一種人羧酸酯酶hCE2的高特異性熒光探針及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及人羧酸酯酶亞型2 (hES2)的特異性熒光探針 及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 羧酸醋酶（Carboxylesterase，CES)是機體內(nèi)重要的I相水解代謝酶，催化多種 內(nèi)源性和外源性化合物發(fā)生酯鍵斷裂，釋放出極性的醇和羧酸分子片段，后者進(jìn)而被體內(nèi) CYP450或UGTs等其他代謝酶繼續(xù)催化代謝，使藥物分子更有效地被排出體外。多種結(jié)構(gòu)中 含有酯鍵的藥物分子，如鹽酸伊立替康（11^11 〇仏(^11，0?1'-11)、奧司他韋（達(dá)菲）、氯吡格雷 等均被羧酸酯酶催化進(jìn)行活化或代謝消除。
[0003] 人體內(nèi)介導(dǎo)藥物代謝的羧酸酯酶主要分布在2個家族：hCEl和hCE2,其中hCEl又 可繼續(xù)被分為hCElb和hCElc兩種亞型。hCEl和hCE2具有不同的組織分布特異性及底物 選擇性，人的肝臟中主要分布表達(dá)hCEl，同時表達(dá)一定量的hCE2,而小腸中則基本以hCE2 亞型為主，只有極少量的hCEl分布。近年來發(fā)現(xiàn)多種腫瘤細(xì)胞中hCE2的表達(dá)水平上調(diào)，可 借助此特征設(shè)計經(jīng)hCE2特異性水解的抗腫瘤前體藥物實現(xiàn)靶向選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞的目 的。此外，多數(shù)口服前藥需先經(jīng)過腸道才能被吸收進(jìn)入血液循環(huán)，因此腸道中hCE2酶對酯 類藥物的代謝被認(rèn)為是其首次代謝的重要組成部分，hCE2酶活性的差異對于前體藥物的生 物利用度具有十分重要的影響。此外，有些經(jīng)靜脈給藥的前體藥物，如鹽酸伊立替康，會經(jīng) 過膽汁排泄被分泌到腸道中，繼而被腸道中的hCE2催化水解釋放出毒性代謝產(chǎn)物SN-38， 后者被認(rèn)為是導(dǎo)致伊立替康遲發(fā)型腹瀉副作用的主要原因。因而，建立基于探針的高通量 技術(shù)手段，對于篩選hCE2的高效抑制劑并將其應(yīng)用于減緩伊立替康導(dǎo)致的遲發(fā)型腹瀉，以 及對hCE2功能的定量檢測都十分重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的在于提供一種人羧酸酯酶hCE2的特異性熒光探針及其應(yīng)用，該底 物原型和水解產(chǎn)物的熒光屬性具有明顯差異，且產(chǎn)物更易檢測。利用該探針反應(yīng)可對多種 生物體系中hCE2的分布和功能進(jìn)行定量評價。
[0005] 本發(fā)明提供了一種人羧酸酯酶亞型2 (hCE2)的特異性熒光探針底物，該底物的酯 鍵在人源組織或細(xì)胞中可被hCE2特異性水解為相應(yīng)水解產(chǎn)物并顯示與底物不同的發(fā)射波 譜；該底物是以4-三氟甲基-7-羥基香豆素類化合物為原料，通過酯化反應(yīng)獲得相應(yīng)7-羥 基酯類衍生物，其結(jié)構(gòu)通式如式（1)所示，其中，R為苯基、對甲基苯基、對乙基苯基、對丙基 苯基、對己基苯基、對硝基苯基、對氯苯基、1-奈基、2-呋喃基、2-噻吩基、（4-苯基）苯基、 4-乙氧基苯基取代基中的一種。
[0006]
【主權(quán)項】
1. 一種人駿酸醋酶hCE2的高特異性巧光探針，其特征在于：該探針的底物的醋鍵可被 hCE2特異性水解為相應(yīng)水解產(chǎn)物并產(chǎn)生產(chǎn)物對應(yīng)的巧光； 該底物為4-S氣甲基-7-哲基香豆素醋類衍生物，其結(jié)構(gòu)通式如式（1)所示，其中， R為苯基、對甲基苯基、對己基苯基、對丙基苯基、對己基苯基、對硝基苯基、對氯苯基、1-奈 基、2-快喃基、2-唾吩基、（4-苯基）苯基、4-己氧基苯基取代基中的一種。
2. -種權(quán)利要求1所述人駿酸醋酶hCE2的高特異性巧光探針的應(yīng)用，其特征在于：該 探針底物作為hCE2的特異性底物，可利用其水解反應(yīng)活性，通過定量檢測單位時間內(nèi)水解 產(chǎn)物的生成量來測定不同酶源中hCE2的活性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述人駿酸醋酶hCE2的高特異性巧光探針的應(yīng)用，其特征在于：所 述酶源為重組表達(dá)的hCE2單酶、人或動物組織制備液或各類組織細(xì)胞生物樣品。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述人駿酸醋酶hCE2的高特異性巧光探針的應(yīng)用，其特征在于：所 述水解反應(yīng)體系抑介于5. 5?10. 5之間；探針底物的濃度介于1/10?lOKm之間；解育體 系反應(yīng)溫度介于20?60°C之間，同時水解產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化率應(yīng)介于0. 1%?20%之間。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述人駿酸醋酶hCE2的高特異性巧光探針的應(yīng)用，其特征在于：該 探針底物不具備巧光而其水解產(chǎn)物具有巧光屬性，可采用巧光檢測器實現(xiàn)產(chǎn)物及底物的快 速靈敏檢測；巧光檢測條件為：激發(fā)波長330?400nm，在420?660nm進(jìn)行巧光發(fā)射譜的 檢測。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述人駿酸醋酶hCE2的高特異性巧光探針的應(yīng)用，其特征在于：該 特異性探針底物及其水解反應(yīng)可用于hCE2抑制劑的快速篩選及抑制能力的定量評價。
【專利摘要】一種人羧酸酯酶hCE2的高特異性熒光探針及其應(yīng)用，該特異性探針底物是4-三氟甲基-7-羥基香豆素類化合物酯類衍生物，可用于檢測不同生物樣品中hCE2的存在與否及其活力的定量測定。酶活性具體測定流程如下：選擇4-三氟甲基-7-羥基香豆素酯類衍生物水解反應(yīng)為探針反應(yīng)，選擇適宜底物濃度在線性反應(yīng)區(qū)間內(nèi)通過定量檢測單位時間內(nèi)水解代謝產(chǎn)物4-三氟甲基-7-羥基香豆素的生成量來測定各生物樣品、細(xì)胞、載體及整體器官中hCE2酶的實際活性。本發(fā)明不僅可用于不同來源生物樣本中hCE2酶活性的定量評估，此外借助該探針反應(yīng)還可用于體外快速篩選hCE2的抑制劑。
【IPC分類】C12Q1-44, C09K11-06, C07D407-12, C12Q1-04, C07D409-12, C07D311-16
【公開號】CN104592985
【申請?zhí)枴緾N201410836704
【發(fā)明人】崔京南, 馮磊
【申請人】大連理工常熟研究院有限公司
【公開日】2015年5月6日
【申請日】2014年12月29日