本發(fā)明屬于熒光探針的，具體涉及一種等離子增強(qiáng)熒光的熒光探針的制備方法及其在β-淀粉樣蛋白檢測中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、阿爾茨海默病(alzheimer’s?disease，ad)是一種不可逆的神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為認(rèn)知、癡呆和記憶喪失。阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制的病理形態(tài)學(xué)標(biāo)志被認(rèn)為是aβ肽aβ1-40(aβ40)和aβ1-42(aβ42)逐漸積累形成淀粉樣斑塊，和神經(jīng)元中的神經(jīng)原纖維纏結(jié)含有過度磷酸化的tau蛋白。阿爾茨海默病的最終確診是基于死后對腦組織中神經(jīng)原纖維纏結(jié)和淀粉樣斑塊的組織病理學(xué)檢測。因此，需要一種較靈敏的方法來早期檢測β-淀粉樣蛋白的錯誤折疊和聚集，特別是在患者病情發(fā)展為阿爾茨海默病之前，將這個過程可視化以評估疾病的狀態(tài)。

2、目前，淀粉樣蛋白的成像技術(shù)包括正電子發(fā)射斷層掃描、磁共振成像、單光子發(fā)射計算機(jī)斷層掃描以及熒光染料(如硫黃素s、硫黃素t、剛果紅)的熒光成像。然而高昂的成本和危險的電離輻射限制了掃描成像的應(yīng)用。此外，由于聚集物與周圍組織之間的特異性差異很小，磁共振成像敏感性較低。在背景和聚集相關(guān)信號下，形成具有高對比度和高靈敏度的成像，關(guān)鍵在于熒光探針可以特異性增強(qiáng)淀粉樣斑塊的信號。常規(guī)熒光染料對β-淀粉樣蛋白的成像，往往具有較低的穩(wěn)定性和較低的熒光產(chǎn)率，這限制了它們在體內(nèi)進(jìn)一步靶向β-淀粉樣蛋白。因此，設(shè)計一種用于檢測β-淀粉樣蛋白的等離子熒光增強(qiáng)探針以實現(xiàn)更靈敏和快速的檢測是非常必要的。而目前將基于bodipy的探針與等離子熒光增強(qiáng)結(jié)合用于檢測β-淀粉樣蛋白的報道很少。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種等離子增強(qiáng)熒光的熒光探針的制備方法，本發(fā)明制備的熒光探針首次通過等離子增強(qiáng)熒光技術(shù)提高bodipy熒光探針的發(fā)光強(qiáng)度，并且具有良好的時間、ph穩(wěn)定性和生物相容性，可以作為特異性β-淀粉樣蛋白濃度指示劑，并且其制備過程簡單，可以有效解決現(xiàn)有β-淀粉樣蛋白檢測操作復(fù)雜，或儀器昂貴或檢測受環(huán)境干擾較大的缺點(diǎn)。

2、本發(fā)明還提供所制備的熒光探針以及其在β-淀粉樣蛋白定量檢測和活細(xì)胞熒光成像中的應(yīng)用。

3、技術(shù)方案：為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所述一種等離子增強(qiáng)熒光的熒光探針的制備方法，包括如下步驟：

4、(1)將4-羧基苯甲醛、2，4-二甲基吡咯、三氟乙酸、四氯苯醌、三乙胺、醚合三氟化硼混合反應(yīng)后制得熒光探針bodipy；

5、(2)將檸檬酸鈉加入氯金酸溶液中反應(yīng)制成金納米顆粒(au?nps)溶液；

6、(3)將有機(jī)溶劑、氨水和正硅酸乙酯在金納米顆粒溶液中反應(yīng)得到二氧化硅包裹的金納米顆粒溶液；

7、(4)將(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷和二氧化硅包裹的金納米顆粒溶液反應(yīng)得到氨基修飾的包硅金納米顆粒溶液；

8、(5)將bodipy熒光探針、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、n-羥基琥珀酰亞胺和氨基修飾的包硅金納米顆粒溶液反應(yīng)制得等離子增強(qiáng)熒光探針au?nps@sio2-bodipy。

