的熒光分子探針、其合成方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明具體涉及一種檢測超氧陰離子自由基（O2 O的有機熒光分子探針、其合成 方法及其在超氧陰離子自由基的熒光分析中的應(yīng)用，屬于分析檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 活性氧（reactive OXgen species, R0S)是指生物體內(nèi)與氧代謝有關(guān)的含氧自由 基和不以自由基形式存在的具有高活性的中間產(chǎn)物。超氧陰離子自由基（〇2 ·_)是活性最 強的活性氧。O2 ·_會損害多種生物大分子，包括DNA、油脂及蛋白質(zhì)等，從而造成心血管代 謝紊亂、貧血、癌癥以及神經(jīng)性疾病。O2 〃在代謝的過程中還可以產(chǎn)生毒性更強的物質(zhì)，比 如HO ·和1O2。因此，檢測并消除生物體內(nèi)的O2 〃可以預(yù)防多種疾病和細(xì)胞衰老。
[0003] 由于O2 〃在生物體內(nèi)的濃度很低，活性高并且壽命短，因此分析O2 〃的濃度非常 困難。常用的檢測O2 〃的方法包括液相色譜法、光譜法、熒光手段、化學(xué)發(fā)光及電子自旋共 振等，然而這些方法存在一些問題。比如，液相色譜在制樣時非常復(fù)雜，并且檢測時間很長。 電子自旋共振儀器昂貴，化學(xué)發(fā)光法的選擇性差。由于熒光光譜方法具有很高的選擇性和 靈敏度，并可以在活體內(nèi)進行，應(yīng)用這一方法檢測O 2 ·_得到了大家的關(guān)注。Medvedeva及 其合作者設(shè)計了基于芘硝基氧的探針化合物用來監(jiān)測黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶系統(tǒng)產(chǎn)生的 O2 〃，氮氧自由基的分子內(nèi)淬滅效應(yīng)導(dǎo)致該探針的熒光很弱，加入O2 〃導(dǎo)致熒光增強。利用 該探針的穩(wěn)態(tài)熒光測試結(jié)果證明該探針可以檢測納摩爾濃度級的O2 ?、但探針可對HO ·和 一些抗氧化劑響應(yīng)，選擇性較差（"Dual fluorophore-nitronyl probe for investigation of superoxide dynamics and antioxidant status of biological systems"，[J]· J Photochem Photobiol A-Chem，2004, 163(1-2):45-51.)〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的主要目的在于提供一種檢測超氧陰離子自由基（〇2o的熒光分子探針， 其具有快速響應(yīng)、高選擇性及高靈敏度等特點。
[0005] 本發(fā)明的又一重要目的在于提供一種合成所述熒光分子探針的方法。
[0006] 本發(fā)明的再一重要目的在于提供所述熒光分子探針的應(yīng)用，例如，應(yīng)用于對生物 樣品中低含量的超氧陰離子自由基進行檢測。
[0007] 為達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案包括：
[0008] 本發(fā)明的一實施方案之中提供的一種檢測超氧陰離子自由基的熒光分子探針的 分子結(jié)構(gòu)式為：
[0009]
[0010] 式中，R為氨基烷基或C1-C12的直鏈烷基，η為0~2中的任一整數(shù)。
[0011] 進一步的，所述熒光分子探針是以4-氨基-1，8-萘二甲酰亞胺為熒光團，以碳酰 胺化的鄰苯二酚為超氧陰離子識別基團的化合物，其在捕獲超氧陰離子后，鄰苯二酚被特 異性氧化成鄰苯二醌結(jié)構(gòu)，分子內(nèi)光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移過程被抑制，探針熒光顯著增強，從而實 現(xiàn)對超氧陰離子自由基的檢測。
[0012] 進一步的，所述熒光分子探針的激發(fā)光波長約380~400nm，發(fā)射光波長約505~ 513nm〇
[0013] 本發(fā)明的一實施方案之中提供的一種合成所述熒光分子探針的方法包括：
[0014] ⑴將4-氨基-1，8-萘二甲酰亞胺和雙（三氯甲基）碳酸酯溶解在干燥溶劑中，并 加入過量的堿，先在〇°C~室溫混合反應(yīng)，之后在保護性氣氛中回流反應(yīng)6~16h，而后冷卻 至室溫并除去溶劑，獲得含4-異氰酸酯基-1，8-萘二甲酰亞胺的混合物；
