本發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域的生物質(zhì)炭搭載微生物的菌劑，特別是一種適用于多種設(shè)施地作物的固體微生物菌劑的制備方法及其在防治西瓜枯萎病害方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來我國設(shè)施蔬菜迅速發(fā)展，種植面積達5832.6萬畝，設(shè)施栽培條件下，地表長期覆蓋栽培改變了土壤原有的生態(tài)環(huán)境，土壤常處于高溫、高濕、高蒸發(fā)、無雨水淋溶的封閉循環(huán)代謝環(huán)境中，土壤的理化性狀和生物學特性發(fā)生變化，土壤板結(jié)、孔隙度降低，土壤鹽分表積現(xiàn)象明顯，土壤質(zhì)量持續(xù)惡化加劇。加之農(nóng)藥、化肥過量施用和沉積，土壤重金屬和抗生素等有毒有害物質(zhì)逐漸累積，微生物種群數(shù)量及結(jié)構(gòu)變化，土壤生物毒性增強，從而導(dǎo)致土壤酸化、次生鹽漬化和土傳病害加重的連作生產(chǎn)障礙矛盾突出，成為制約設(shè)施栽培蔬菜持續(xù)、高效發(fā)展的主要因素。

目前防治連作障礙的農(nóng)業(yè)措施主要有：（1）實施輪作。輪作和間套輪作是解決連作障礙最為簡單和有效的方法。通過與病原菌非寄主植物的輪作，或者在高溫連作病害易發(fā)時期錯栽種，土壤中的病原菌數(shù)可以得到顯著的降低，但是在很多情況下為了提高經(jīng)濟效益，又不得不進行某些蔬菜的連作，此方法往往得不到切實的執(zhí)行。（2）土壤消毒。土壤消毒包括化學藥劑消毒和物理消毒法?；瘜W藥劑方法主要包括使用福爾馬林、多菌靈或五氯硝基苯拌土或者用硫磺粉殺菌，也可以用藥液噴澆或者拌藥土溝施、穴施處理土壤；或者采用溴甲烷熏蒸土壤。物理方法主要是采用高溫或者低溫使有害菌的數(shù)量減少。夏季高溫季節(jié)，灌水后高溫悶棚，也可采用給土壤同高溫蒸汽殺蟲滅菌，可以大大減少土傳病蟲害的數(shù)量。低溫冷凍法，北方冬季嚴寒，不能利用的保護地，可以撤掉膜后深翻土壤，凍死病菌及蟲卵。土壤消毒法一般在殺滅病蟲害的同時也對一些有益生物造成毀滅性傷害，特別是化學消毒法，價格昂貴，持效期短，還有可能破壞土壤結(jié)構(gòu)及環(huán)境污染，防治效果不理想，不利于大面積推廣。（3）抗性品種的應(yīng)用。病蟲害加重是導(dǎo)致作物連作障礙的重要因素，選育具有抗性的新品種以及對難以育成抗病品種的作物采用抗性砧木進行嫁接栽培，可以有效防止多種土傳病害和線蟲的危害。但是由于抗病品種資源的限制以及選育周期等問題，抗病品種的選育工作遠遠滯后于病害發(fā)生的速度；嫁接的方法有效解決土傳病害的同時，也帶來作物產(chǎn)品品質(zhì)和口感下降等問題。（4）合理施肥。目前生產(chǎn)上應(yīng)用的專用肥對于減輕作物連作障礙效果明顯，此外，增施有機肥也是減輕連作障礙的有效措施。連作障礙的產(chǎn)生涉及到作物、土壤、環(huán)境等生物的、非生物的諸多復(fù)雜因素，加上這些因素的相互影響，使得解決這一問題更加復(fù)雜，任何單一的措施或通過少數(shù)幾個措施都很難收到理想的效果。因此，解決設(shè)施栽培蔬菜生產(chǎn)連作障礙的關(guān)鍵是改善土壤理化性狀，增加土壤有益微生物種群的數(shù)量，提高土壤肥力。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供不含有對環(huán)境有害物質(zhì)，具有肥效好，抗逆性強，具有土壤改良性質(zhì)和改善土壤微生態(tài)結(jié)構(gòu)等綜合效果的一種防治西瓜枯萎病的生物質(zhì)炭搭載微生物的菌劑，可有效防治西瓜枯萎病害，本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：

