專利名稱：新化合物及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種新的化合物及其用途。更詳細(xì)地是指在臨床檢查領(lǐng)域中為測(cè)定網(wǎng)織紅細(xì)胞及網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟指數(shù)的可作為螢光色素使用的新化合物、含有該化合物的試劑及網(wǎng)織紅細(xì)胞的測(cè)定方法。
網(wǎng)織紅細(xì)胞是在骨髓中從造血干細(xì)胞分化成熟的原紅細(xì)胞系細(xì)胞經(jīng)脫核后從骨髓釋放到血液中后的幼紅細(xì)胞，作為細(xì)胞分化成熟的殘余物，在該網(wǎng)織紅細(xì)胞中殘存有少量的RNA、核糖體或線粒體等細(xì)胞內(nèi)小器官，而這些細(xì)胞內(nèi)小器官在成熟的紅細(xì)胞中是不含有的。
在臨床檢查領(lǐng)域中，對(duì)網(wǎng)織紅細(xì)胞的分類計(jì)數(shù)是掌握患者骨髓中的造血狀態(tài)的非常重要的檢查。例如，正常人的網(wǎng)織紅細(xì)胞占總紅細(xì)胞的0.5-2.0％，而該比例在骨髓造血被抑制的狀態(tài)下減少，在骨髓造血亢進(jìn)的狀態(tài)下增加。具體為，在再生不良性貧血及惡性腫瘤的化學(xué)治療時(shí)網(wǎng)織紅細(xì)胞減少，在發(fā)生溶血性貧血時(shí)增加。
一般在臨床檢查領(lǐng)域中為測(cè)定網(wǎng)織紅細(xì)胞，采用的是通過(guò)將含有新亞甲藍(lán)(NMB)、亮甲苯藍(lán)(BCB)等堿性色素的染色液及血液試樣混合，使網(wǎng)織紅細(xì)胞中含有的上述殘存物質(zhì)呈網(wǎng)狀析出，用顯微鏡觀察每個(gè)細(xì)胞，辨別成熟紅細(xì)胞與網(wǎng)織紅細(xì)胞，再進(jìn)行計(jì)數(shù)的方法(用手法)。
另外，作為Heilmeyer分類已知有根據(jù)網(wǎng)狀析出物的量將網(wǎng)織紅細(xì)胞分類的方法，該方法在掌握骨髓的造血?jiǎng)討B(tài)方面非常有用。
但上述的用手法存在以下問(wèn)題①調(diào)制試樣的操作煩雜、②在辨別細(xì)胞的檢查人員之間有差異、③因?yàn)榧?xì)胞計(jì)測(cè)數(shù)少，所以統(tǒng)計(jì)學(xué)誤差變大。
另外，Heilmeyer分類因?yàn)榉浅╇s，所以盡管能夠獲得有用的診斷信息，但目前幾乎不采用。
為解決上述問(wèn)題，取代上述的堿性色素，提出了用將網(wǎng)織紅細(xì)胞中含有的RNA特異染色的螢光性堿性色素將網(wǎng)織紅細(xì)胞染色，用流體測(cè)量?jī)x(flow sight meter)測(cè)定細(xì)胞的前方散射光強(qiáng)度及螢光強(qiáng)度，主要基于螢光強(qiáng)度的差來(lái)辨別紅細(xì)胞與網(wǎng)織紅細(xì)胞，分類計(jì)數(shù)網(wǎng)織紅細(xì)胞的方法。
在該方法中，經(jīng)常使用能夠?qū)嵸|(zhì)上在30秒鐘以內(nèi)將網(wǎng)織紅細(xì)胞染色的(堿性)槐黃O(auramine)作為堿性色素。另外，使用槐黃O的網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定用的試劑及全自動(dòng)測(cè)定裝置可以分別采用東亞醫(yī)用電子株式會(huì)社的レツトサ-チ(RETSEACH)、R系列(R-1000、R-2000、R-3000)，這些試劑及裝置已有市售。通過(guò)使用這種測(cè)定裝置，從調(diào)制試樣到數(shù)據(jù)輸出的全部工序可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，簡(jiǎn)便而且沒(méi)有由于測(cè)定者的不同而產(chǎn)生的偏差，也可以降低上述統(tǒng)計(jì)學(xué)上的誤差，實(shí)現(xiàn)高精度的測(cè)定。
另外，網(wǎng)織紅細(xì)胞的螢光強(qiáng)度與網(wǎng)織紅細(xì)胞中殘存的RNA量成正比例，即與網(wǎng)織紅細(xì)胞的成熟程度成反比例，可以利用螢光強(qiáng)度算出RMI(Reticulocyte Maturation Index網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟指數(shù))。例如，在

圖10中表示用上述的R系列的測(cè)定裝置測(cè)定網(wǎng)織紅細(xì)胞時(shí)的散射圖(scatter gram)。圖10中，從網(wǎng)織紅細(xì)胞中螢光強(qiáng)度低的即RNA少、成熟程度高的之中分成LFR、MFR、HFR三個(gè)級(jí)分。這樣，通過(guò)測(cè)定RMI可以獲得與Heilmeyer分類類似的診斷信息，特別是最不成熟的網(wǎng)織紅細(xì)胞(HFR)的比例，作為敏銳地顯示骨髓移植后或化學(xué)療法后的骨髓造血機(jī)能恢復(fù)的指標(biāo)非常有用。
上述的流體測(cè)量?jī)x法盡管是非常有用的方法，但還存在以下問(wèn)題，作為為激發(fā)螢光色素的螢光的光源，因?yàn)楸仨氁褂脙r(jià)格非常昂貴的氬激光器，所以裝置的價(jià)格很高，而且裝置變得很大。
另外，作為在流體測(cè)量?jī)x中可以使用的螢光色素，除了槐黃O以外，還有噻唑橙、溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓等，但這些色素為將網(wǎng)織紅細(xì)胞染色必須要有5分鐘以上的染色時(shí)間。特別是噻唑橙，在Lee L.G.et alCytometry；7508-517(1986)中報(bào)告必須要有60分鐘的染色時(shí)間。因此要達(dá)到試樣調(diào)制的自動(dòng)化是非常困難的，結(jié)果不得不依靠人工來(lái)調(diào)制試樣，不但從省力化的觀點(diǎn)考慮存在問(wèn)題，而且由于手工技術(shù)或操作者的不同，測(cè)定數(shù)據(jù)也會(huì)出現(xiàn)偏差。用多臺(tái)裝置測(cè)定同一試樣時(shí)，也產(chǎn)生裝置間的測(cè)定數(shù)據(jù)不一致的問(wèn)題。特別是Davis B.H.等人在AmJ Pathol Vol.102，(4)，468-477中報(bào)告了網(wǎng)織紅細(xì)胞的成熟指數(shù)(RMI)在各裝置間存在較大的偏差。