9、其中，步驟(1)中將4-羧基苯甲醛溶解在二氯甲烷中，隨后加入2，4-二甲基吡咯并滴加三氟乙酸至混合溶液中，在室溫下攪拌10-14h，接著加入四氯苯醌反應(yīng)4-6h，然后加入三乙胺反應(yīng)20-40min，最后加入醚合三氟化硼，室溫攪拌過夜，產(chǎn)物經(jīng)層析硅膠柱純化得到熒光探針bodipy的固體粉末。

10、作為優(yōu)選，步驟(1)中將4-羧基苯甲醛溶解在二氯甲烷中，隨后加入2，4-二甲基吡咯并滴加三氟乙酸至混合溶液中，在室溫下攪拌12h，接著加入四氯苯醌反應(yīng)5h，然后加入三乙胺反應(yīng)30min，最后加入醚合三氟化硼，室溫攪拌過夜，產(chǎn)物經(jīng)層析硅膠柱純化得到熒光探針bodipy的固體粉末。

11、其中，步驟(1)中4-羧基苯甲醛、2，4-二甲基吡咯、四氯苯醌的摩爾比是1-2：2-4：1-2；二氯甲烷、三乙胺、醚合三氟化硼的體積比是3-12：1：1；三氟乙酸的滴加量為1-4滴。

12、作為優(yōu)選，步驟(1)中4-羧基苯甲醛、2，4-二甲基吡咯、四氯苯醌的摩爾比是1：2：1；二氯甲烷、三乙胺、醚合三氟化硼的體積比是10：1：1；三氟乙酸的滴加量為3-4滴。

13、其中，步驟(2)中將氯金酸水溶液加熱至沸騰后，加入檸檬酸鈉溶液進(jìn)行反應(yīng)，等待溶液變成酒紅色后繼續(xù)沸騰3-7min，溶液冷卻后得到金納米顆粒溶液。

14、作為優(yōu)選，步驟(2)中將氯金酸水溶液加熱至沸騰后，加入檸檬酸鈉溶液進(jìn)行反應(yīng)，等待溶液變成酒紅色后繼續(xù)沸騰5min，溶液冷卻后得到金納米顆粒溶液。

15、其中，步驟(2)中氯金酸和檸檬酸鈉的質(zhì)量比例為1：1-10。

16、作為優(yōu)選，步驟(2)中氯金酸和檸檬酸鈉的質(zhì)量比例為1：1。

17、其中，步驟(3)中將無水乙醇和氨水加入金納米顆粒溶液中，隨后加入正硅酸乙酯溶液繼續(xù)在室溫下反應(yīng)6-24h，得到二氧化硅包裹的金納米顆粒溶液。

18、作為優(yōu)選，步驟(3)中將無水乙醇和氨水加入金納米顆粒溶液中，隨后加入正硅酸乙酯溶液繼續(xù)反應(yīng)12h，得到二氧化硅包裹的金納米顆粒溶液。

19、其中，步驟(3)中金納米顆粒溶液、無水乙醇、氨水、正硅酸乙酯的體積比為100：100-300：3-10：4-12。

20、作為優(yōu)選，步驟(3)中金納米顆粒溶液、無水乙醇、氨水、正硅酸乙酯的體積比為100：200：7：6。

21、其中，步驟(4)中將(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷和包硅后的金納米顆粒溶液在30-40℃下反應(yīng)3-7h，然后在40-60℃下反應(yīng)1-2h，得到氨基修飾的包硅金納米顆粒溶液。

22、作為優(yōu)選，步驟(4)中將(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷和包硅后的金納米顆粒溶液在37℃下反應(yīng)5h，然后在50℃下反應(yīng)1h，得到氨基修飾的包硅金納米顆粒溶液。

23、其中，步驟(4)中(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷、包硅后的金納米顆粒溶液的體積比為1-3：10。