一種防治西瓜枯萎病害的生物質(zhì)炭基微生物菌劑，包括固相組分和液相組分；

固相組分：以質(zhì)量百分比計，生物質(zhì)炭40-50%，凹凸棒土20-25%，以過磷酸鈣或硝基腐殖酸補足余量；

液相組分：包括生防細菌發(fā)酵液（菌含量為1~9×10¹²cfu/ml）和無菌水；

其中，生防細菌發(fā)酵液與固相組分的體積質(zhì)量比（l/kg）為0.01-0.03:1;無菌水的質(zhì)量為固相組分質(zhì)量的30-50%，菌劑中生防菌的活菌數(shù)≥50億cfu/g。

進一步，本發(fā)明中所述生防細菌為西瓜枯萎病的生防細菌，具體可以為特基拉芽孢桿菌、死谷芽孢桿菌、棲稻假單胞菌或枯草芽孢桿菌中的一種或多種。

進一步，本發(fā)明中，所述生物質(zhì)炭是這樣獲得的：以稻殼、作物秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物為原料，用高溫開啟式管式爐在400-700℃厭氧條件下保溫處理1-2小時，自然冷卻至室溫，研磨并過40目篩，121℃滅菌1h，即獲得生物質(zhì)炭。

進一步，本發(fā)明中，所述凹凸棒土為農(nóng)用凹凸棒土緩釋造粒劑，優(yōu)選以質(zhì)量百分比計，二氧化硅含量50.4%、氧化鋁氧化是9.8%，氧化鐵4%，氧化錳0.04%，氧化鉀1.0%，氧化鈣1.8%，氧化鎂0.04%，灼堿13.8%，余量為土質(zhì)成分；過磷酸鈣為市售過磷酸鈣顆粒肥，優(yōu)選其中80%～95%溶于水，有效磷含量≥12%。

本發(fā)明所述防治西瓜枯萎病的生物質(zhì)炭基微生物菌劑的制備方法，其具體步驟如下：

步驟一，將生防細菌發(fā)酵制成菌含量為10¹²cfu/ml的發(fā)酵液，備用；

步驟二，將生物質(zhì)炭與生防細菌發(fā)酵液混勻，使生防細菌充分被生物質(zhì)炭吸附，混勻。

步驟三，將固相組分（生物質(zhì)炭、凹凸棒土、過磷酸鈣或/和硝基腐殖酸）按比例在無菌條件下混合均勻，再加入無菌水充分攪拌，然后轉(zhuǎn)移到圓盤造粒機中制備顆粒劑，顆粒直徑為3~6mm，ph值6.5~7.5，取出顆粒于自然條件下通風干燥至顆粒濕度≤20%（約3-4天），菌劑中生防菌的活菌數(shù)≥50億cfu/g，即獲得所述生物質(zhì)炭基微生物菌劑。

進一步，本發(fā)明所述防治西瓜枯萎病的生物質(zhì)炭基微生物菌劑的制備方法中，步驟一中生防細菌發(fā)酵液指：將生防細菌接種于lb液體培養(yǎng)基中，37±1℃，200rpm搖床培養(yǎng)至菌含量為10¹²cfu/ml（約48小時）；

如本發(fā)明所述生物質(zhì)炭基微生物菌劑在防治西瓜枯萎病中的應(yīng)用。

進一步，發(fā)明所述生物質(zhì)炭基微生物菌劑在防治西瓜枯萎病中的應(yīng)用是指：該菌劑在西瓜苗2片真葉移栽時穴施，每株用量100g。

本發(fā)明中，所述的lb液體培養(yǎng)基為：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，加水至1l，ph7.0-7.5。

本發(fā)明利用生物炭的改良土壤性能及有效吸附土壤微生物的特點，利用其豐富的炭源，適宜的孔隙結(jié)構(gòu)以及保水等優(yōu)點，以生物質(zhì)炭搭載植物內(nèi)生生防細菌，制成優(yōu)良的設(shè)施栽培土壤改良劑，既能達到改良土壤性能，又能在作物根際引入有益微生物目的。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明以稻殼、農(nóng)作物秸稈等廢棄物為原料，材料易得，制備方法簡單，使用方便；能夠有效提高生防菌的存活時間；增加土壤有益菌的數(shù)量，增強土壤酶活力，提高土壤肥力，對如西瓜枯萎病等多種土傳病害具有較強的預(yù)防與治療作用。