[0015] ⑵向所述含4-異氰酸酯基-1，8-萘二甲酰亞胺的混合物中加入溶劑，而后加入 4-氨基烷基鄰苯二酚與堿的混合溶液，并在保護性氣氛中于室溫下攪拌反應(yīng)6~17h，之后 依次對所獲反應(yīng)混合液進行水洗、萃取處理，再調(diào)節(jié)萃取液的PH值至小于或等于5,而后分 離出有機相，過濾、干燥且除去有機相后，經(jīng)硅膠柱層析分離獲得所述熒光分子探針。
[0016] 在一較為優(yōu)選的實施方案之中，4-氨基-1，8-萘二甲酰亞胺與雙（三氯甲基）碳 酸酯的摩爾比為1:1~3,尤其優(yōu)選為1:1. 5~2。
[0017] 在一較為優(yōu)選的實施方案之中，4-氨基-1，8-萘二甲酰亞胺與堿的摩爾比為 1:6~14,尤其優(yōu)選為1:10。
[0018] 在一較為優(yōu)選的實施方案之中，4-氨基-1，8-萘二甲酰亞胺、4-氨基烷基鄰苯二 酚和堿三者的摩爾比為1:2~8:5~15,尤其優(yōu)選為1:4~5:8~10。
[0019] 進一步的，所述干燥溶劑可優(yōu)選自但不限于甲苯、二氯甲烷等。
[0020] 進一步的，所述堿可優(yōu)選自但不限于三乙胺、N-乙基二異丙基胺等。
[0021] 進一步的，所述溶劑可優(yōu)選自但不限于吡啶、N，N-二甲基甲酰胺等。
[0022] 進一步的，所述硅膠柱層析中采用的洗脫劑可優(yōu)選自但不限于二氯甲烷/乙酸乙 酯/甲醇混合液或石油醚/乙酸乙酯混合液。
[0023] 其中，所述二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇混合液中二氯甲烷、乙酸乙酯與甲醇的體積 比優(yōu)選為90:6:1~5,尤其優(yōu)選為90:6:2~3。
[0024] 其中，所述石油醚/乙酸乙酯混合液中石油醚與乙酸乙酯的體積比優(yōu)選為1. 5~ 〇. 1:1，尤其優(yōu)選為0.8~1:1。
[0025] 本發(fā)明的一實施方案之中還提供了一種超氧陰離子自由基的檢測方法，其包括： 將所述熒光分子探針與可能含超氧陰離子自由基的樣品于選定溶劑中均勻混合，通過測定 所述熒光分子探針的熒光強度變化，從而實現(xiàn)對超氧陰離子自由基的檢測。
[0026] 在一更為具體的較佳實施方案之中，所述檢測方法可以包括：
[0027] 將所述熒光分子探針與一系列不同用量的超氧陰離子自由基的標(biāo)準(zhǔn)樣品于選定 溶劑中均勻混合，測定及記錄所述熒光分子探針的相對熒光強度變化，從而探知，在O 2 ·_濃 度為0~3. 33 μM時所述熒光分子探針的相對熒光強度y與O2 〃濃度X的關(guān)系為：y = I. 13+0. 51x，R2= 0. 9976 ;
[0028] 將所述熒光分子探針與待測樣品于液相體系中均勻混合，并測定所述熒光分子探 針的相對熒光強度，再依據(jù)前述方程式而獲得所述待測樣品中超氧陰離子自由基的含量。
[0029] 進一步的，在一些實施例中，前述液相體系優(yōu)選為水相體系，例如可以為二甲基亞 砜（DMSO)與水的混合溶劑，其中DMSO與水的體積比優(yōu)選為1:19。
[0030] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有如下有益效果：
[0031] 1.本發(fā)明的熒光分子探針對于低濃度、活性高及壽命短的超氧陰離子自由基可以 實現(xiàn)快速準(zhǔn)確的響應(yīng)，并且靈敏度（檢測限可低至222nM)和選擇性高，同時可以應(yīng)用于水 相體系，具有良好的應(yīng)用前景；
[0032] 2.本發(fā)明熒光分子探針的合成工藝簡單，反應(yīng)條件溫和，可實現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。
【附圖說明】
[0033] 圖1為本實施例1-2中所獲的一種典型探針1對O2 ·_響應(yīng)的靈敏度測試圖譜；
[0034] 圖2為本實施例1-2中所獲的一種典型探針1對O2 ·_響應(yīng)的選擇性測試圖譜。
【具體實施方式】
[0035] 本發(fā)明合成了一種新型的超氧陰離子自由基熒光分子探針，超氧陰離子對所述探 針分子的特異性氧化作用可使探針熒光顯著增強，據(jù)此，本發(fā)明還建立了一種高靈敏、高選 擇性的檢測超氧陰離子的熒光分析方法。
[0036] 在本發(fā)明的一較為具體的實施方案之中，一種檢測超氧陰離子自由基的熒光分子 探針（如下簡稱"探針1"）的合成路線可如下式所示：
[0038] 進一步的，該合成方法可以包括如下：
[0039] ⑴將4-氨基-1，8-萘二甲酰亞胺（