24、作為優(yōu)選，步驟(4)中(3-氨基丙基)三甲氧基硅烷、包硅后的金納米顆粒溶液的體積比為1：10。

25、其中，步驟(5)中將bodipy溶液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽在室溫下混合攪拌5-15min，然后向混合溶液中加入n-羥基琥珀酰亞胺并在室溫下攪拌10-30min，最后加入氨基修飾的包硅金納米顆粒溶液在室溫下攪拌3-5h，得到等離子增強(qiáng)熒光探針au?nps@sio2-bodipy。

26、作為優(yōu)選，步驟(5)中將bodipy溶液和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽混合攪拌10min，然后向混合溶液中加入n-羥基琥珀酰亞胺并攪拌20min，最后加入氨基修飾的包硅金納米顆粒溶液攪拌4h，得到等離子增強(qiáng)熒光探針au?nps@sio2-bodipy。

27、其中，步驟(5)中bodipy溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、n-羥基琥珀酰亞胺、氨基修飾的包硅金納米顆粒溶液的摩爾量比為0.2-1：300-900：300-900：1。

28、作為優(yōu)選，步驟(5)中bodipy溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、n-羥基琥珀酰亞胺、氨基修飾的包硅金納米顆粒溶液的摩爾量比為0.33：600：600：1。

29、本發(fā)明所述的制備方法所制備的等離子增強(qiáng)熒光的熒光探針。

30、本發(fā)明所述的制備方法所制備的熒光探針在β-淀粉樣蛋白定量檢測中的應(yīng)用。

31、本發(fā)明所述的制備方法所制備的熒光探針在活細(xì)胞中定量檢測β-淀粉樣蛋白的應(yīng)用。

32、作為優(yōu)選，本發(fā)明制備的等離子增強(qiáng)熒光的熒光探針可用于β-淀粉樣蛋白定量檢測和ct26、pan02細(xì)胞熒光成像中的應(yīng)用。

33、本發(fā)明所述的熒光探針在制備β-淀粉樣蛋白定量檢測和細(xì)胞熒光成像的試劑或者工具中的應(yīng)用。

34、本發(fā)明首次將等離子增強(qiáng)熒光技術(shù)與熒光探針bodipy結(jié)合并應(yīng)用于β-淀粉樣蛋白的檢測。等離子增強(qiáng)熒光(plasmon-enhanced?fluorescence，pef)是將熒光發(fā)射器與金屬納米結(jié)構(gòu)附近的局部表面等離子體共振(localized?surface?plasmon?resonance，lspr)相結(jié)合，利用新的光子驅(qū)動工藝顯著改善光信號的一種現(xiàn)象。熒光信號的放大使得光穩(wěn)定性較低的弱熒光團(tuán)有進(jìn)一步應(yīng)用的可能。基于pef，人們設(shè)計了多種熒光探針來提高信噪比，如檢測低豐度的mirna-21、白細(xì)胞介素-6，可獲得高靈敏度的熒光探針。這種熒光增強(qiáng)可以通過調(diào)整lspr波段與發(fā)射/激發(fā)波長之間的形狀、大小、間距和光譜重疊等因素來實現(xiàn)。

35、本發(fā)明制備了一種基于等離子增強(qiáng)熒光的蛋白質(zhì)聚集體熒光檢測系統(tǒng)。au?nps和bodipy分別作為等離子體增強(qiáng)納米粒子和熒光基團(tuán)。au?nps和bodipy之間的距離由二氧化硅外殼控制，以獲得最佳的硅殼厚度和密度。bodipy熒光基團(tuán)與au?nps@sio2-nh2共價結(jié)合，實現(xiàn)熒光增強(qiáng)。通過控制和優(yōu)化au?nps與正硅酸乙酯、bodipy與au?nps、edc與nhs的比例獲得了最大的熒光增強(qiáng)，增強(qiáng)倍數(shù)為13倍。

