本發(fā)明涉及一種2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇的制備并用于治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染，屬于納米醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、傳統(tǒng)的篩選微生物代謝物或化合物文庫的方法在30多年里沒有產(chǎn)生新的藥物。因此，迫切需要尋找新的方法來應(yīng)對日益嚴重的微生物耐藥。納米技術(shù)的進步已經(jīng)顯示出對抗耐藥菌株的巨大潛力，納米材料的大小與生物分子和細菌細胞內(nèi)結(jié)構(gòu)相當(dāng)，可以設(shè)計成新的治療方式。目前，用于抗菌應(yīng)用的納米材料包括銀納米顆粒，磁性納米顆粒，金屬氧化物(例如cuo,zno或tio2)納米顆粒，和碳基納米材料。然而，有些材料需在底物、超聲波或光刺激的輔助下才顯示出良好的抗菌活性。此外，上述大多數(shù)納米材料由于抗菌活性較低，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用非常有限。

2、當(dāng)納米粒子的尺寸減小到接近一納米或亞納米時，超小納米團簇開始具有有趣的物理和化學(xué)性質(zhì)，如抗菌活性。值得一提的是，金納米團簇由于其優(yōu)異的化學(xué)穩(wěn)定性和高生物相容性而得到了廣泛的研究。然而，表面配體的性質(zhì)會極大地影響金納米團簇的抗菌效果。有方法將金納米團簇用陽離子配體修飾，以增強它們與具有負電位的細菌的相互作用。然而，陽離子抗菌劑在體內(nèi)存在較為嚴重的溶血現(xiàn)象。還有方法通過表面結(jié)構(gòu)中的氧空位設(shè)計金納米團簇，它可以捕獲大量的電子與吸收的o2相互作用，并促進活性氧的產(chǎn)生，從而殺死細菌。然而，活性氧在區(qū)分正常菌群和致病菌方面缺乏內(nèi)在的選擇性，這也使它們失去了作為理想抗菌劑的必要選擇性?？偟膩碚f，不同的表面功能化使金納米團簇具有不同的抗菌特性。本發(fā)明中，我們通過一步法制備了2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米簇，該金簇對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌具有較強的殺菌性能，它最初附著在細菌膜表面，隨后通過下調(diào)細菌膜上的na+/h+反轉(zhuǎn)運蛋白，引起膜電位失衡和呼吸鏈過程抑制，最終導(dǎo)致細菌細胞死亡。與萬古霉素相比，這種獨特的作用使金納米團簇在mrsa感染大鼠表皮模型中具有非凡的抗菌功效?？傊?，本發(fā)明所制備的金納米團簇闡明了抗菌機制的新見解，并為新型抗菌藥物的開發(fā)提供有效的策略。

3、本發(fā)明構(gòu)建了一種2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇的制備并用于治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的新方法。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的是提供一種利用2-巰基-1,3,4-噻二唑作為修飾配體制備2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇，建立一種用于治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的新方法。

2、為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的，一種2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇，其特征是：由下述方法制備而成：將濃度為10mg/ml氯金酸溶液加入到濃度為65mmol/l的2-巰基-1,3,4-噻二唑的naoh溶液(0.3mmol/l)中，混勻后置于暗處孵育60分鐘。待反應(yīng)結(jié)束后用分子量為3500的透析袋對反應(yīng)液透析純化處理，即得到直徑為1.8nm的2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇。

4、上述所得到的2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇，能夠吸附在耐甲氧西林金黃色葡萄球菌表面，下調(diào)細胞膜上的na+/h+轉(zhuǎn)運體，從而影響細胞膜電位，并降低細菌atpase合成酶的活性以及atp的生成，最終產(chǎn)生殺菌效果。

5、上述所得到的2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇具有良好且穩(wěn)定的殺滅耐甲氧西林金黃色葡萄球菌作用、對人表皮細胞的毒性弱，且血液相容性好。

6、上述所得到的2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇水溶液為淺黃色，紫外-可見光譜在280nm處出現(xiàn)2-巰基-1,3,4-噻二唑的特征吸收峰，在紫外燈照射下產(chǎn)生黃色熒光，最大激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為330nm和537nm，量子產(chǎn)率為2.88％，熒光壽命為8.3ns。

7、上述所得到的2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇具有良好的媲美萬古霉素的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌活性、對哺乳動物細胞毒性低、抗菌活性持久和具有良好的血液相容性。

8、本發(fā)明上述的2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇在制備治療皮膚傷口感染藥物中的應(yīng)用。

9、本發(fā)明所述的一種2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇用于治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的新方法。

