方案，步驟6)中的真空度為0.1mpa。

作為一種優(yōu)選方案，具有如式i所示結(jié)構(gòu)的穴狀多羥基熒光化合物對環(huán)境或生物體內(nèi)fe³⁺進行識別檢測。

本發(fā)明穴狀多羥基熒光化合物對金屬離子的識別能力是依據(jù)其自身熒光激發(fā)峰強度的變化來進行分析判斷的。通過各種不同金屬離子對本發(fā)明穴狀多羥基熒光化合物的熒光滴定實驗，發(fā)現(xiàn)金屬離子的存在可以使熒光強度發(fā)生變化，尤其是fe³⁺能使熒光發(fā)生猝滅，而且對fe³⁺檢測極限達到4.47ppm。因此，本發(fā)明化合物能作為熒光探針對fe³⁺進行識別檢測。

通過使用不同濃度本發(fā)明穴狀多羥基熒光化合物對hek293細胞(人胚腎細胞)生長進行干預(yù)，檢測本發(fā)明穴狀多羥基熒光化合物對人類正常細胞的影響。具體使用mtt方法：外源性的mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2、5-二苯基四氮唑溴鹽)在活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶的作用下能被還原為不溶于水的藍紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此作用。dmso(二甲基亞砜)能溶解細胞中的甲瓚，用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量。mtt實驗表明，一定濃度范圍內(nèi)的本發(fā)明穴狀多羥基熒光化合物對正常活細胞無明顯毒性。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明穴狀多羥基熒光化合物對fe³⁺具有很好的識別性能，該穴狀多羥基熒光化合物對fe³⁺檢測極限達到4.47ppm，且制備方法簡易，對細胞無明顯毒性，在環(huán)境、生物體內(nèi)fe³⁺的檢測等方面具有廣泛應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明穴狀多羥基熒光化合物的核磁共振碳譜；