另一方面，在美國(guó)專利第5360739號(hào)中記載了使用He-Ne激光器作為比較廉價(jià)的光源，使用噁嗪750作為色素，通過(guò)測(cè)定散射光強(qiáng)度與吸光度或螢光強(qiáng)度進(jìn)行網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定的流體測(cè)量?jī)x法。另外，與該方法不同，在WO94/27146號(hào)公報(bào)中記載了將紅細(xì)胞用NMB染色后，將血細(xì)胞溶血，主要利用散射光強(qiáng)度辨別網(wǎng)狀物(レチカラム)析出的網(wǎng)織紅細(xì)胞及紅細(xì)胞的方法。
但這些方法在調(diào)制試樣時(shí)需要很多時(shí)間，特別是WO94/27146號(hào)公報(bào)中試樣調(diào)制要分2步進(jìn)行，非常煩雜，所以不適用于自動(dòng)化裝置，而且并不是特異地檢出網(wǎng)織紅細(xì)胞的RNA，存在易受到細(xì)胞的散射光的影響等各種問(wèn)題。另外，在這些方法中完全沒(méi)有有關(guān)網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟指數(shù)的記載。
另外，在特公昭63-61622號(hào)公報(bào)、美國(guó)專利第4957870號(hào)中記載有與作為賦予網(wǎng)織紅細(xì)胞特征的物質(zhì)RNA特異地結(jié)合，增加螢光強(qiáng)度的色素。但這些公報(bào)中只記載了用先前的氬激光器作為光源的采用流體測(cè)量?jī)x測(cè)定的方法，完全沒(méi)有記載使用紅色領(lǐng)域的波長(zhǎng)的光源作為激發(fā)光源的網(wǎng)織紅細(xì)胞計(jì)數(shù)方法、網(wǎng)織紅細(xì)胞成熟指數(shù)測(cè)定方法及試劑。
另外，在美國(guó)專利第5360739號(hào)中明確記載了，RNA與色素的被結(jié)合常數(shù)、色素的滲透速度等由于色素的不同而不同，不可能預(yù)測(cè)在何種條件下可以測(cè)定網(wǎng)織紅細(xì)胞。
綜上所述，目前還沒(méi)有一種具備可以通過(guò)使用廉價(jià)的小型光源、迅速且準(zhǔn)確地測(cè)定網(wǎng)織紅細(xì)胞及其成熟指數(shù)等全部?jī)?yōu)點(diǎn)的網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定用試劑及其測(cè)定方法。因此本發(fā)明的目的在于提供一種新的化合物及作為其用途的網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定用試劑及其測(cè)定方法，可以實(shí)現(xiàn)網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定技術(shù)的低價(jià)格化，即裝置的低價(jià)格化，可以使用小型紅色半導(dǎo)體激光器作為光源，采用紅色波長(zhǎng)高精度地測(cè)定網(wǎng)織紅細(xì)胞。
本發(fā)明提供以下述通式(I)表示的新化合物，
(式中，R1為氫原子或低級(jí)烷基；R2及R3為氫原子，低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基；R4為氫原子、?；虻图?jí)烷基；R5氫原子、也可以被取代的低級(jí)烷基；Z為硫原子、氧原子或低級(jí)烷基取代的碳原子；n為1或2；X-為陰離子)另外，本發(fā)明還提供由上述通式(I)表示的化合物及、為抑制紅細(xì)胞的非特異染色的多價(jià)陰離子及、緩沖劑組成的網(wǎng)織紅細(xì)胞染色用試劑。
另外，本發(fā)明還提供一種網(wǎng)織紅細(xì)胞的測(cè)定方法，包括以下各工序(i)混合上述網(wǎng)織紅細(xì)胞染色用試劑與血液試樣，調(diào)制測(cè)定用試樣；(ii)將上述測(cè)定用試樣導(dǎo)入具有紅色波長(zhǎng)的光源的流體檢測(cè)儀的流體系中；(iii)在鞘流(シ-スフロ-)中流動(dòng)的血液試樣的細(xì)胞上照射紅色波長(zhǎng)的光；(iv)測(cè)定由細(xì)胞發(fā)出的散射光與螢光；(v)利用散射光強(qiáng)度或散射光強(qiáng)度與螢光強(qiáng)度辨別血小板與紅細(xì)胞系細(xì)胞；(vi)利用螢光強(qiáng)度或螢光強(qiáng)度與散射光強(qiáng)度辨別紅細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞及白細(xì)胞；(vii)對(duì)血小板、紅細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞及白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，算出細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞比率。
本發(fā)明的新化合物是可以將網(wǎng)織紅細(xì)胞染色并可以用紅色波長(zhǎng)的光激發(fā)的化合物，可以作為螢光色素使用。
通式(I)中R1代表的低級(jí)烷基是指碳原子數(shù)1-6的直鏈或支鏈的烷基，例如甲基、乙基、丙基、丁基、異丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、其中優(yōu)選甲基、乙基。