附圖說明

圖1為本發(fā)明防治西瓜枯萎病的生物質(zhì)炭基微生物菌劑顆粒圖片；

圖2為本發(fā)明防治西瓜枯萎病的生物質(zhì)炭基微生物菌劑貨架期檢測結(jié)果示意圖；

圖3為本發(fā)明防治西瓜枯萎病的生物質(zhì)炭基微生物菌劑施用后生防菌在土壤中的存活數(shù)量示意圖；

圖4為本發(fā)明防治西瓜枯萎病的生物質(zhì)炭基微生物菌劑對土壤酶活性的影響結(jié)果示意圖；

圖5為發(fā)明防治西瓜枯萎病的生物質(zhì)炭基微生物菌劑對西瓜苗期生長的影響及對枯萎病的防治效果示意圖。

具體實施方式

為幫助更好地理解本發(fā)明思想的實質(zhì)，以下通過具體實施例詳細說明本發(fā)明的實施方案，并非是不作為對本發(fā)明實施范圍的限定。

下述實施例中死谷芽孢桿菌、特基拉芽孢桿菌、枯草桿菌分離至健康的番茄植株，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學院產(chǎn)地環(huán)境研究室純化、鑒定、保存。西瓜枯萎病菌分離至發(fā)病西瓜植株，由江蘇農(nóng)科學院質(zhì)量安全所產(chǎn)地環(huán)境研究室分離純化保存。

實施例中涉及的原料及培養(yǎng)基：

lb液體培養(yǎng)基（1l）：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，加水至1l，ph7.0-7.5；

lb固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，瓊脂粉20g，，加水至1l，ph7.0-7.5，121℃滅菌20min，冷卻備用；

lb平板：將lb固體培養(yǎng)基在微波爐中融化，冷卻至50℃左右，在無菌操作臺中倒入滅菌培養(yǎng)皿中，冷卻得lb平板；

凹凸棒土：購自常州鼎邦礦產(chǎn)品科技有限公司的農(nóng)用凹凸棒土緩釋造粒劑；其中二氧化硅含量50.4%、氧化鋁氧化是9.8%，氧化鐵4%，氧化錳0.04%，氧化鉀1.0%，氧化鈣1.8%，氧化鎂0.04%，灼堿13.8%，余量為土質(zhì)成分；

過磷酸鈣為市售過磷酸鈣顆粒肥：購自中化化肥有限公司，其中80%～95%溶于水，有效磷含量≥12%。

實驗器材：

高溫開啟式管式爐購自中國科學院上海光學精密機械研究所，型號sg-gl1100k；

實施例1制備防治西瓜枯萎病的生物質(zhì)炭基微生物菌劑

步驟一，取純化后的生防細菌（特基拉芽孢桿菌和死谷芽孢桿菌），接入到lb液體培養(yǎng)基中，37±1℃搖床（150rpm）培養(yǎng)48小時，獲得菌含量為10¹²cfu/ml的生防細菌發(fā)酵液，備用。

步驟二，以稻殼為原料，采用高溫開啟式管式爐500℃（具體實施過程中，管式爐溫度可以控制在400-700℃范圍內(nèi)）厭氧條件下制得生物質(zhì)炭，粉碎過40目篩，在121℃滅菌鍋內(nèi)滅菌1h（具體實施過程中，可根據(jù)實際情況滅菌1-2h）后取出，獲得稻殼生物質(zhì)炭，備用。

步驟三，取總量為20kg的稻殼生物質(zhì)炭、凹凸棒土和過磷酸鈣（稻殼生物質(zhì)炭、凹凸棒土和過磷酸鈣按照4:2:1的質(zhì)量比配比），取步驟一中生防菌發(fā)酵液0.2l，與物質(zhì)炭混合均勻，使生物質(zhì)炭充分吸附生防菌；然后加入余下組分，混合均勻，加入占固相組分總量50%的無菌水攪拌混勻后，轉(zhuǎn)移到有機肥圓盤造粒機中，220v、45r/min、2小時制備顆粒劑，微生物菌肥顆粒大小為3~6mm，然后在室內(nèi)25℃下通風干燥3-4天，濕度≤20%。即可得到生物質(zhì)炭基微生物菌劑（如圖1所示），菌劑中生防菌活菌數(shù)約為56億cfu/g。

