本發(fā)明涉及發(fā)光檢測，具體涉及一種發(fā)光信號(hào)探針及其發(fā)光調(diào)節(jié)介質(zhì)、免疫層析試紙條及其制備方法、試劑盒和免疫層析檢測方法。

背景技術(shù)：

1、免疫層析技術(shù)(lateral?flow?immunoassay,lfia)已廣泛應(yīng)用于各種快速檢測場合，它利用了抗原-抗體結(jié)合的原理，可以在不需要復(fù)雜設(shè)備的情況下對各種生物標(biāo)志物進(jìn)行定性或半定量的分析。lfia技術(shù)因其操作簡便、成本低廉且不需借助復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備，而被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療檢測、食品安全檢測和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。

2、免疫層析試紙條通常由多個(gè)部分組成，包括樣品施加區(qū)、結(jié)合劑預(yù)涂區(qū)、測試線區(qū)(t線區(qū))和對照線區(qū)(或質(zhì)控線區(qū)，c線區(qū))。樣品中的分析物與預(yù)涂在試紙條上的抗體結(jié)合后，在層析作用的推動(dòng)下遷移到t線區(qū)，與那里固定的抗體結(jié)合，形成可見線條。未結(jié)合的分析物繼續(xù)遷移至c線區(qū)與對照抗體結(jié)合，形成第二個(gè)可見線條，證明該試驗(yàn)有效。這種結(jié)合作用通常依靠金屬納米顆粒(如金或銀)、熒光微?；蛉玖衔⒘５葮?biāo)記物的視覺識(shí)別來實(shí)現(xiàn)。

3、盡管lfia具有上述優(yōu)勢，但在實(shí)際應(yīng)用中，尤其是面對需要同時(shí)檢測多個(gè)目標(biāo)分析物的場合，其遇到了一些挑戰(zhàn)。在現(xiàn)有的發(fā)光檢測技術(shù)中，通常利用單一波長的激發(fā)光源來激發(fā)標(biāo)記物，然后記錄發(fā)射光。這種單波長激發(fā)發(fā)射(single?wavelength?excitationemission,swee)方法在同時(shí)檢測具有不同激發(fā)和發(fā)射波長的多個(gè)標(biāo)記物時(shí)存在效率問題。為了檢測多種分析物，每個(gè)都需要單獨(dú)的激發(fā)和發(fā)射過程，這不僅時(shí)間消耗大，而且成本也相應(yīng)增加。同時(shí)，每種分析物都需要獨(dú)立的激發(fā)源和檢測通道，這會(huì)使得設(shè)備變得更加復(fù)雜和昂貴，從而限制了其在資源有限的環(huán)境中的應(yīng)用。

4、由于檢測過程中對多個(gè)標(biāo)記物的依賴，多重檢測還帶來了信號(hào)干擾的問題。不同標(biāo)記物發(fā)射的光譜可能會(huì)接近或重疊，這使得現(xiàn)有的swee方法難以區(qū)分不同的信號(hào)。這種情況下，信號(hào)的交叉反應(yīng)可能導(dǎo)致誤判，降低結(jié)果的準(zhǔn)確度和可靠性。在對檢測靈敏度和特異性要求極高的應(yīng)用(例如臨床診斷)中，這種局限性尤為嚴(yán)重。此外，操作的便捷性是快速診斷技術(shù)的一大優(yōu)勢。然而，為了適應(yīng)多重檢測的需求，傳統(tǒng)的發(fā)光檢測技術(shù)必須進(jìn)行多次檢測或使用多個(gè)激發(fā)源，這不僅增加了操作的復(fù)雜度，也延長了整體檢測時(shí)間，并提高了操作人員的技術(shù)要求。在需要快速響應(yīng)的情況下，這種方法的局限性尤為顯著，比如在疫情爆發(fā)時(shí)對多種病原體進(jìn)行快速篩查。

5、因此，為了克服這些限制并提高lfia技術(shù)在多重檢測方面的能力，迫切需要一種創(chuàng)新的解決方案。這樣的解決方案應(yīng)該能夠提高檢測的靈敏度和特異性，減少信號(hào)干擾，并簡化操作流程，使其更加用戶友好，并且降低成本。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、為解決現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題，本技術(shù)提供了一種發(fā)光信號(hào)探針及其發(fā)光調(diào)節(jié)介質(zhì)、免疫層析試紙條及其制備方法、試劑盒和免疫層析檢測方法，可以同時(shí)對濃度相差較大的至少兩種疾病標(biāo)志物進(jìn)行快檢。