R2及R3中的低級(jí)烷基與上述相同，低級(jí)烷氧基是指碳原子數(shù)1-6的烷氧基，例如甲氧基、乙氧基、丙氧基等，其中優(yōu)選甲氧基、乙氧基。另外，R2及R3更優(yōu)選為氫原子。
R4中的?；鶅?yōu)選由脂肪族羧酸衍生的酰基，例如乙?；?、丙?；龋渲袃?yōu)選乙?；?。另外，低級(jí)烷基與上述相同。
R5中的低級(jí)烷基與上述相同，也可以被取代的低級(jí)烷基是指也可以被1-3個(gè)羥基、鹵素原子(例如氟、氯、溴、碘)等取代的低級(jí)烷基，其中優(yōu)選被1個(gè)羥基取代的甲基、乙基。
Z中的低級(jí)烷基與上述相同，作為Z優(yōu)選硫原子。
X中的陰離子為鹵離子(氟、氯、溴或碘)、鹵化硼離子(BF4-、BCl4-、BBr4-等)、磷化合物離子、鹵氧酸離子、氟代硫酸離子、甲基硫酸離子、在芳香環(huán)上以鹵素或帶有鹵素的烷基作為取代基的四苯基硼化合物離子等。其中優(yōu)選溴離子或BF4-。
通式(I)表示的具體化合物如下所示。
通式(I)的化合物中，n＝1的化合物例如可通過(guò)將通式(II)
表示的化合物與N，N-二取代甲脒反應(yīng)，將其生成物與式(III)
表示的喹啉衍生物反應(yīng)，然后再用硼氟化鈉處理得到。
另外，通式(I)的化合物中，n＝2的化合物可以利用上述反應(yīng)，用丙醛酸二(苯基亞胺)鹽替代N，N-二取代甲脒進(jìn)行反應(yīng)而得到。
上述通式(I)的化合物中，可通過(guò)在其分子內(nèi)導(dǎo)入羥基、羥乙基、乙?；葮O性官能團(tuán)而使化合物的極性增加。結(jié)果對(duì)于極性低的紅細(xì)胞細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層或血紅蛋白的疏水區(qū)域的結(jié)合能力下降，由此可以抑制紅細(xì)胞的非特異染色。
本發(fā)明的試劑中的上述色素的量對(duì)于將網(wǎng)織紅細(xì)胞染色是足夠的，可以通過(guò)色素種類、試劑組合進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。例如為0.1-100mg/L左右，更優(yōu)選0.3-30mg/L。在色素濃度超過(guò)100mg/L時(shí)，雖然由于色素的不同而不同，但一般情況是紅細(xì)胞的非特異螢光增加，難以辨別紅細(xì)胞與網(wǎng)織紅細(xì)胞，故不優(yōu)選。另外，在色素濃度低于0.1mg/L時(shí)，雖然不是不能使用，但容易發(fā)生色素吸附在容器壁上或分解等，色素濃度減少，故不優(yōu)選。
本發(fā)明的網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定用試劑中除含有上述化合物(色素)之外，還含有為抑制紅細(xì)胞的非特異染色的多價(jià)陰離子的鹽類及為維持PH的緩沖劑，并調(diào)節(jié)至生理學(xué)滲透壓(例如150-600mOsm/kg左右)。
本發(fā)明人在研究染色液組成的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，一般使用的染色液中的滲透壓補(bǔ)償劑的主成分為NaCl(特別是Cl-)的情況下，紅細(xì)胞的非特異螢光很強(qiáng)而且網(wǎng)織紅細(xì)胞的特異螢光很弱，結(jié)果紅細(xì)胞與網(wǎng)織紅細(xì)胞的辨別變得很困難。另一方面，還發(fā)現(xiàn)在染色液中的Cl-被多價(jià)陰離子取代的情況下，紅細(xì)胞的非特異染色被顯著抑制，辨別紅細(xì)胞與網(wǎng)織紅細(xì)胞變得容易。因此在本發(fā)明的試劑中含有多價(jià)陰離子的鹽類。作為用于該目的的多價(jià)陰離子特別優(yōu)選檸檬酸及EDTA等多價(jià)羧酸離子、磷酸及硫酸離子、碳酸離子等，多價(jià)陰離子的含量為占試劑中總陰離子成分的50％以上，優(yōu)選70％以上。雖然作用機(jī)理尚不清楚，但在上述范圍內(nèi)具有增加特異螢光的作用。另外，作為多價(jià)陰離子的平衡離子沒(méi)有特別限定，但優(yōu)選堿金屬離子。
為獲得穩(wěn)定的網(wǎng)織紅細(xì)胞染色結(jié)果，本發(fā)明試劑中的緩沖劑是能夠保持PH為一定的物質(zhì)，通常使用的濃度為數(shù)mM-100mM。作為緩沖劑的種類，如果是常用的物質(zhì)則無(wú)特殊限制，例如可以根據(jù)合適的PH適當(dāng)選擇羧酸類、磷酸、古德(good)緩沖劑、?；撬帷⑷掖及返?。合適的PH因色素的不同而不同，但通常為6.0-11.0，更優(yōu)選7.0-10.0，最優(yōu)選8.0-9.5。PH比6.0更低或比11.0更高的情況下，紅細(xì)胞容易溶血，變得不能正確測(cè)定，因此不優(yōu)選。另外，PH過(guò)高的情況下，紅細(xì)胞細(xì)胞膜上的陰離子解離，變得與陽(yáng)離子性的色素容易結(jié)合，因此紅細(xì)胞的非特異螢光增加，有難以辨別紅細(xì)胞和網(wǎng)織紅細(xì)胞的傾向，故不優(yōu)選。另外，上述多價(jià)陰離子在能夠?qū)⒃噭┲械腜H調(diào)整至適當(dāng)范圍的情況下，兼有緩沖劑的作用。
另外，本發(fā)明的試劑為防止紅細(xì)胞的低張溶血，優(yōu)選將滲透壓調(diào)整至生理學(xué)滲透壓。為防止紅細(xì)胞的低張溶血，滲透壓通常為150mOsm/kg以上。如果滲透壓過(guò)高，雖然沒(méi)有特殊的危險(xiǎn)，但通常是調(diào)整至600mOsm/kg左右。為將滲透壓調(diào)至上述范圍，可以含有滲透壓補(bǔ)償劑。作為滲透壓補(bǔ)償劑，例如可使用丙酸等有機(jī)酸的堿金屬鹽、葡萄糖、甘露糖等糖類。另外，如果在試劑中的總陰離子成分中所占的比例小于50％，則也可以使用氯化鈉等堿金屬鹵化物或堿土金屬鹵化物。另外，在上述的多價(jià)陰離子可以將試劑中的滲透壓調(diào)整至適當(dāng)?shù)姆秶那闆r下，則沒(méi)有再含有滲透壓補(bǔ)償劑的必要。
本發(fā)明的試劑中可以進(jìn)一步含有作為染色促進(jìn)劑的陽(yáng)離子性表面活性劑。作為陽(yáng)離子性表面活性劑例如有以下結(jié)構(gòu)的化合物
