專利名稱：傷口的愈合的制作方法
技術領域：
本發(fā)明有關愈合傷口。
生長因子是能刺激一定數(shù)目靶細胞的多肽激素。生長因子的例子包括血小板衍生的生長因子(PDGF)、胰島素類生長因子(IGF-I)、β轉(zhuǎn)移生長因子(TGF-β)、α轉(zhuǎn)移生長因子(TGF-α)、皮膚生長因子(EGF)、和成纖維細胞生長因子(FGF)。PDGF是一種在循環(huán)血小板顆粒中可以找到的熱穩(wěn)定的陽離子蛋白質(zhì)，據(jù)知循環(huán)血小板顆粒能刺激體外蛋白質(zhì)合成和通過成纖維細胞的膠原生成。還知道，它對成纖維細胞起體外分裂素和趨化劑的作用，還起平滑的肌肉血胞的作用。
已有人提出使用PDGF來促進體內(nèi)傷口愈合的建議。例如，Grotendorst(1984)J.Trauma24549-52描述了將PDGF加到Hunt-Schilling線網(wǎng)室(該室中浸入了膠原凝膠)，并植入小鼠的背部;結果發(fā)現(xiàn)，PDGF增加了新合成的膠原量。但是，只使用PDGF，或者PDGF與FGF和EGF聯(lián)合使用，Leitzel等人(1985)J.Dermatol.Surg.Oncol.11617-22卻不能加快大田鼠內(nèi)普通傷口的愈合速度。
Michaeli等人(1984)在“SoftandHardTissueRepair”一書中(Hunt，T.K.等編，紐約、Praeger出版人，pp380-394)報告說，敷用從富血小板的血漿獲得的部分純的PDGF制劑刺激了在將其植入兔角膜時的血管生成。因為PDGF不是血管生長因子，因此研究人員建議，在它們的部分純PDGF制劑中可能存在一種未知的因子，該未知因子引起血管生長效應。
Schultz，G.S.等人(1984)在“Science”中報告對豬的部分厚度的皮膚燒傷部位進行局部敷用TGF-α，和未被處理的燒傷部位相比，加速了皮膚的再生過程。
一般來說，本發(fā)明的特點是通過給傷口敷用有效劑量的組合制劑來愈合哺乳動物(例如病人)的外傷，該制劑包括純化的PDGF和純化的TGF-α的組合。TGF-α最好是人的TGF-α，但是也可以是其它哺乳類的TGF-α，例如鼠的。TGF-α可以從天然源分離出來，通過重組體細胞或固相肽合成來制取TGF-α則更好。本發(fā)明的組合制劑通過促進上皮和連接組織的生長以及整個蛋白質(zhì)和膠原的合成來幫助傷口的愈合，至少是部分愈合。使用本發(fā)明的組合制劑進行傷口愈合比不經(jīng)治療(即不敷用外原劑)、或經(jīng)過只使用純化的PDGF的治療或只使用純化的TGF-α的治療得到的傷口愈合效果都更加有效。
在本發(fā)明的最佳實施例中，該組合制劑的制備方法是，在一種藥物學上允許的載體物質(zhì)內(nèi)，例如在市場上可買到的惰性凝膠或液體(如補充了白蛋白或甲基纖維素的鹽水)內(nèi)，將純化的PDGF和TGF-α(兩者皆可在市場上購到)組合在一起。組合純化的PDGF和TGF-α的最佳重量比在1∶4和25∶1之間，在1∶2和10∶1之間較好，并且1∶1或2∶1則更好些。純化的PDGF可以從人類的血小板中獲得，或者通過重組的DNA(脫氧核糖核酸)技術得到。因此，談到術語“PDGF”，我們指的是哺乳動物的血小板衍生物和重組體兩者，指的是靈長類血統(tǒng)較貼切;該靈長類是人類則最貼切，但也可以是黑猩猩或其它的靈長類。重組的PDGF可以是重組的異二聚體，它是通過將對兩個亞單體編碼的DNA序列插入被培養(yǎng)的原核細胞或真核細胞中制得的，然后讓這些細胞去處理這些被轉(zhuǎn)譯的亞單體從而即形成了異二聚體，或者將只對一個亞單體(最好是β或“2”鏈)編碼的DNA插入這些細胞中，然后對其進行培養(yǎng)從而得到異二聚體的PDGF(PDGF-1或PDGF-2異二聚體)。
這里所用的術語“純化的”指的是，PDGF或TGF-α在與其它物質(zhì)混合前按重量計占95%或更高些的PDGF或TGF-α，即這樣的PDGF或TGF-α基本上不含本來就與之相關的糖類、酯或其它蛋白質(zhì)。