2、本技術(shù)的第一方面提供一種發(fā)光信號(hào)探針，該發(fā)光信號(hào)探針包括至少兩種金屬氧化物納米顆粒，當(dāng)所述至少兩種金屬氧化物納米顆粒與同一發(fā)光調(diào)節(jié)介質(zhì)混合時(shí)，分別形成不同的發(fā)光配合物；且當(dāng)采用同一激發(fā)光照射時(shí)，不同的所述發(fā)光配合物發(fā)出不同波長范圍、不同壽命的光。由于本技術(shù)的發(fā)光信號(hào)探針具有上述的單波長激發(fā)、多波長多壽命發(fā)射的發(fā)光特性，因此，當(dāng)上述的至少兩種金屬氧化物納米顆粒分別作為至少兩種疾病標(biāo)志物的信號(hào)標(biāo)簽時(shí)，可以實(shí)現(xiàn)對這些疾病標(biāo)志物的同時(shí)檢測，尤為適用于濃度差異較大的疾病標(biāo)志物的同時(shí)檢測。

3、在一些實(shí)施例中，其中的一種金屬氧化物納米顆粒為eu2o3納米顆粒，其中的另一種金屬氧化物納米顆粒為zno納米顆粒。當(dāng)所述eu2o3納米顆粒和所述發(fā)光調(diào)節(jié)介質(zhì)混合時(shí)形成銪配合物，所述zno納米顆粒和所述發(fā)光調(diào)節(jié)介質(zhì)混合時(shí)形成鋅配合物，所述銪配合物和所述鋅配合物可以在同一激發(fā)光照射下，發(fā)出不同波長范圍和不同壽命的光。

4、在一些優(yōu)選實(shí)施例中，所述激發(fā)光采用365nm紫外光。在所述365nm紫外光的照射下，由所述eu2o3納米顆粒形成的發(fā)光配合物可以激發(fā)出中心波長為613nm且壽命在微秒級的紅光，而由所述zno納米顆粒形成的發(fā)光配合物可以激發(fā)出中心波長為520nm且壽命在納秒級的綠光。雖然所述紅光和所述綠光的發(fā)光光譜存在重疊，但是二者的發(fā)光壽命差異較大，使得這兩種光信號(hào)可以被分別提取，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對不同疾病標(biāo)志物的同時(shí)檢測。

5、在一些實(shí)施例中，所述發(fā)光信號(hào)探針包括至少兩種發(fā)光微球，其中的一種發(fā)光微球包括第一載體介質(zhì)，且所述第一載體介質(zhì)上負(fù)載有其中的一種金屬氧化物納米顆粒，其中的另一種發(fā)光微球包括第二載體介質(zhì)，且所述第二載體介質(zhì)上負(fù)載有另一種金屬氧化物納米顆粒。

6、在一些實(shí)施例中，所述第一載體介質(zhì)和所述第二載體介質(zhì)均為介孔二氧化硅。

7、在一些實(shí)施例中，所述發(fā)光微球的表面還具有羧基官能團(tuán)，以便與抗體進(jìn)行偶聯(lián)。

8、在一些實(shí)施例中，所述發(fā)光信號(hào)探針還包括和所述至少兩種發(fā)光微球?qū)?yīng)偶聯(lián)的至少兩種抗體，其中的一種抗體為第一抗體且對應(yīng)的抗原為第一抗原，其中的另一種抗體為第二抗體且對應(yīng)的抗原為第二抗原；所述第一抗原在待測樣本中的濃度小于所述第二抗原在所述待測樣本中的濃度，且所述第一抗原的檢測線性范圍窄于所述第二抗原的檢測線性范圍。例如，所述第一抗原為降鈣素原(pct)，所述第一抗體為降鈣素原抗體，所述第二抗原為c反應(yīng)蛋白(crp)，所述第二抗體為c反應(yīng)蛋白抗體。所述降鈣素原是高靈敏的感染因子，在血液中的濃度非常低，其cut-off值為0.25ng/ml，因此對檢測技術(shù)的靈敏度提出了很高要求。而血液中c反應(yīng)蛋白的濃度則高很多，cut-off值為10μg/ml，比降鈣素原的cut-off值高出近4個(gè)數(shù)量級，而且c反應(yīng)蛋白的檢測線性范圍非常寬，臨床上c反應(yīng)蛋白高值樣本可大于1000μg/ml。如果將兩者進(jìn)行聯(lián)合檢測，其線性范圍則跨度接近7個(gè)數(shù)量級。因此，對于免疫層析分析技術(shù)而言，在同一個(gè)試紙條上對降鈣素原和c反應(yīng)蛋白進(jìn)行聯(lián)檢是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)，而本技術(shù)通過對發(fā)光信號(hào)探針進(jìn)行設(shè)計(jì)，可以有效地實(shí)現(xiàn)對二者的同時(shí)聯(lián)檢。