(式中，R6為碳原子數(shù)8-12的烷基，R7、R8、R9為低級(jí)烷基，X為從鹵素中選擇的至少一種)R6中的碳原子數(shù)為8-12的烷基包括直鏈或支鏈的烷基，例如辛基、癸基，月桂基等。其中優(yōu)選辛基、癸基等。
R7、R8及R9中的低級(jí)烷基例如為碳原子數(shù)1-6的直鏈或支鏈的烷基，其中優(yōu)選甲基、乙基、丙基。作為鹵素原子有氟、氯、溴、碘。
陽(yáng)離子性表面活性劑的具體例有辛基三甲基溴化銨(OTAB)、癸基三甲基溴化銨(DTAB)及月桂基三甲基氯化銨(LTAC)。
作為染色促進(jìn)劑的陽(yáng)離子性表面活性劑的使用量例如為，OTAB3000-20000mg/L、DATB500-3000mg/L、LTAC50-250mg/L，隨著總碳原子數(shù)的增加，使用少量即有效。如果大量使用染色促進(jìn)劑，則因?yàn)榧t細(xì)胞溶血，所以不優(yōu)選。雖然陽(yáng)離子性表面活性劑的作用機(jī)理尚不清楚，但一般認(rèn)為是增加了紅細(xì)胞細(xì)胞膜的色素透過(guò)性。另外，因?yàn)殛?yáng)離子性表面活性劑將紅細(xì)胞球狀化，所以具有收束紅細(xì)胞集團(tuán)的前方散射光強(qiáng)度分布的作用。結(jié)果很容易辨別血小板與紅細(xì)胞系細(xì)胞。另外，沒(méi)有預(yù)料到的是例如可以辨別作為缺鐵性貧血等小紅細(xì)胞癥的治療結(jié)果出現(xiàn)的正球性(mormocytic)紅細(xì)胞與引起疾病的的小紅細(xì)胞。
另外，如圖21及22所示，還可以檢測(cè)出少量出現(xiàn)的橢圓紅細(xì)胞。這樣，通過(guò)收束前方散射光強(qiáng)度分布，在測(cè)定網(wǎng)織紅細(xì)胞的同時(shí)可以檢測(cè)出小紅細(xì)胞或橢圓紅細(xì)胞等形態(tài)異常的紅細(xì)胞。
本發(fā)明的試劑除上述構(gòu)成要素之外，還可以含有例如2-吡啶基硫代-1-氧化鈉、β-苯乙醇等防腐劑。
另外，本發(fā)明的化合物在水溶液中不穩(wěn)定的情況下，可以溶解在乙醇、二甲亞砜、乙二醇等溶劑中保存，使用時(shí)可以與含有其他成分的水溶液混合使用。
使用本發(fā)明的試劑用流體測(cè)量?jī)x測(cè)定網(wǎng)織紅細(xì)胞時(shí)，首先在工序(i)中將上述網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定試劑與血液試樣混合，調(diào)制成測(cè)定用試樣。這里所說(shuō)的血液試樣包括全部含有作為測(cè)定對(duì)象的血液成分的試樣，例如經(jīng)過(guò)抗凝劑處理的末稍血液或骨髓液等。在調(diào)制測(cè)定試樣時(shí)，優(yōu)選將網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定試劑與血液試樣按100∶1-1000∶1的混合比混合后使之反應(yīng)。此時(shí)的反應(yīng)溫度優(yōu)選25-50℃，更優(yōu)選35-45℃。另外，反應(yīng)時(shí)間因試劑中含有的色素的不同而有差異，優(yōu)選10秒-5分鐘，更優(yōu)選20秒-2分鐘，最優(yōu)選20秒-60秒。
然后，在工序(ii)中將上述得到的測(cè)定用試樣導(dǎo)入具有紅色波長(zhǎng)的光源的流體測(cè)量?jī)x的流體系內(nèi)。作為本發(fā)明中可以使用的紅色波長(zhǎng)的光源，如果可以發(fā)出所用的色素的激發(fā)波長(zhǎng)附近的紅色波長(zhǎng)的光例如600-680nm左右的光，則沒(méi)有特殊的限制，例如可以使用He-Ne激光器、紅色區(qū)域的半導(dǎo)體激光器等。這些具有紅色波長(zhǎng)光源的流體測(cè)量?jī)x的光學(xué)部分如圖9所示。在半導(dǎo)體激光器的前方與流體池(flow-cell)之間配置聚光透鏡系統(tǒng)，在流體池的前方與前方散射光用受光透鏡和光電二極管之間配置光線限制器(beam-stopper)。另外，在流體池的側(cè)方依次配置側(cè)方螢光用的受光透鏡、帶通濾波器及光電倍增管。另外，流體部，數(shù)據(jù)處理部等其他的裝置構(gòu)成部可以將公知的結(jié)構(gòu)例如R2000等改良后使用。
在工序(iii)中，用上述的紅色波長(zhǎng)光源在鞘流(シ-スフロ-)中流動(dòng)的細(xì)胞上照射紅色波長(zhǎng)的光，在工序(iv)中測(cè)定由細(xì)胞發(fā)出的散射光及螢光。此時(shí)的散射光即可以是前方散射光也可以是側(cè)方散射光，前方散射光即可以是前方高角散射光(6-20°)也可以是前方低角散射光(1-5°)。此時(shí)散射光成為反映細(xì)胞的大小信息的參數(shù)。另外，作為測(cè)定細(xì)胞大小信息的測(cè)定方法，例如有電阻信號(hào)，也可根據(jù)需要組合測(cè)定該電阻信號(hào)的方法。
在工序(v)中，利用散射光強(qiáng)度或散射光強(qiáng)度與螢光強(qiáng)度辨別血小板與紅細(xì)胞系細(xì)胞；在工序(vi)中，利用螢光強(qiáng)度或螢光強(qiáng)度與散射光強(qiáng)度辨別紅細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞及白細(xì)胞；在工序(vii)中，將各細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，算出細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞比率。
實(shí)施例(實(shí)施例1色素化合物A的制備)