在具體實施過程中，可以選擇特基拉芽孢桿菌、死谷芽孢桿菌、棲稻假單胞菌或枯草芽孢桿菌中的一種或多種制備生防菌發(fā)酵液，只要確保菌劑中生防菌含量為10¹²cfu/ml，均可實現(xiàn)發(fā)明之目的；無菌水加入量可以在固相組分質(zhì)量30-50%的范圍內(nèi)選擇。

本實施例中所使用的是以稻殼制備的生物質(zhì)炭，具體操作中，也可以使用其他植物秸稈制備的生物質(zhì)炭。

實施例2菌劑的貨架期試驗

(1)將實施例1步驟一獲得的生防細菌發(fā)酵液用生理鹽水進行稀釋使其與步驟三獲得的生物質(zhì)炭基微生物菌劑的初始均量相同，含菌量均為約56億cfu/g，室溫密封保存。

(2)生防細菌發(fā)酵液及生物質(zhì)炭基微生物菌劑中生防菌數(shù)量測定：取50ml生防細菌發(fā)酵液（或50g生物質(zhì)炭基微生物菌劑），加入無菌水定容至1000ml，放入搖床30℃200r/min震蕩30min；取10ml溶液到100ml容量瓶中，定容到100ml，再10倍稀釋5次后，取100ul在lb平板上涂板，30℃倒置培養(yǎng)12h，統(tǒng)計菌落數(shù)，設(shè)置3次重復(fù)；每毫升發(fā)酵液（每克菌劑）中的活菌數(shù)=(a*n*v1)/(v2*m)，公式中a:平板菌落計數(shù)平均值，n:稀釋倍數(shù)，v1：品初始稀釋體積，v2：涂平板的稀釋菌液體積，m：取樣體積。

(3)貨架期檢測取樣時間持續(xù)12個月。

(4)實驗結(jié)果如圖2所示，由圖2可見，發(fā)酵液在第7個月檢測時，活菌數(shù)為1.0×10⁷cfu/ml，而生物質(zhì)炭基微生物菌劑在第12個月檢測時，活菌數(shù)為1.4×10⁸cfu/g，利用秸稈生物質(zhì)炭搭載微生物制成生物質(zhì)炭基微生物菌劑后，顯著延長了貨架期。

實施例3生物質(zhì)炭基微生物菌劑施用后對土壤酶活性的影響

(1)為了排除土壤中雜菌的干擾，首先將生物質(zhì)炭基微生物菌劑中的芽孢桿菌進行抗生素標記：將芽孢桿菌接種于含1μg/ml利福平的lb平板上，逐步增加利福平的濃度至300μg/ml，篩選出能穩(wěn)定生長且生理特性與原始菌株一致的抗生素抗性菌株，按照實施例1的步驟制備生物質(zhì)炭基微生物菌劑；

(2)設(shè)置2個處理：

a.取大田土10kg，按照質(zhì)量百分比2%的比例加入步驟（1）獲得的生物質(zhì)炭基微生物菌劑，混勻后放置到室溫密封保存；

b.抗性菌株按照實施例1中步驟一方法制備生防細菌發(fā)酵液，按照處理a中菌的總量接入10kg大田土壤中，混勻室溫密封保存；

(3)生防菌在土壤中的存活數(shù)量測定：測定方法同實施例2中步驟（2）；

(4)土壤酶活性測定：上述處理30天后，各處理取10g土樣，測定土壤中纖維素酶、中性蛋白酶、蔗糖酶、脲酶、過氧化氫酶、脫氫酶活性酶活性，實驗步驟參見蘇州科銘生物技術(shù)有限公司土壤酶測定試劑盒說明書（http://www.cominbio.com/a/chanpinzhanshi/ziyoupinpaishijihe/turangxilie/）。

(5)生防菌在土壤中的存活數(shù)量結(jié)果如圖3所示，表明接種生防菌發(fā)酵液處理7天時檢測活菌數(shù)為6.72×10⁹cfu/g，但是隨著時間的延長，活菌數(shù)迅速下降，到120天時活菌數(shù)僅為2.5×10⁸cfu/g；而生物質(zhì)炭基微生物菌劑處理的有效活菌數(shù)則是一個由緩慢釋放到數(shù)量迅速增長在緩慢下降的過程，在處理7天時檢測活菌數(shù)只有7.03×10⁹cfu/g，但是處理21天時活菌數(shù)達到峰值9.83×10⁹cfu/g，之后活菌數(shù)緩慢下降到處理120天時，有效活菌數(shù)仍有2.98×10⁹cfu/g，說明利用生物質(zhì)炭搭載芽孢桿菌制成的菌劑能夠顯著延長生防菌在土壤中的存活時間。