9、在一些實(shí)施例中，所述發(fā)光信號(hào)探針的制備方法包括：提供至少兩種發(fā)光微球，其中的一種發(fā)光微球包括第一載體介質(zhì)，且所述第一載體介質(zhì)上負(fù)載有其中的一種金屬氧化物納米顆粒，其中的第二種發(fā)光微球包括第二載體介質(zhì)，且所述第二載體介質(zhì)上負(fù)載有另一種金屬氧化物納米顆粒；將至少兩種抗體分別對應(yīng)偶聯(lián)至所述至少兩種發(fā)光微球上。優(yōu)選地，通過1-乙基-3[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽(edc)和/或n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)等交聯(lián)劑實(shí)現(xiàn)發(fā)光微球與對應(yīng)抗體之間的共價(jià)偶聯(lián)。其中所述發(fā)光微球可通過任何一種現(xiàn)有方法進(jìn)行制備。

10、本技術(shù)的第二方面提供一種上述的發(fā)光信號(hào)探針用的發(fā)光調(diào)節(jié)介質(zhì)，所述發(fā)光調(diào)節(jié)介質(zhì)包括至少兩種發(fā)光配體、表面活性劑和緩沖溶液，其中所述至少兩種發(fā)光配體用于和至少兩種金屬氧化物納米顆粒形成至少兩種發(fā)光配合物。

11、在一些優(yōu)選實(shí)施例中，其中的一種發(fā)光配體包括β-萘酰三氟丙酮(β-nta)和拓?fù)洚悩?gòu)酶(topo)，其中的另一種發(fā)光配體包括8-羥基喹啉(8-hq)。所述β-nta、所述topo和所述eu2o3納米顆?？梢孕纬砂l(fā)光配合物eu(β-nta)3(topo)2，所述8-hq和所述zno納米顆?？梢孕纬砂l(fā)光配合物znq2。所述發(fā)光配合物eu(β-nta)3(topo)2和所述發(fā)光配合物znq2可以在同一波長的紫外光照射下，分別激發(fā)出不同中心波長和不同壽命的兩種光。

12、在一些優(yōu)選實(shí)施例中，所述發(fā)光調(diào)節(jié)介質(zhì)還滿足以下條件中的至少一條：

13、(1)所述表面活性劑包括兩性表面活性劑和/或非離子型表面活性劑；優(yōu)選地，所述非離子型表面活性劑包括triton?x-100(曲拉通x-100)和/或tween?20(聚山梨酯-20)，所述兩性表面活性劑包括bs12(十二烷基二甲基甜菜堿)和/或cab35(椰油酰胺丙基甜菜堿)；最為優(yōu)選地，所述表面活性劑為cab35；

14、(2)所述表面活性劑的質(zhì)量百分濃度為0.05％～0.5％，當(dāng)所述表面活性劑的質(zhì)量百分濃度在該范圍時(shí)，可以使不同發(fā)光配合物的發(fā)光強(qiáng)度均較高；最為優(yōu)選地，所述表面活性劑的質(zhì)量百分濃度為0.2％；

15、(3)所述緩沖溶液為甘氨酸-鹽酸緩沖液，所述甘氨酸-鹽酸緩沖體系對eu2o3納米顆粒和zno納米顆粒具有配位解離的特性；

16、(4)所述發(fā)光調(diào)節(jié)介質(zhì)的ph值為4～8，ph值會(huì)對eu納米材料的配位解離動(dòng)力學(xué)過程產(chǎn)生復(fù)雜的影響，包括熒光強(qiáng)度及反應(yīng)速率，偏堿性的環(huán)境有利于zn配合物的發(fā)光增強(qiáng)，而弱酸性則有利于eu配合物的發(fā)光增強(qiáng)，考慮到zn配合物具有較寬的峰帶，更容易進(jìn)行信號(hào)提取，而eu配合物的信號(hào)將用于樣本中目標(biāo)分析物含量少的高靈敏檢測項(xiàng)目，由此在ph值的選擇上將優(yōu)先考慮有利于eu配合物發(fā)光的條件；最為優(yōu)選地，所述發(fā)光調(diào)節(jié)介質(zhì)的ph值為5；