將2，3-二甲基苯并噻唑鎓甲磺酸鹽(2，3-Dimethlyl benzothiazolium methanesulfate)6.0g(1當(dāng)量)與N，N-二苯基甲脒(N，N-Diphenyl for mamidine)12.8g(3當(dāng)量)在120ml醋酸中，于90℃油浴上加熱攪拌1.5小時(shí)。將反應(yīng)液倒入1.8L己烷中，再將紅色油狀物用1.5L己烷懸濁洗滌，除去醋酸。將粗精制物用乙酸乙酯-己烷重結(jié)晶。得到4.0g(48％)。向其中加入1-(2-羥基)乙基溴化對(duì)甲基吡啶3.1g(1當(dāng)量)及吡啶80ml，在90℃的油浴上加熱攪拌1.5小時(shí)。在反應(yīng)液中加入硼氟化鈉1.27g(1.1當(dāng)量)溶于DMF 9ml中得到的溶液，再加熱攪拌15分鐘后，將反應(yīng)液倒入2L乙酸乙酯中，濾取生成的沉淀。得到5.0g(100％)的濃暗紫色粉末。
TLC(硅膠，乙醇-二氯甲烷) Rf＝0.21H-NMR(DMSO-d6)δppm(TMS)3.73(s，3H)，3.82(t，2H)，4.64(t，2H)，5.10(s，1H)，6.45(d，1H)，7.10(d，1H)，7.31(t，1H)，7.50-8.51(m，10H)IR(cm-1)1625，1560，1520，1490，1450，1400，1320，1260，1220，1150，760MASS(FAB positive)m/z＝361HPLC 95.9％(MeOH-35％SDSaq.soln.＝80∶20)吸收極大627nm(甲醇)(實(shí)施例2色素化合物B的制備)
將3-甲基-2-甲基苯并噻唑鎓甲磺酸鹽(3-Methyl-2-methyl benzo thia zolium methanesulfate)6.0g(1當(dāng)量)與N，N-二苯基甲脒(N，N-Diphenyl for mamidine)12.8g(3當(dāng)量)在醋酸中，于90℃油浴上加熱攪拌1.5小時(shí)。將反應(yīng)液倒入己烷中，再將紅色油狀物用1.5L己烷懸濁洗滌，除去醋酸。將粗精制物用乙酸乙酯-己烷重結(jié)晶。收率48％。向其中加入1-(2，3-二羥基)丙基溴化對(duì)甲基吡啶3.1g(1當(dāng)量)及吡啶80ml，在90℃的油浴上加熱攪拌1.5小時(shí)。在反應(yīng)液中加入硼氟化鈉1.27g(1.1當(dāng)量)溶于DMF9ml中得到的溶液，再加熱攪拌15分鐘后，將反應(yīng)液倒入2L乙酸乙酯中，濾取生成的沉淀。得到180mg(31％)的濃暗紫色粉末。
TLC(硅膠，甲醇-二氯甲烷) Rf＝0.151H-NMR(DMSO-d6)δppm(TMS)3.73(s，3H)，3.88(m，2H)，4.80(m，1H)，5.36(d，2H)，6.45(d，1H)，7.10(d，1H)，7.31(t，1H)，7.50～8.51(m，10H)，9.27(s，2H)IR(cm-1)1620，1560，1520，1480，1450，1400，1310，1250，1210，1150，740MASS(FAB positive)m/z＝391吸收極大628nm(甲醇)(實(shí)施例3色素化合物C的制備)
將1-羥乙基溴化對(duì)甲基吡啶5g(1當(dāng)量)與N，N-二苯基甲脒(N，N-Diphenyl for mamidine)4.6g(2當(dāng)量)在100ml醋酸酐中，于90℃油浴上加熱攪拌1.5小時(shí)。濃縮反應(yīng)液，倒入0.5L己烷中，除去醋酸酐。將粗精制物用硅膠柱(甲醇-二氯甲烷)精制。得到8.4g(100％)。向其中加入2，3-二甲基苯并噻唑鎓甲磺酸鹽3.4g(1當(dāng)量)，在90℃的油浴上加熱攪拌1.5小時(shí)。濃縮反應(yīng)液后用乙醚、己烷洗滌，再用硅膠柱(甲醇-二氯甲烷)精制。得到0.5g(17％)的濃喑紫色粉末。TLS(硅膠，甲醇-二氯甲烷) )Rf＝0.41H-NMR(DMSO-d6)δppm(TMS)1.93(s，3H)，3.77(s，3H)，4.45(t，2H)，4.80(t，2H)，6.55(d，1H)，7.10(d，1H)，7.37(t，1H)，7.53～8.47(m，10H)IR(cm-1)1740，1620，1560，1520，1480，1450，1400，1310，1250，1200，1150，1080，740MASS(FAB positive)m/z＝403吸收極大631nm(甲醇)(實(shí)施例4色素化合物D的制備)
將3-甲基-2-甲基苯并噁唑鎓甲磺酸鹽(3-Methy 1-2-methyl benzooazolium methanesulfate)250mg(1當(dāng)量)與丙醛二(苯基亞胺)氯化氫(Malonaldehyde bis(phenylimine)hydro chloride)250mg(1當(dāng)量)在醋酸酐中，于125℃的油浴上加熱攪拌0.5小時(shí)。反應(yīng)液冷卻后，加入乙醚，濾取生成的結(jié)晶(收率45％)。向其中加入1-(2-羥基)乙基溴化對(duì)甲基吡啶150mg(1當(dāng)量)及吡啶5ml，在125℃的油浴上加熱攪拌0.5小時(shí)。將反應(yīng)液濃縮，用二氯甲烷萃取目的產(chǎn)物(收率20％)。得到濃暗紫色粉末。TLC(硅膠，10％甲醇-二氯甲烷)Rf＝0.201H-NMR(DMSO-d6)δppm(TMS)3.73(s，3H)，3.82(t，2H)，4.64(t，2H)，5.10(s，1H)，6.45-7.31(m，5H)，7.50～8.51(m.10H)IR(cm-1)1625，1560，1520，1490，1450，1400，1320，1260，1220，1150，760MASS(FAB positive)m/z＝371吸收光譜693nm(甲醇)(實(shí)施例5)調(diào)制如下組成的網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定用試劑。
化合物A(色素) 3.0mg麥黃酮(緩沖劑) 1.79g檸檬酸三鈉二水和物(多價(jià)陰離子) 29.4g精制水 1L(用NaOH調(diào)整pH為9.0)在2ml試劑中加入經(jīng)過(guò)抗凝劑處理的血液10μl，在40℃下恒溫放置120秒，調(diào)制成測(cè)定用試樣，將該測(cè)定試樣用裝有如圖9所示的光學(xué)部的R2000改造裝置測(cè)定前方低角散射光強(qiáng)度及螢光強(qiáng)度，得到如圖1所示的散射圖。其中網(wǎng)織紅細(xì)胞(RET)在總紅細(xì)胞中所占的比例為2.90％。另外，將該血液用以前的R2000(東亞醫(yī)用電子(株)制)測(cè)定時(shí)，RET％為2.70％。(實(shí)施例6)調(diào)制如下組成的網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定用試劑。