(6)土壤酶活性結(jié)果如圖4所示，圖4中，ns為大田土；b為菌液(處理b)；bc為菌劑（處理a）；

由圖4可見，使用本發(fā)明生物質(zhì)炭基微生物菌劑處理后顯著增強了土壤中纖維素酶、蔗糖酶、脲酶、過氧化氫酶、脫氫酶活性酶的活性，但是中性蛋白酶活性降低，這可能不利于土壤中大分子蛋白降解為氨基酸等產(chǎn)物。

實施例4西瓜苗期生長及枯萎病防治效果盆栽試驗

盆栽試驗在江蘇省農(nóng)業(yè)科學院日光溫室內(nèi)進行。設(shè)4個處理：

a.滅菌土+接種西瓜枯萎病菌；

b.滅菌土+接種西瓜枯萎病菌+生物質(zhì)炭基微生物菌劑輔料（無菌，具體為實施例1中制備生物質(zhì)炭基微生物菌劑的輔料，即不含生防菌成分，其他成分含量同實施例1獲得的生物質(zhì)炭基微生物菌劑，添加量為滅菌土質(zhì)量的0.5%）；

c.滅菌土+西瓜枯萎病菌+0.5%的生物質(zhì)炭基微生物菌劑（實施例1中制備的生物質(zhì)炭基微生物菌劑，添加量為滅菌土質(zhì)量的0.5%）；

d.滅菌土+西瓜枯萎病菌+2%生物質(zhì)炭基微生物菌劑（為實施例1中制備的生物質(zhì)炭基微生物菌劑，添加量為滅菌土質(zhì)量的2%）。

供試西瓜品種為蘇創(chuàng)1號。

試驗具體步驟如下：

(1)將西瓜種子表面消毒后，無菌水浸泡過夜，30℃恒溫2d催芽。露白后播種于穴盤，待小苗長至2片真葉時，移栽至內(nèi)徑10cm，高15cm，內(nèi)裝滅菌土壤的塑料杯中。

(2)四個處理組均添加土壤為300g滅菌土，c與d處理組滅菌土中分別加入（占滅菌土質(zhì)量百分比）0.5%和2%的實施例1步驟三獲得的生物質(zhì)炭基微生物菌劑。

(3)西瓜幼苗（2片真葉期）移栽的同時，在處理組a、b、c與d處理組中根灌20ml1×10⁷cfu/ml西瓜枯萎病菌孢子懸浮液，接種西瓜枯萎病菌。

(4)接種病害真菌后，調(diào)查植物發(fā)病情況，待只接病原真菌組（a處理）60%的小苗出現(xiàn)發(fā)病癥狀后，結(jié)束試驗，統(tǒng)計西瓜苗生長情況、病情指數(shù)及發(fā)病率。

(5)西瓜苗期枯萎病的防治效果實驗結(jié)果如表1和圖5所示：

表1生物質(zhì)炭基微生物菌劑對西瓜苗期枯萎病的防治效果

由表1可見和圖5（圖5中a-d分別對應(yīng)上述處理a-d）可見，接入實施例獲得菌劑組（c、d處理））接種西瓜植株后能夠有效防止西瓜枯萎病的發(fā)生，與a處理相比發(fā)病率顯著下降70-85%左右，最高防效達74.6%。

(6)西瓜苗期生長影響結(jié)果如表2所示：

表2生物質(zhì)炭基微生物菌劑對西瓜苗期生長的影響

注：a:接病菌；b:接病菌+菌劑輔料；c：接病菌+0.5%菌劑；d：接病菌+2%菌劑。表中小寫字母代表0.05水平差異顯著性

試驗結(jié)果表明，該菌劑能夠顯著抑制西瓜枯萎病菌對西瓜苗期生長的傷害，并能夠促進西瓜苗期的生長，在土壤中加入2%該固體菌肥后，顯著促進西瓜苗期株高、根長增長約75-90左右，促進鮮重及干重等生物量的增長55%左右。