17、(5)所述β-萘酰三氟丙酮、所述拓?fù)洚悩?gòu)酶和eu的摩爾比為(1.2～4.5):(0.8～3):1，zn和所述8-羥基喹啉的摩爾比為1:(0.8～3)；當(dāng)發(fā)光配體的摩爾比在該范圍時(shí)，發(fā)光配合物均具有較高的發(fā)光強(qiáng)度。最為優(yōu)選地，所述β-萘酰三氟丙酮、所述拓?fù)洚悩?gòu)酶和eu的摩爾比為3:2:1，zn和所述8-羥基喹啉的摩爾比為1:2。

18、本技術(shù)的第三方面提供一種免疫層析試紙條，包括上述任一項(xiàng)所述的發(fā)光信號(hào)探針。

19、在一些實(shí)施例中，所述免疫層析試紙條包括依次設(shè)置的樣品墊、結(jié)合墊、測試線和質(zhì)控線，其中所述結(jié)合墊上設(shè)置有所述發(fā)光信號(hào)探針，所述測試線固定有至少兩種抗體。

20、在一些優(yōu)選實(shí)施例中，其中的一種抗體為降鈣素原抗體，其中的另一種抗體為c反應(yīng)蛋白抗體，所述質(zhì)控線固定有羊抗雞igy。

21、在一些優(yōu)選實(shí)施例中，所述免疫層析試紙條還包括檢測墊，其中所述測試線和所述質(zhì)控線設(shè)于所述檢測墊上。

22、在一些優(yōu)選實(shí)施例中，所述免疫層析試紙條還包括吸水墊，所述吸水墊位于所述檢測墊遠(yuǎn)離所述結(jié)合墊的一側(cè)。

23、本技術(shù)的第四方面提供上述的免疫層析試紙條的制備方法，包括：將樣品墊、結(jié)合墊以及設(shè)置有測試線和質(zhì)控線的檢測墊粘貼于底板上。

24、在一些優(yōu)選實(shí)施例中，其中所述結(jié)合墊的制備方法包括：采用上述任一項(xiàng)所述的發(fā)光信號(hào)探針的稀釋液涂布所述結(jié)合墊的表面并進(jìn)行干燥；進(jìn)一步優(yōu)選地，在所述稀釋液中，其中的一種發(fā)光微球的濃度為50μg/ml～150μg/ml，其中的另一種發(fā)光微球的濃度為40μg/ml～100μg/ml。當(dāng)發(fā)光微球的濃度在該范圍時(shí)，具有較強(qiáng)的檢測信號(hào)(熒光信號(hào))，進(jìn)而具有較高的檢測靈敏度。

25、在一些實(shí)施例中，所述檢測墊的制備方法包括：在nc膜上，將至少兩種抗體以線條形式包被在同一測試線或不同測試線上，并將羊抗雞igy以線條形式包被在質(zhì)控線上。

26、本技術(shù)的第五方面提供一種試劑盒，包括上述任一項(xiàng)所述的發(fā)光信號(hào)探針，或者上述任一項(xiàng)所述的免疫層析試紙條或者上述任一項(xiàng)所述的免疫層析試紙條的制備方法制備的免疫層析試紙條，和上述任一項(xiàng)所述的發(fā)光調(diào)節(jié)介質(zhì)。

27、本技術(shù)的第六方面提供一種免疫層析檢測方法，包括：提供上述任一項(xiàng)所述的發(fā)光信號(hào)探針，或者上述任一項(xiàng)所述的免疫層析試紙條，或者根據(jù)上述任一項(xiàng)所述的免疫層析試紙條的制備方法制備的免疫層析試紙條，或者上述的試劑盒；先使發(fā)光信號(hào)探針與待測樣本接觸，再采用上述任一項(xiàng)所述的發(fā)光調(diào)節(jié)介質(zhì)對所述發(fā)光信號(hào)探針進(jìn)行處理；采用激發(fā)光照射處理后的所述發(fā)光信號(hào)探針，并讀取所述發(fā)光信號(hào)探針發(fā)出的光信號(hào)。

28、在一些優(yōu)選實(shí)施例中，所述發(fā)光信號(hào)探針與所述待測樣本接觸的時(shí)間為6min～15min。若帶有抗原的待測樣本與所述發(fā)光信號(hào)探針接觸時(shí)，會(huì)產(chǎn)生抗原和抗體的免疫反應(yīng)，待抗原抗體充分反應(yīng)結(jié)合后再對其進(jìn)行檢測，除獲得的檢測結(jié)果更加穩(wěn)定、準(zhǔn)確外，由于信噪比的提高使得靈敏度也進(jìn)一步提升。因此，合適的免疫反應(yīng)時(shí)間有利于在寬線性范圍內(nèi)擁有較高的靈敏性。