圖2為本發(fā)明穴狀多羥基熒光化合物的核磁共振氫譜；

圖3為本發(fā)明穴狀多羥基熒光化合物對各種金屬離子的熒光識別光譜；

圖4為本發(fā)明穴狀多羥基熒光化合物對不同濃度的鐵離子的熒光識別光譜；

圖5為經(jīng)不同濃度本發(fā)明穴狀多羥基熒光化合物干預(yù)hek293細胞24、48和72h后的細胞活性圖。

具體實施方式

實施例1

1).將20g酚充分溶于107ml體積濃度為95％的乙醇和38ml質(zhì)量分數(shù)為36％的鹽酸中，形成混合物a；

2).將混合物a冰凍，并在冰凍后的混合物a上逐滴滴加16ml丁醛，形成混合物b；

3).將混合物b溫?zé)嶂?5℃，再在氬氣保護下加熱回流22小時；

4).待冷卻至25℃后，使混合物b在溫度為-20℃的條件下放置22小時，經(jīng)抽濾后，得到固體；

5).用5ml體積濃度為95％的冰乙醇反復(fù)對由步驟4)制得的固體進行洗滌，直至廢液變澄清；

6).將經(jīng)洗滌后的固體放置在溫度為80℃、真空度為0.1mpa的條件下真空干燥18小時，得到淡粉紅色粉末即穴狀多羥基熒光化合物。

實施例2

1).將20g鄰苯三酚充分溶于133ml體積濃度為95％的乙醇和14ml質(zhì)量分數(shù)為36％的鹽酸中，形成混合物a；

2).將混合物a冰凍，并在冰凍后的混合物a上逐滴滴加14.3ml丁醛，形成混合物b；

3).將混合物b溫?zé)嶂?8℃，再在氬氣保護下加熱回流26小時；

4).待冷卻至18℃后，使混合物b在溫度為-20℃的條件下放置26小時，經(jīng)抽濾后，得到固體；

5).用5ml體積濃度為95％的冰乙醇反復(fù)對由步驟4)制得的固體進行洗滌，直至廢液變澄清；

6).將經(jīng)洗滌后的固體放置在溫度為120℃、真空度為0.1mpa的條件下真空干燥14小時，得到淡粉紅色粉末即穴狀多羥基熒光化合物。

實施例3

1).將20g鄰苯三酚充分溶于120ml體積濃度為95％的乙醇和24ml質(zhì)量分數(shù)為36％的鹽酸中，形成混合物a；

2).將混合物a冰凍，并在冰凍后的混合物a上逐滴滴加14.4ml丁醛，形成混合物b；

3).將混合物b溫?zé)嶂?0℃，再在氬氣保護下加熱回流24小時；

4).待冷卻至20℃后，使混合物b在溫度為-20℃的條件下放置24小時，經(jīng)抽濾后，得到固體；

5).用5ml體積濃度為95％的冰乙醇反復(fù)對由步驟4)制得的固體進行洗滌，直至廢液變澄清；

6).將經(jīng)洗滌后的固體放置在溫度為100℃、真空度為0.1mpa的條件下真空干燥16小時，得到淡粉紅色粉末即穴狀多羥基熒光化合物。

綜上可知，本發(fā)明穴狀多羥基熒光化合物的制備方法簡單，且制備原料價廉易得，便于工業(yè)生產(chǎn)。

以上實施例中，實施例3為最優(yōu)方案，實施例4-8中所使用的穴狀多羥基熒光化合物均由實施例3制得。

實施例4

對本發(fā)明穴狀多羥基熒光化合物中的碳進行核磁共振，得到核磁共振碳譜，結(jié)果如圖1所示。

實施例5

對本發(fā)明穴狀多羥基熒光化合物中的氫進行核磁共振，得到核磁共振氫譜，結(jié)果如圖2所示。

實施例6

本發(fā)明穴狀多羥基熒光化合物對各種金屬離子的熒光識別實驗

實驗說明：參與熒光識別的金屬化合物是lino3、nano3、kno3、ca(no3)2、mg(no3)2、al(no3)3、pb(no3)2、zn(no3)2、cd(no3)2、co(no3)2、ni(no3)2和fe(no3)3。所有金屬化合物的濃度為0.01m。

實驗步驟：在若干個5ml容量瓶中加入5mg本發(fā)明穴狀多羥基熒光化合物，然后再分別加入以上金屬溶液，最后用經(jīng)5a分子篩干燥的定溶劑dmf(n,n-二甲基甲酰胺)定容，在超聲頻率為10khz的條件下超聲20分鐘，室溫下放置12小時后進行測試，記錄數(shù)據(jù)，得到實驗結(jié)果。

實驗結(jié)果：

由圖3可知，no^3-不會影響本發(fā)明化合物的熒光強度，而熒光強度的變化確實是由金屬離子本身引起的。本發(fā)明穴狀多羥基熒光化合物在未加任何金屬的時候，在512nm處有最強激發(fā)峰，隨著金屬化合物的加入，最強激發(fā)峰的熒光強度出現(xiàn)了變化。尤為顯著的是fe(no3)3可以使熒光猝滅，因此本發(fā)明穴狀多羥基熒光化合物可作為fe³⁺的熒光探針。除此之外，除了nano3和pb(no3)2能使本發(fā)明穴狀多羥基熒光化合物在512nm處的熒光強度增強外，lino3、kno3、ca(no3)2、mg(no3)2、al(no3)3、zn(no3)2、cd(no3)2、co(no3)2和ni(no3)2都能一定程度地減弱這個最強激發(fā)峰的熒光。

實施例7

本發(fā)明化合物熒光被fe(no3)3逐漸猝滅實驗

實驗步驟：稱取5mg本發(fā)明穴狀多羥基熒光化合物溶于5ml經(jīng)過5a分子篩干燥的dmf(n,n-二甲基甲酰胺)溶液中，在超聲頻率為10khz的條件下超聲處理20分鐘，靜置12小時后再在超聲頻率為10khz的條件下超聲處理20分鐘，然后測試，逐滴滴加fe(no3)3(1000ppm)，記錄數(shù)據(jù)，繪制得到實驗結(jié)果。