對于每一種PDGF和TGF-α組分，一種純化的蛋白質(zhì)制劑一般來說在聚丙烯酰 凝膠中都要產(chǎn)生一個主帶。在本發(fā)明的組合制劑中使用的純化PDGF或TGF-α最好達到通過氨基┒稅被嶁蛄蟹治齜椒ú舛ǖ拇慷取 本發(fā)明的組合制劑對于哺乳動物外傷的愈合提供了一種快速有效的方法，例如對于褥瘡、裂傷和燒傷的治療。和自然愈合(即不使用任何外原劑)或只使用純PDGF或只使用TGF-α相比，該組合制劑加速了連接組織的生成。和只使用純PDGF不同，該組合制劑促進了新的連接組織和上皮組織兩者的顯著增長。其所得到的上皮層比自然愈合或只使用TGF-α生長出來的上皮層厚，并且還包含更多的將上皮層連到新連接組織的上皮突起;這樣，就使上皮層的粘結更加牢固并且使其得到了保護。
本發(fā)明的其它特點和優(yōu)點將從下述對最佳實施例的描述中和權利要求書中變得更加清楚。
我們現(xiàn)在描述本發(fā)明的最佳實施例。
根據(jù)本發(fā)明用PDGF/TGF-α混合物來治療外傷，如褥瘡和燒傷，該混合物是通過組合純PDGF和TGF-α制備出來的。從Peninsula實驗室(Belmont，CA)可以買到化學合成的人和鼠的TGF-α。從人體血小板衍生得到的純化PDGF和純化重組的PDGF可從PDGF公司(Boston，MA)、Collaborative研究中心(Waltham，MA)和Amgen公司(ThousandOaks，CA)買到。純化PDGF也可按下述方法制得。
將500至1000單位的洗過的人體血小板粒懸浮于1MNacl(每個血小板單位2ml)中，并將其在100℃加熱15分鐘。然后通過離心來分離該上清液，并用1MNacl兩次提取沉淀物。
該提取物靠0.08MNacl-0.01M磷酸鈉緩沖液(PH7.4)進行結合和透析，并在4℃和與該緩沖液平衡的CM-SephadexC-50混合一夜。然后將該混合物倒入一個柱(5×100cm)中，用0.08MNacl-0.01M磷酸鈉緩沖液進行大面積的清洗，并且在要收集其中的10ml部分時用1MNacl進行洗提。
有效部分靠0.3MNacl-0.01M磷酸鈉緩沖液(PH7.4)進行匯集和透析，然后進行離心，并在4℃時使其通過與0.3MNacl-0.01M磷酸鈉緩沖液(PH7.4)平衡的2.5×25cm的BlueSepharose(Pharmacia)柱。之后用該緩沖液清洗該柱，并且用1MNacl和乙二烯乙醇的1∶1溶液洗提部分純化的PDGF。
經(jīng)部分地純化了的PDGF部分用1MNacl洗提(1∶1)，并且靠1M醋酸透析，然后進行凍干。凍干后的樣品被溶于0.8MNacl-0.01M磷酸鈉緩沖液(PH7.4)中，然后讓其通過與該緩沖液平衡的1.2×40cm的CM-SephadexC-50柱。然后借助于Nacl的變化梯度(0.08M至1M)對PDGF進行洗提。
該有效部分靠1M醋酸組合、透析，并且予以凍干，然后將其溶解在少量的1M醋酸中。將其中的0.5ml部分加到與1M醋酸平衡的1.2×100cmBiogelP150柱(100至200個網(wǎng)眼)中。在要收集2ml部分時，用1M醋酸洗提PDGF。
每一個包含100至200mg蛋白質(zhì)的有效部分被凍干，并將其溶解在100ml的0.4%三氟醋酸中，并使之在苯基的Bondapak柱(Waters)中經(jīng)受反相的高性能液體層析法處理。用線性的乙腈梯度(0至60%)的洗提即產(chǎn)生了純PDGF。
可按下述方法制備通過重組的DNA技術制得的PDGF從人體血小板得到的血小板衍生增長因子(PDGF)包含兩個多肽序列(PDGF-1和PDGF-2;Antoniades，H.N.和Hunkapiller，M.(1983)Science220963-965)。PDGF-1是由位于染色體7中的基因編碼的(Betsholtz，C.等人，Nature320695-699)，PDGF-2是由位于染色體22(Dalla-Favera，R.(1982)Science218686-688)的病態(tài)致腫瘤基因編碼的(Doolittle，R.