10、所述的應(yīng)用，其特征是：在體內(nèi)實驗的大鼠皮膚傷口感染模型中，2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇顯示出顯著的促進傷口愈合療效，顯示特征是局部炎癥的減少，血管的生成，膠原纖維的沉積，下調(diào)炎癥因子并在治療期間未觀察到顯著的副作用。在體內(nèi)實驗的大鼠傷口感染模型中，2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇具有顯著的媲美萬古霉素的促進傷口愈合療效，顯示特征是傷口愈合時間縮短、炎癥細胞及相關(guān)炎癥因子的減少，抑制炎癥細胞和抗炎因子的增加，血管生長及血管生成因子增多，膠原纖維合成增多，并在治療期間未觀察到顯著的副作用。

11、具體地說，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

12、(一)2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇材料的制備

13、以下過程中使用的所有玻璃器皿均經(jīng)過王水浸泡，并用雙蒸水徹底清洗，晾干。2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇材料的制備過程如下：將濃度為10mg/ml氯金酸溶液加入到濃度為65mmol/l的2-巰基-1,3,4-噻二唑的naoh溶液(0.3mmol/l)中，混勻后置于暗處孵育60分鐘。待反應(yīng)結(jié)束后用分子量為3500的透析袋對反應(yīng)液透析純化處理，即得到直徑為1.8nm的2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇。

14、(二)2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇體外抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌活性

15、2.1?2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生長的影響

16、在體系中引入2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇(0,0.5,1,2μg/ml)，與0.5麥?zhǔn)隙鹊哪图籽跷髁纸瘘S色葡萄球菌濁液(1.5×108cfu/ml)，在35℃共同培養(yǎng)0-20h，利用酶標(biāo)儀器測定od?600吸光度值。

17、在體系中引入2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇(0,8,10,12μg)和萬古霉素藥敏紙片(30μg)，然后貼在涂有甲氧西林金黃色葡萄球菌濁液(1.5×108cfu/ml)平板上，在35℃培養(yǎng)20h，利用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈。

18、2.2?2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌細胞壁和細胞膜的影響

19、在體系中引入2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇(2和8μg/ml)，與0.5麥?zhǔn)隙鹊哪图籽跷髁纸瘘S色葡萄球菌濁液(1.5×108cfu/ml)，與pbs空白組(20mmol/l，ph＝7.4)，在35℃共同培養(yǎng)20h，利用透射電鏡和掃描電鏡對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌進行測定，觀察耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的形態(tài)變化；同時將培養(yǎng)液于10000rpm離心2min后，棄上清，用1ml雙蒸水復(fù)溶，加入hoechst33342(10μg/ml)和碘化丙啶(0.3mg/ml)染色劑，觀察耐甲氧西林金黃色葡萄球菌細胞膜變化。

20、2.3?2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌na+/h+轉(zhuǎn)運體的影響

21、在體系中引入2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇(2和8μg/ml)，與0.5麥?zhǔn)隙鹊哪图籽跷髁纸瘘S色葡萄球菌濁液(1.5×108cfu/ml)，與pbs空白組(20mmol/l，ph＝7.4)，在35℃共同培養(yǎng)20h，一份采用蛋白提取試劑盒提取細菌的蛋白樣本，利用質(zhì)譜檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌na+/h+轉(zhuǎn)運體的變化；一份采用rna提取試劑盒提取細菌的rna樣本，利用rt-pcr檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌na+/h+轉(zhuǎn)運體基因的變化。

22、2.4?2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌zeta電位的影響

23、在體系中引入2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇(2和8μg/ml)，與0.5麥?zhǔn)隙鹊哪图籽跷髁纸瘘S色葡萄球菌濁液(1.5×108cfu/ml)，與pbs空白組(20mmol/l，ph＝7.4)，在35℃共同培養(yǎng)20h，利用zeta電位測量儀檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的zeta電位變化。

24、2.5?2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌atp及atp合成酶的影響

25、在體系中引入2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇(2和8μg/ml)，與0.5麥?zhǔn)隙鹊哪图籽跷髁纸瘘S色葡萄球菌濁液(1.5×108cfu/ml)，與pbs空白組(20mmol/l，ph＝7.4)，在35℃共同培養(yǎng)20h，一份采用atp提取試劑盒提取細菌的atp樣本，利用酶標(biāo)儀檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌atp的變化；一份采用atp合成酶提取試劑盒提取細菌的atp合成酶樣本，利用酶標(biāo)儀檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌atp合成酶的變化。

26、2.6?2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌葡萄球菌黃素的影響

27、在體系中引入2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇(2和8μg/ml)，與0.5麥?zhǔn)隙鹊哪图籽跷髁纸瘘S色葡萄球菌濁液(1.5×108cfu/ml)，與pbs空白組(20mmol/l，ph＝7.4)，在35℃共同培養(yǎng)20h，利用酶標(biāo)儀檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌葡萄球菌黃素的吸光度值變化。