實驗結(jié)果：

由圖4可知，隨著fe(no3)3濃度的逐漸增加，熒光強度逐漸減弱，最后發(fā)生猝滅。

實施例8

本發(fā)明穴狀多羥基熒光化合物用于mtt細胞毒性實驗

實驗步驟：

(1)不同濃度本發(fā)明穴狀多羥基熒光化合物的配制

將hek293細胞(人胚腎細胞)放入96孔板內(nèi)進行培養(yǎng)。用dmso(二甲基亞砜)將本發(fā)明穴狀多羥基熒光化合物配成40mg/ml，然后將40mg/ml的本發(fā)明穴狀多羥基熒光化合物溶液分別用不含血清的高糖dmem培養(yǎng)液稀釋成25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml和300μg/ml的溶液，并放在溫度為4℃的條件下保存。待96孔板內(nèi)的細胞貼壁后，分別取10μl上述配好的溶液放于已經(jīng)含有90μl含血清培養(yǎng)液的96孔板內(nèi)培養(yǎng)(本發(fā)明穴狀多羥基熒光化合物的濃度被稀釋10倍，在孔內(nèi)的本發(fā)明穴狀多羥基熒光化合物濃度分別為2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml和30μg/ml)。

(2)細胞培養(yǎng)——計數(shù)——接板

hek293細胞(人胚腎細胞)貼壁生長至90-95％即可傳代。在超凈工作臺內(nèi)，吸棄上述96孔板內(nèi)的培養(yǎng)液，再用2ml經(jīng)高壓除菌后的pbs(磷酸鹽緩沖液)對96孔板內(nèi)的貼壁細胞進行潤洗，然后加入1ml胰蛋白酶(gibco公司生產(chǎn)的0.25％trypsin-edta)對96孔板內(nèi)的貼壁細胞進行消化，在顯微鏡下觀察至大部分細胞縮小變后圓后，立刻加入2ml培養(yǎng)液終止消化，然后用離心管吸取15ml經(jīng)消化后的細胞液并將其放入離心機中，以1000r/min的轉(zhuǎn)速進行離心5分鐘。去除上清液后，加入1ml培養(yǎng)液，然后將底部沉淀的細胞打散均勻形成細胞懸液。吸取400μl細胞懸液放入另一培養(yǎng)器皿中進行培養(yǎng)，另外再吸取100μl細胞懸液放于細胞計數(shù)板數(shù)數(shù)，然后對余下500μl細胞懸液進行稀釋使其密度達到5.6*10⁴/ml，并將稀釋后的細胞懸液接種于3塊96孔板(每孔加入90μl細胞懸液)內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。

(3)mtt試驗

次日觀察96孔板內(nèi)的細胞生長狀況，待細胞貼壁后，分別加入10μl(25μg/ml)、10μl(50μg/ml)、10μl(100μg/ml)、10μl(200μg/ml)和10μl(300μg/ml)的本發(fā)明化合物和不含血清的高糖dmem培養(yǎng)液于孔內(nèi)。mtt(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2、5-二苯基四氮唑溴鹽)溶解于pbs(磷酸鹽緩沖液)中形成mtt溶液。培養(yǎng)1、2、3天后，在孔內(nèi)分別加入10μl(5mg/ml)經(jīng)過濾除菌的mtt溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時后，吸棄孔內(nèi)廢液，每孔加入150μldmso(二甲基亞砜)溶液，放置搖床(其林貝爾儀器制造有限公司生產(chǎn)的ts-2搖床)在擺振幅度為70rpm的條件下?lián)u晃20分鐘，最后用酶聯(lián)免疫檢測儀(伯騰儀器公司生產(chǎn)的epoch系列)在490nm波長處測定光吸收值，記錄數(shù)據(jù)，以本發(fā)明穴狀多羥基熒光化合物的濃度為橫坐標，細胞活力為縱坐標繪制柱狀圖，如圖5所示。

實驗結(jié)果：

由圖5可知，在一定濃度范圍內(nèi)的本發(fā)明穴狀多羥基熒光化合物對正?；罴毎麩o明顯毒性。

以上所述的僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。