等人(1983)Science221275-277)。病態(tài)致腫瘤基因?qū)εcPDGF-2多肽緊密相關的猿肉瘤病毒(SSV)的轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)進行編碼。人類的細胞的C-病態(tài)也對PDGF-2鏈進行編碼(Rao，C.D.等人(1986)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA832392-2396)。由于PDGF的兩個多肽鏈是由位于不同的染色體中的兩個不同基因編碼的，所以存在下述可能性人的PDGF由PDGF-1和PDGF-2的一種由雙硫醚連接的異二聚體組成，或者是兩種單二聚體(PDGF-1單二聚體和PDGF-2單二聚體)的一種混合物，或者是包括異二聚體和兩個單二聚體的一種混合物。
受猿的肉瘤病毒感染的、正在培養(yǎng)中的哺乳動物細胞(含對PDGF-2鏈編碼的基因)顯示出PDGF-2多肽的合成，并且將其處理成雙硫醚連接的單二聚體(Robbims，K.等人(1983)Nature 305605-608)。此外，PDGF-2單二聚體與抗人體PDGF升高的抗血清發(fā)生反應。再有，分泌的PDGF-2單二聚體的功能性在下述方面與血小板衍生的PDGF類似它刺激了被培養(yǎng)的成纖維細胞中的DNA合成，它在185kd細胞膜蛋白質(zhì)的酪氨酸基上導致了磷酸化，并且為了束縛到特殊的細胞表面PDGF受體上能和人體的(125I)-PDGF相競爭(Owen，A.等人(1984)Science 22554-56)。對于從被培養(yǎng)的正常人體細胞(如人體的動脈內(nèi)皮細胞)衍生的病態(tài)/PDGF-2基因產(chǎn)物、或者從表達病態(tài)/PDGF-2基因的人體惡性腫瘤細胞衍生的上述基因產(chǎn)物，也表示出類似的性質(zhì)(Antoniades，H.等人(1985)Cancer Cells 3145-151)。
通過使用表達媒介動物將C-病態(tài)/PDGF-2基因的CDNA細胞素引入到小鼠細胞，來獲得重組的PDGF-2單二聚體(這里稱之為重組的PDGF)。用于表達的C-病態(tài)/PDGF-2細胞素是從正常人體培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞得到的(Collians，T.等人(1985)Nature216748-750)。
為確定PDGF/TGF-α混合物對促進傷口愈合的效果，進行了下述試驗。
讓重量在10到15公斤的小白約克夏豬(Parson農(nóng)場，Hadley，MA)在術前禁食至少六小時，然后進行麻醉。在無菌狀態(tài)下，對其背部和胸部剪毛、剃凈、并用溫和的肥皂水洗凈。然后用70%酒精對要做成傷口的部位消毒。
用一種改進的Castroviejo電植皮刀(Storz，St.Louis，Mo，由Brownells公司改進)造成1cm×2cm、深度為0.5mm的一些傷口。這些傷口系完全除去了上皮，并除去其真皮下方的一部分(可與二度燒傷相比擬)。各個傷口之間至少由15mm未受傷的皮膚隔開。將接受相同治療的傷口編成一組，并且與另一些組隔開至少3cm。不接受生長因子治療的傷口與接受這種治療的傷口至少隔開10cm。
這些傷口用單次敷用懸浮在生物凝膠中的下述生長因子進行治療的1)單獨使用500ng純?nèi)梭wPDGF(通過高性能液體層析法純化的)或重織的PDGF;2)與下述的每一種進行組合的500ng純重組的PDGFa)500ng人體TGF-α;b)500ng鼠的TGF-α;3)單獨使用500ng人或鼠的TGF-α。