化合物A(色素) 3.0mg麥黃酮(緩沖劑) 1.79g檸檬酸三鈉二水和物(多價(jià)陰離子) 29.4g
LTAC(陽(yáng)離子性表面活性劑，染色促進(jìn)劑)150mg精制水 1L(用NaOH調(diào)整pH為9.0)在2ml試劑中加入經(jīng)過(guò)抗凝劑處理的血液10μl，在40℃下恒溫放置40秒后，按與實(shí)施例5同樣的方法測(cè)定前方低角散射光強(qiáng)度及螢光強(qiáng)度，得到如圖2所示的散射圖。其中網(wǎng)織紅細(xì)胞(RET)在總紅細(xì)胞的比例為2.72％。另外，用以前的R2000(東亞醫(yī)用電子(株)制)測(cè)定時(shí)，RET％為2.70％。
本實(shí)施例與實(shí)施例5相比，可以在短時(shí)間(1/3的時(shí)間)內(nèi)調(diào)制測(cè)定用試樣，而且由于紅細(xì)胞的球狀化可以使前方散射光強(qiáng)度分布收束，紅細(xì)胞與血小板的辨別變得容易。(實(shí)施例7)調(diào)制如下組成的網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定用試劑。
化合物B(色素) 30.0mg牛黃酸(緩沖劑) 1.25g依地酸二鈉(多價(jià)陰離子) 26.9gDTAB(陽(yáng)離子性表面活性劑，染色促進(jìn)劑)1.00g精制水 1L(用NaOH調(diào)整pH為9.0)在2ml試劑中加入經(jīng)過(guò)抗凝劑處理的血液10μl，在40℃下恒溫放置40秒后，用與實(shí)施例5同樣的方法測(cè)定前方低角散射光強(qiáng)度及螢光強(qiáng)度，得到如圖3所示的散射圖。其中網(wǎng)織紅細(xì)胞(RET)占總紅細(xì)胞的比例為2.82％。另外，用以前的的R2000(東亞醫(yī)用電子(株)制)測(cè)定該血液時(shí)，RET％為2.70％。(實(shí)施例8)調(diào)制如下組成的網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定用試劑。
化合物C(色素) 1.0mgTAPS(緩沖劑)2.43g磷酸氫二鈉12水和物(多價(jià)陰離子) 35.8gDTAB(陽(yáng)離子性表面活性劑，染色促進(jìn)劑)1.00g
精制水 1L(用NaOH調(diào)整pH為8.5)在2ml試劑中加入經(jīng)過(guò)抗凝劑處理的血液10μl，在40℃下恒溫放置40秒后，用與實(shí)施例5同樣的方法測(cè)定前方低角散射光強(qiáng)度及螢光強(qiáng)度，得到如圖2所示的散射圖。其中網(wǎng)織紅細(xì)胞(RET)占總紅細(xì)胞的比例為2.50％。另外，用以前的的R2000(東亞醫(yī)用電子(株)制)測(cè)定該血液時(shí)，RET％為2.70％。(實(shí)施例9)調(diào)制如下組成的網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定用試劑。
化合物A(色素) 3.0mg麥黃酮(緩沖劑) 1.79g檸檬酸三鈉二水和物(多價(jià)陰離子) 29.4gDTAB(陽(yáng)離子性表面活性劑，染色促進(jìn)劑)1000mg精制水 1L(用NaOH調(diào)整pH為9.0)在2ml試劑中加入經(jīng)過(guò)抗凝劑處理的血液10μl，在40℃下恒溫放置40秒后，用與實(shí)施例5同樣的方法測(cè)定前方低角散射光強(qiáng)度及螢光強(qiáng)度。另外，將該血液用以前的R-2000(東亞醫(yī)用電子(株)制)測(cè)定。比較測(cè)定結(jié)果。圖5-8分別為RET、LFR、MFR及HFR的相關(guān)圖。根據(jù)圖5-8，可知使用本發(fā)明的試劑及小型紅色半導(dǎo)體激光器測(cè)定的網(wǎng)織紅細(xì)胞的測(cè)定結(jié)果，因?yàn)榭梢缘玫教貏e是成熟紅細(xì)胞與網(wǎng)織紅細(xì)胞之間的足夠的螢光強(qiáng)度之差，所以與使用以前的R-2000進(jìn)行測(cè)定的情況相比，可以獲得良好的相關(guān)關(guān)系。因此可以說(shuō)與以前的裝置的性能相同，可以高精度地檢測(cè)出網(wǎng)織紅細(xì)胞。(實(shí)施例10)根據(jù)實(shí)施例9，測(cè)定經(jīng)抗凝劑處理的正常人血、缺鐵性貧血患者治療中血及出現(xiàn)橢圓紅細(xì)胞的貧血患者的血。
正常人血的測(cè)定例如圖11-14所示。圖11及12為用R-2000的測(cè)定結(jié)果，圖13及14為本實(shí)施例的測(cè)定結(jié)果。圖12及14為前方散射光強(qiáng)度分布圖。
另外，缺鐵性貧血患者的治療中血的測(cè)定例如圖15-18所示。圖15及16為R-2000的測(cè)定結(jié)果，圖17及18為本實(shí)施例的測(cè)定結(jié)果。圖16及18為前方散射光強(qiáng)度分布圖。在圖17及圖18中，特別是圖18中，可以清楚辨別引起疾病的低色素性的小紅細(xì)胞及作為治療結(jié)果出現(xiàn)的正常紅細(xì)胞。圖15及16所示的先前的方法不能清楚地辨別。
出現(xiàn)橢圓紅細(xì)胞的貧血患者血的測(cè)定例如圖19-23所示。圖19及20為R-2000的測(cè)定結(jié)果，圖21及22為本實(shí)施例的測(cè)定結(jié)果。圖20及22為前方散射光強(qiáng)度分布圖。圖23表示利用電阻抗檢測(cè)法(東亞醫(yī)用電子(株)、SE-9000)得到的紅細(xì)胞粒度分布圖。圖21及22特別是圖22可以清楚地辨別橢圓紅細(xì)胞集團(tuán)。圖19及20表示的以前的方法不能清楚辨別。另外，圖23表示的利用以前的電阻抗檢測(cè)法得到的紅細(xì)胞粒度分布不能檢測(cè)到橢圓紅細(xì)胞的出現(xiàn)。