36、本發(fā)明制備的等離子熒光增強(qiáng)熒光探針用于β-淀粉樣蛋白的定量檢測和活細(xì)胞熒光成像。常規(guī)熒光染料對β-淀粉樣蛋白的成像，往往具有較低的穩(wěn)定性和較低的熒光產(chǎn)率，這限制了它們在體內(nèi)進(jìn)一步靶向β-淀粉樣蛋白。bodipy熒光探針對β-淀粉樣蛋白具有較高的生物結(jié)合度，能夠在β-淀粉樣蛋白的β折疊片內(nèi)進(jìn)行靶向結(jié)合，提高了生物檢測的特異性。而本探針利用au?nps將bodipy的熒光強(qiáng)度大幅度提升，且能通過血腦屏障，解決了常規(guī)熒光染料的背景熒光干擾高、組織穿透性差、生物相容性差等缺點(diǎn)。

37、本發(fā)明成功合成了一種基于等離子體增強(qiáng)熒光的氟硼二吡咯(bodipy)修飾探針，用于檢測β-淀粉樣蛋白聚集體。金納米粒顆粒和bodipy分別作為等離子體和熒光物質(zhì)。同時，au?nps與bodipy之間的距離由二氧化硅層控制。與原始的bodipy相比，bodipy修飾的等離子熒光增強(qiáng)熒光探針au?nps@sio2-bodipy熒光信號增強(qiáng)了13倍。3d-fdtd結(jié)果表明，信號放大是由于電場強(qiáng)度(3.78v/m)增加所致。aβ42的線性范圍和檢出限分別為5～60μm和0.85μm。將該探針用于小鼠結(jié)直腸癌細(xì)胞(ct26)和小鼠胰腺癌細(xì)胞(pan02)中aβ聚集體的選擇性和敏感性識別，也顯示出比原bodipy更高的熒光信號。該方法在神經(jīng)退行性疾病的預(yù)測和檢測中具有廣闊的應(yīng)用前景。

38、本發(fā)明首次將等離子增強(qiáng)熒光技術(shù)與熒光探針bodipy結(jié)合并應(yīng)用于β-淀粉樣蛋白的檢測，通過優(yōu)化了殼層厚度控制距離獲得最大的熒光增強(qiáng)，增強(qiáng)倍數(shù)為13倍，在檢測aβ42時效果顯著。

39、有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：

40、1、本發(fā)明制備的等離子熒光增強(qiáng)熒光探針的制備方法簡單快速，對儀器和技術(shù)的要求基礎(chǔ)，易于規(guī)?；a(chǎn)。

41、2、本發(fā)明制備的等離子熒光增強(qiáng)熒光探針基于等離子熒光增強(qiáng)作用，通過二氧化硅層控制bodipy和等離子激元之間的距離，實現(xiàn)染料的最大熒光增強(qiáng)，提高了熒光探針的穩(wěn)定性。

42、3、本發(fā)明制備的等離子熒光增強(qiáng)熒光探針利用熒光探針bodipy對β-淀粉樣蛋白開啟響應(yīng)熒光，對生物體內(nèi)其他蛋白類似物(乙酰膽堿酯酶、na+、酪氨酸、d-脯氨酸、l-谷氨酸、d-葡萄糖、d-蘇氨酸、l-色氨酸、半胱氨酸)均無明顯響應(yīng)效果，特異性強(qiáng)，檢測效果準(zhǔn)確度高。

43、4、本發(fā)明制備的等離子熒光增強(qiáng)熒光探針能夠準(zhǔn)確檢測β-淀粉樣蛋白的折疊聚集狀態(tài)和濃度并隨之產(chǎn)生熒光信號的變化，其熒光強(qiáng)度在5-60μm之間有線性響應(yīng)，檢出限為0.85μm。

44、5、本發(fā)明制備的等離子熒光增強(qiáng)熒光探針在0-10μm之間具有高細(xì)胞活性，說明生物相容性較好，能夠?qū)崿F(xiàn)活細(xì)胞中對β-淀粉樣蛋白的熒光成像，對預(yù)防和提前診斷阿爾茲海默癥的產(chǎn)生具有重要的意義。