在制作了傷口之后的第3天至第10天取活組織檢查標本。將用于組織學評價的活組織檢查標本取成楔形，約3mm深，并將其放入10%的福爾馬林中。使用一種電植皮刀來獲取用于放化分析和自動射線照相的標本。標本的最終尺寸為1.5mm×10mm×1.5mm。對于進行放化分析的每個傷口收集三個標本，而對于自動射線，對每個傷口收集兩個標本。在提取標本之后，將標本貯存在補充了10%牛胎兒血清的冷的EMEM(Eagle′sModifiedEssentialMedium)介質(zhì)中。對活組織檢查標本進行如下的分析組織學的評價使用標準的石蠟浸滲和植入技術來制備組織標本。制作4微米切片并使用過濾的Harris血毒素(hemotoxylin)和乙醇酒精進行染色;然后在顯微鏡下進行觀察。由兩個研究人員在整個這些切片的等分布點上對所有標本進行隨意的計數(shù)。使用置于顯微鏡的目鏡中的網(wǎng)格對上皮和連接組織層的寬度進行計數(shù);通過使用在相同條件下進行觀測的一個測微儀，將測量結果轉(zhuǎn)換為毫米。
DNA和蛋白質(zhì)的測定通過使用對Labarca等人(1980)在Anal.Biochem.120344-52中的方法的改進方法來進行DNA測定。將在濃縮的氫氧化銨中的50ul等分試樣的組織提取物加到400μl的緩沖液中，該緩沖液中含1M磷酸鈉和2M氯化鈉(PH7.0);使用HCl將最終溶液的PH值調(diào)節(jié)到7.4。之后，使最終的溶液體積為500μl，同時維持PH值為7.4。然后，將該溶液加到含Hoesht染劑(1.14mg/ml)的2.5ml的被緩沖的溶液(0.05M磷酸鈉，2M氯化鈉，PH為7.4)中。在352nm的激發(fā)波長處激發(fā)了熒光并且在454nm測到了輻射。使用通過相同的治療方法制備的小牛胸腺DNA來繪制標準曲線。
通過Bradford方法(Bradford(1976)，Anal.Biochem.72248-54)來測量在濃縮的氫氧化銨中組織提取物的蛋白質(zhì)濃度，其中以牛血清白蛋白作為標準。
結果組織學評價結果表明，和不接受任何治療、或和單獨使用人或鼠TGF-α治療、或和單獨使用純PDGF治療的傷口相比，用純化的人體PDGF或重組的PDGF和化學合成的人或鼠的TGF-α的組合進行治療的傷口具有較厚的連接組織和上皮層，并且具有與這些層相連的更大范圍的上皮突起。
PDGF/TGF-α治療的傷口具有較大的DNA、蛋白質(zhì)和膠原含量。
劑量為了確定純化的PDGF的合適劑量，要重復上述這些實驗，只是這些傷口是用彌散在30μl生物相容凝膠中的、每平方毫米傷口2.5ng、5.0ng和10ng的純化PDGF的PDGF等價物進行治療的。結果表明，在PDGF含量是5.0ng/cm2或更高些時得到的效果最佳。
為了確定純PDGF加TGF-α的適當劑量，按上述方法對組合制劑進行估計，其中PDGF與TGF-α的重量比范圍為自1∶10至25∶1。在重量比范圍在1∶1和2∶1之間得到的結果最佳。
權利要求
1.一種用于愈合哺乳動物外傷的方法，包括將傷口愈合量的一種組合制劑加到所說傷口，該組合制劑包括純化的血小板衍生的生長因子和純化的α轉(zhuǎn)移生長因子。
2.一種如權利要求1所述的方法，其中在所說組合制劑中的所說血小板衍生的生長因子與α轉(zhuǎn)移生長因子的重量比在1∶4和25∶1之間。
3.一種如權利要求2所述的方法，其中所說的重量比在1∶2和10∶1之間。
4.一種如權利要求3所述的方法，其中所說的重量比約為1∶1或2∶1。
5.一種傷口愈合組合制劑，包括純化的血小板衍生的生長因子和純化的α轉(zhuǎn)移生長因子，它們的重量比為1∶4至25∶1。
6.一種如權利要求5所述的組合制劑，其中的所說重量比在1∶2和10∶1之間。
7.一種如權利要求6所述的組合制劑，其中所說的重量比約為1∶1或2∶1。
8.一種用于制備愈合傷口的組合制劑的方法，包括按1∶4和25∶1之間的一個重量比混合純化的血小板衍生的生長因子和純化的α轉(zhuǎn)移生長因子。
全文摘要
通過給哺乳動物涂敷一種組合制劑使哺乳動物外傷愈合、骨骼再生。該組合制劑包含純化的血小板衍生的生長因子和α轉(zhuǎn)移生長因子。
文檔編號B65D88/20GK1036332SQ8810927
公開日1989年10月18日 申請日期1988年12月21日 優(yōu)先權日1987年12月22日
發(fā)明者哈里·N·安東尼亞迪斯, 塞繆爾·E·林奇 申請人:哈弗大學校長及研究員協(xié)會, 分子生物學研究所