29、在一些優(yōu)選實(shí)施例中，采用所述發(fā)光調(diào)節(jié)介質(zhì)對所述發(fā)光信號(hào)探針進(jìn)行處理的時(shí)間為2min～5min。

30、在一些優(yōu)選實(shí)施例中，所述激發(fā)光為365nm紫外光，所述發(fā)光信號(hào)探針發(fā)出兩種中心波長分別為613nm和520nm且壽命分別在微秒級和納秒級的不同光信號(hào)。

31、在一些優(yōu)選實(shí)施例中，所述讀取所述發(fā)光信號(hào)探針發(fā)出的光信號(hào)的方法包括：通過時(shí)間門控?zé)晒饧夹g(shù)于一時(shí)刻采集其中一種光信號(hào)，并依次延時(shí)采集其他光信號(hào)。例如，在零時(shí)采集520nm處的znq2的綠色熒光，并延時(shí)采集613nm處eu(β-nta)3(topo)2的紅色余輝光，實(shí)現(xiàn)了對不同炎癥標(biāo)志物crp(局部炎癥反應(yīng)蛋白標(biāo)志物)和pct(全身性爆發(fā)感染炎癥標(biāo)志物)的聯(lián)合檢測。

32、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本技術(shù)的技術(shù)方案具有如下有益效果：

33、本技術(shù)的發(fā)光信號(hào)探針具有單波長激發(fā)、多波長發(fā)射及多壽命發(fā)光的特性，因此可以在發(fā)射波長和發(fā)光壽命兩個(gè)維度進(jìn)行多個(gè)探針標(biāo)記，有效地拓展了免疫層析檢測的通量，實(shí)現(xiàn)對多種疾病標(biāo)志物的同時(shí)檢測，特別是針對濃度差異較大的疾病標(biāo)志物的同時(shí)檢測。基于發(fā)光壽命緯度的拓展，在單一通道下兼顧了寬線性范圍和高靈敏度的性能，實(shí)現(xiàn)了同時(shí)檢測樣本濃度含量差異較大的不同項(xiàng)目，為即時(shí)檢測(poct)多重聯(lián)合檢測的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。進(jìn)一步地，采用eu2o3納米顆粒和zno納米顆粒作為增強(qiáng)型發(fā)光探針的聯(lián)合標(biāo)記使用，既可以檢測血樣中濃度非常低的pct抗原，也可以檢測血樣中濃度非常高的crp抗原，實(shí)現(xiàn)了高靈敏和寬線性的兼容。

34、與目前的酸性介質(zhì)促進(jìn)金屬配合物發(fā)光增強(qiáng)的原理不同，本技術(shù)在研究過程中得到發(fā)光增強(qiáng)現(xiàn)象與金屬離子的配位過程息息相關(guān)，因此提出了配位增強(qiáng)發(fā)光的新機(jī)制，本技術(shù)的發(fā)光調(diào)節(jié)介質(zhì)采用了弱酸性至中性乃至弱堿性(ph值在4～8)的甘氨酸-鹽酸緩沖液體系，顛覆了現(xiàn)有技術(shù)必須使用強(qiáng)酸性介質(zhì)(ph值在2～3)的方式，從而為檢測完成后的廢液處理帶來諸多便捷，如無需中和處理廢液，無乙酸等揮發(fā)性液體更容易保持。

35、本技術(shù)的免疫層析試紙條可以實(shí)現(xiàn)單卡單檢測線同時(shí)檢測多個(gè)濃度相差非常大的疾病標(biāo)志物，從而實(shí)現(xiàn)單卡免疫層析試紙條的高通量檢測，解決了經(jīng)典免疫層析試紙條的視窗長度有限(約18mm)而無法布置多個(gè)免疫反應(yīng)區(qū)(即多條t線)，導(dǎo)致單卡免疫層析試紙條的檢測通量十分有限的問題。

36、本技術(shù)的免疫層析檢測方法在配位增強(qiáng)發(fā)光新機(jī)制的基礎(chǔ)上，發(fā)展出“配位增強(qiáng)發(fā)光免疫層析方法”(coordination-enhanced?fluorescence-based?lateral?flowimmunoassay，celfia)和“配位增強(qiáng)時(shí)間分辨發(fā)光免疫層析方法”(coordination-enhancedtime-resolved?fluorescence-based?lateral?flow?immunoassay，tr-celfia)，通過時(shí)間門控?zé)晒饧夹g(shù)和光譜拆分技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)多個(gè)疾病標(biāo)志物的同時(shí)檢測，還可以滿足寬線性范圍和高靈敏度兼容的需求，進(jìn)而使得免疫層析即時(shí)檢測可以滿足更多的應(yīng)用場景。