28、(三)2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇的毒性

29、3.1?2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇對哺乳動物細胞的毒性檢測

30、(1)收集處于對數(shù)生長期的人表皮細胞hacat，消化細胞并制成懸液，稀釋至5000個細胞/孔，于96孔板中每孔中加入100μl的細胞懸液，另設(shè)調(diào)零孔，每組6個復(fù)孔，記錄接種時間。加入引入2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇(1,2,4,8,10,20μg/ml)和pbs空白組(20mmol/l，ph＝7.4)，置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后加入20μl?cck8試劑，于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1h，用酶標(biāo)儀測定波長在450nm處的吸光值并記錄各孔od，計算生存率。

31、(2)收集處于對數(shù)生長期的人表皮細胞hacat，消化細胞并制成懸液，稀釋至5000個細胞/孔，于96孔板中每孔中加入100μl的細胞懸液，另設(shè)調(diào)零孔，每組6個復(fù)孔，記錄接種時間。加入引入2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇(2,8μg/ml)和pbs空白組(20mmol/l，ph＝7.4)，置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，然后加入200μl鬼筆環(huán)肽(alexa?fluor?568)，5％co2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2h，最后加入10μl?dapi工作液，用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞形態(tài)。

32、(3)收集1ml小鼠血液于edta-穩(wěn)定的抗凝管，以1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘后，用pbs洗滌三次至去除釋放的血紅蛋白。去除上清后，將紅細胞重懸(2％w/w)，置于1.5ml離心管中，加入2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇(2,4,8,16,20μg/ml)。以pbs、雙蒸水和1％?triton為對照。在37℃下孵育2h后，在1000rpm下離心10min后，取100μl上清液加入96孔板，于多功能酶標(biāo)儀上測定540nm的吸光度值(od)。

33、(四)2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇治療耐甲氧西林金黃色葡萄球菌引起的感染

34、4.1耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染的大鼠傷口模型

35、4.4.1大鼠傷口建模

36、(1)實驗動物選擇：健康大鼠，雄性，體重200-250g，于動物屏障中心飼養(yǎng)。隨機分為3組：空白組、2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇低劑量組、2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇低高量組，萬古霉素組。

37、(2)麻醉藥品準(zhǔn)備：2wt％戊巴比妥鈉；

38、(3)術(shù)前準(zhǔn)備：麻醉后背部剃毛脫毛，消毒，鋪巾；

39、(4)手術(shù)方法：用手術(shù)剪作長約1.5cm的背部切口，分離皮膚組織，形成一個圓形傷口；

40、(5)皮膚感染模型建立：往傷口處加入200μl耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(1.5×105cfu/ml)；

41、(6)藥物治療：于傷口處滴加低劑量和高劑量2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇，使用萬古霉素(16μg/ml)和pbs作為陽性和陰性對照組。

42、4.4.2感染傷口愈合面積

43、①標(biāo)本采集：于12天后，使用戊巴比妥鈉處死實驗大鼠，剃去背部毛發(fā)，剪開愈合皮膚及周邊0.5cm，用生理鹽水洗凈，放入4％福爾馬林固定12h，蠟塊包埋，按照5μm厚度切片行蘇木精&伊紅染色(he)染色、masson染色、免疫組化。

44、②愈合傷口對比：手術(shù)當(dāng)天及不同給藥觀察點，測量記錄大鼠治療前后的體重、傷口大小及愈合面積。傷口大小由測量尺計算確定。傷口大小的計算方法如下：[d12傷口面積)/d0傷口面積]×100％。

45、③重要臟器組織毒性觀察：于12天后，使用戊巴比妥鈉安樂死處死實驗大鼠，觀察低劑量和高劑量2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇，對心、肝、脾、肺、腎等重要臟器組織的安全性。

46、本發(fā)明的優(yōu)點：

47、(1)本發(fā)明以2-巰基-1,3,4-噻二唑為模板原位合成金納米團簇材料。制備方法綠色環(huán)保，操作簡便快捷，重現(xiàn)性好。

48、(2)本發(fā)明所制備的2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇顯示黃色熒光(最大發(fā)射波長為537nm)，量子產(chǎn)率2.88％，熒光壽命8.3ns，及較大的斯托克斯位移(207nm)等特點。

49、(3)體外實驗表明其顯示優(yōu)異的媲美萬古霉素的抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌活性、對哺乳動物細胞毒性低、抗菌活性持久，血液相容性好。

50、(4)體內(nèi)實驗進一步驗證了2-巰基-1,3,4-噻二唑-金納米團簇可有效促進動物模型傷口愈合、修復(fù)，表現(xiàn)出顯著的促進傷口增殖、抗炎和促進血管再生的療效。