利用本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定技術(shù)的低價(jià)格化即裝置的低價(jià)格化，還可以使用小型紅色半導(dǎo)體激光器作為光源，同時(shí)可以使用紅色波長(zhǎng)高精度地測(cè)定網(wǎng)織紅細(xì)胞。也就是說(shuō)，可以獲得與使用先前的上述R系列裝置中的昂貴的氬激光器(以槐黃O作為色素)同等以上的精度。
另外，本發(fā)明的試劑中含有作為染色促進(jìn)劑的陽(yáng)離子性表面活性劑的情況下，與測(cè)定網(wǎng)織紅細(xì)胞同樣，可以辨別作為缺鐵性貧血等小紅細(xì)胞癥的治療結(jié)果出現(xiàn)的正球性紅細(xì)胞(正常的紅細(xì)胞)與引起疾病的小紅細(xì)胞，還可以檢測(cè)橢圓紅細(xì)胞等形態(tài)異常的紅細(xì)胞。
附圖簡(jiǎn)單說(shuō)明圖1使用含有本發(fā)明的色素化合物A的網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定用試劑，測(cè)定血液試樣的前方散射光強(qiáng)度及螢光強(qiáng)度時(shí)散射圖(scatter gram)。圖2使用含有本發(fā)明的色素化合物A的網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定用試劑，在該試劑中進(jìn)一步含有陽(yáng)離子性表面活性劑，測(cè)定血液試樣的前方散射光強(qiáng)度及螢光強(qiáng)度時(shí)的散射圖。圖3使用含有本發(fā)明色素的網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定用試劑，測(cè)定血液試樣的前方散射光強(qiáng)度及螢光強(qiáng)度時(shí)的散射圖。圖4使用含有本發(fā)明的色素的網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定用試劑，測(cè)定血液試樣的前方散射光強(qiáng)度及螢光強(qiáng)度時(shí)的散射圖。圖5使用含有本發(fā)明的色素的網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定用試劑，利用本發(fā)明方法及先前的使用R2000的方法測(cè)定RET時(shí)的相關(guān)圖。圖6使用含有本發(fā)明的色素的網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定用試劑，利用本發(fā)明方法及先前的使用R2000的方法測(cè)定LFR時(shí)的相關(guān)圖。圖7使用含有本發(fā)明的色素的網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定用試劑，利用本發(fā)明方法及先前的使用R2000的方法測(cè)定MFR時(shí)的相關(guān)圖。圖8使用含有本發(fā)明的色素的網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定用試劑，利用本發(fā)明的方法及先前的使用R2000的方法測(cè)定HFR時(shí)的相關(guān)圖。圖9表示本發(fā)明的測(cè)定方法中使用的具有紅色波長(zhǎng)的光源的流體測(cè)定儀的光學(xué)部分的概略圖。圖10用先前的R系列測(cè)定裝置測(cè)定網(wǎng)織紅細(xì)胞時(shí)的散射圖。圖11通過(guò)使用先前的R2000的方法測(cè)定正常人血的前方散射光強(qiáng)度及螢光強(qiáng)度時(shí)的散射圖。圖12通過(guò)使用先前的R2000的方法測(cè)定正常人血的前方散射光強(qiáng)度分布時(shí)的前方散射光強(qiáng)度分布圖。圖13使用含有本發(fā)明的色素的網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定用試劑，利用本發(fā)明方法測(cè)定正常人血的前方散射光強(qiáng)度及螢光強(qiáng)度時(shí)的散射圖。圖14使用含有本發(fā)明的色素的網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定用試劑，利用本發(fā)明方法測(cè)定正常人血的前方散射光強(qiáng)度分布時(shí)的前方散射光強(qiáng)度分布圖。圖15通過(guò)使用先前的R2000的方法測(cè)定缺鐵性貧血患者治療中的血的前方散射光強(qiáng)度及螢光強(qiáng)度時(shí)的散射圖。圖16通過(guò)使用先前的R2000的方法測(cè)定缺鐵性患者治療中的血的前方散射光強(qiáng)度分布時(shí)的前方散射光強(qiáng)度分布圖。圖17使用含有本發(fā)明的色素的網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定用試劑，利用本發(fā)明方法測(cè)定缺鐵性貧血患者治療中的血的前方散射光強(qiáng)度及螢光強(qiáng)度時(shí)的散射圖。圖18使用含有本發(fā)明的色素的網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定用試劑，利用本發(fā)明方法測(cè)定缺鐵性貧血患者治療中的血的前方散射光強(qiáng)度分布時(shí)的前方散射光強(qiáng)度分布圖。圖19通過(guò)使用先前的R2000的方法測(cè)定出現(xiàn)橢圓紅細(xì)胞的貧血患者的血的前方散射光強(qiáng)度及螢光強(qiáng)度時(shí)的散射圖。圖20通過(guò)使用先前的R2000的方法測(cè)定出現(xiàn)橢圓紅細(xì)胞的貧血患者的血的前方散射光分布時(shí)的前方散射光強(qiáng)度分布圖。圖21使用含有本發(fā)明的色素的網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定用試劑，利用本發(fā)明方法測(cè)定出現(xiàn)橢圓紅細(xì)胞的貧血患者的血的前方散射光強(qiáng)度及螢光強(qiáng)度時(shí)的散射圖。圖22使用含有本發(fā)明的色素的網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定用試劑，利用本發(fā)明方法測(cè)定出現(xiàn)橢圓紅細(xì)胞的貧血患者的血的前方散射光強(qiáng)度分布時(shí)的前方散射光強(qiáng)度分布圖。圖23利用先前的電阻抗檢測(cè)法得到的出現(xiàn)橢圓紅細(xì)胞的貧血患者的血的紅細(xì)胞粒度分布圖。
權(quán)利要求
1.以通式(I)表示的化合物
(式中，R1為氫原子或低級(jí)烷基；R2及R3為氫原子，低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基；R4為氫原子、?；虻图?jí)烷基；R5為氫原子、也可以被取代的低級(jí)烷基；Z為硫原子、氧原子或低級(jí)烷基取代的碳原子；n為1或2；X-為陰離子)
2.權(quán)利要求1中記載的化合物，在通式(I)表示的化合物中，R2及R3為氫原子；R4為氫原子、酰基或低級(jí)烷基；R5為氫原子、也可以被取代的低級(jí)烷基。
3.權(quán)利要求1中記載的化合物，在通式(I)表示的化合物中，R1為甲基；R2及R3為氫原子；R4及R5為氫原子；n＝1；Z為硫原子、R1為甲基；R2及R3為氫原子；R4為氫原子；R5為羥甲基；n＝1；Z為硫原子、R1為甲基；R2及R3為氫原子；R4為COCH3基；R5為氫原子；n＝1；Z為硫原子、或R1為甲基；R2及R3為氫原子；R4及R5為氫原子；n＝2；Z為硫原子。
4.含有以通式(I)表示的化合物的網(wǎng)織紅細(xì)胞染色用試劑，
(式中，R1為氫原子或低級(jí)烷基；R2及R3為氫原子，低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基；R4為氫原子、?；虻图?jí)烷基；R5為氫原子、也可以被取代的低級(jí)烷基；Z為硫原子、氧原子或低級(jí)烷基取代的碳原子；n為1或2；X-為陰離子)
5.權(quán)利要求4中記載的網(wǎng)織紅細(xì)胞染色用試劑，其中進(jìn)一步含有為了抑制紅細(xì)胞非特異染色的多價(jià)陰離子及緩沖劑。
6.權(quán)利要求5中記載的試劑，其中的多價(jià)陰離子是從硫酸離子、磷酸離子、多價(jià)羧酸離子中選擇的至少一種。
7.權(quán)利要求4-6中任一項(xiàng)記載的試劑，試劑的pH為6.0-11.0。
8.權(quán)利要求4-7中任一項(xiàng)記載的試劑，其中含有作為染色促進(jìn)劑的陽(yáng)離子性表面活性劑。
9.權(quán)利要求8中記載的試劑，其中的陽(yáng)離子性表面活性劑為
(式中，R6為碳原子數(shù)8-12的烷基，R7、R8及R9為低級(jí)烷基，X為從鹵素中選擇的至少一種)。
10.權(quán)利要求8中記載的試劑，其中的陽(yáng)離子性表面活性劑是月桂基三甲基氯化銨、癸基三甲基溴化銨、辛基三甲基溴化銨中的至少一種。
11.網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定方法，其特征在于使用含有以通式(I)表示的化合物的試劑，
(式中，R1為氫原子或低級(jí)烷基；R2及R3為氫原子、低級(jí)烷基或低級(jí)烷氧基；R4為氫原子、酰基或低級(jí)烷基；R5為氫原子、也可以被取代的低級(jí)烷基；Z為硫原子、氧原子或低級(jí)烷基取代的碳原子；n為1或2；X-為陰離子)
12.權(quán)利要求11中記載的網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定方法，包括以下各工序(i)混合由通式(I)表示的化合物及、為抑制紅細(xì)胞的非特異染色的多價(jià)陰離子及、緩沖劑組成的網(wǎng)織紅細(xì)胞染色用試劑及血液試樣，調(diào)制成測(cè)定試樣；(ii)將上述測(cè)定用試樣導(dǎo)入具有紅色波長(zhǎng)的光源的流體檢測(cè)儀的流體系中；(iii)在鞘流(シ-スフロ-)中流動(dòng)的血液試樣的細(xì)胞上照射紅色波長(zhǎng)的光；(iv)測(cè)定由細(xì)胞發(fā)出的散射光與螢光；(v)利用散射光強(qiáng)度或散射光強(qiáng)度與螢光強(qiáng)度辨別血小板與紅細(xì)胞系細(xì)胞；(vi)利用螢光強(qiáng)度或螢光強(qiáng)度與散射光強(qiáng)度辨別紅細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞及白細(xì)胞；(vii)對(duì)血小板、紅細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞及白細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，算出細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞比率。
13.權(quán)利要求12中記載的網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定方法，其中紅色波長(zhǎng)的光源為He-Ne激光器或紅色半導(dǎo)體激光器。
14.權(quán)利要求12中記載的網(wǎng)織紅細(xì)胞測(cè)定方法，利用該方法可以求出具有至少一種特定范圍的螢光強(qiáng)度的網(wǎng)織紅細(xì)胞占總網(wǎng)織紅細(xì)胞中的比例。
全文摘要
以通式(I)表示的化合物，(式中，R
文檔編號(hào)C09B23/02GK1154966SQ9612261
公開(kāi)日1997年7月23日 申請(qǐng)日期1996年10月4日 優(yōu)先權(quán)日1995年10月6日
發(fā)明者赤井保正, 坂田孝, 宮崎公德 申請(qǐng)人:東亞醫(yī)用電子株式會(huì)社