專利名稱：賦予植物抗病性的方法和材料的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及植物分子生物學(xué)。具體地，它涉及賦予植物抗病性的核酸和方法。
對在政府資助的研究和開發(fā)下作出的發(fā)明權(quán)利的聲明本發(fā)明是在國立衛(wèi)生研究院的批號GM47907和美國農(nóng)業(yè)部批號No.9300834下，在政府的資助下完成的。政府對該發(fā)明有一定的權(quán)利。
背景技術(shù)：
賦予抗病性的基因座已經(jīng)在許多植物種中被鑒別出。對許多植物-病原體之間相互作用的遺傳分析已表明，植物含有賦予針對病原體具體種類(含有互補的無毒基因)抗性的基因座。對這些基因的分子水平的定性可提供賦予各種不同農(nóng)作物抗病性的手段。
那些已經(jīng)在分子水平定性的植物抗性基因分成4類。一種基因，玉米中的Hml，編碼一種還原酶，它對真菌病原體Cochliobolus Carbonum有效(Johal等人，科學(xué)，258985-987(1992))。在番茄中，Pto基因賦予對表達(dá)avrPto無毒基因的丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)的抗性，(Martin等人，科學(xué)，2621432(1993))。預(yù)計的Pto基因編碼絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶。番茄Cf-9基因賦予對攜帶無毒基因Avr9的真菌暗黃枝孢(Cladosporium fullvum)種類的抗性(Jones等人，科學(xué)，266789-793(1994))。番茄Cf-9基因編碼推定的胞外LRR蛋白。最后，擬南芥(Arabidopsis thaliana)的RPS2基因賦予對表達(dá)avrRpt2無毒基因的丁香假單胞菌的抗性(Bent等人，科學(xué)，2651856-1860(1994))。RPs2編碼具有LRR基序和P-環(huán)基序的蛋白質(zhì)。
由黃單胞菌屬(Xanthomonas spp.)造成的細(xì)菌枯萎病影響幾乎所有的農(nóng)作物，并導(dǎo)致世界范圍內(nèi)廣泛的作物損失。由稻黃單胞菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo))造成的稻(Oryza sativa)細(xì)菌枯萎病是這種作物的主要疾病。已鑒別出在具有與眾不同的抗性(Xa)基因水稻栽培品種中誘導(dǎo)抗性或易感性反應(yīng)的Xoo品種。一種抗性源(Xa21)已經(jīng)在稻(Oryza longistaminata)野生種中鑒別出(Khush等人，Proceedings of the International Workshop on Bacterial Blight of Rice(International Rice Research Institue，1989)和Ikeda等人，Jpn J.Breed 40(Suppl.1)280-281(1990))。Xa21是顯性抗性基因座，它賦予對所有已知的Xoo分離株的抗性，而且唯一定性的是攜帶對Xoo 6抗性的Xa基因。對Xa21基因座的遺傳和物理分析已鑒別出大量在11號染色體上緊密連鎖的標(biāo)記(Ronald等人，Mol.Gen.Genet.236113-120(1992))。然而，Xa21賦予對該病原體抗性的分子機制還不清楚。
為了克隆賦予對各種不同細(xì)菌、真菌和病毒疾病抗性的植物基因，進(jìn)行了相當(dāng)?shù)呐?。僅有一種害蟲抗性基因被克隆在單子葉植物中。因為單子葉作物供養(yǎng)世界上絕大多數(shù)的人和動物，所以鑒別出這些植物中的抗病性基因是特別重要的。本發(fā)明針對這些及其他的需求。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了分離的核酸構(gòu)建物，它含有RRK多聚核苷酸序列，該序列在嚴(yán)緊條件下與SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.3雜交。代表性的RRK多聚核苷酸序列是編碼如SEQ.ID.No.4中所示的Xa21多肽的Xa21序列。RRK多聚核苷酸編碼的蛋白質(zhì)有富含亮氨酸的重復(fù)基序和/或細(xì)胞質(zhì)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。本發(fā)明的核酸構(gòu)建物還含有可操作地連于RRK多聚核苷酸序列的啟動子。啟動子可以是組織特異型啟動子或組成型啟動子。
本發(fā)明還提供了一種核酸構(gòu)建物，它含有連于異源多聚核苷酸序列的、來自RRK基因的啟動子序列。代表性的異源多聚核苷酸序列包括賦予植物對病原體抗性的結(jié)構(gòu)基因。
本發(fā)明還提供了一種含有重組的表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物，該表達(dá)盒含有可操作地連于多聚核苷酸序列的、來自RRK基因的啟動子；以及一種含有重組表達(dá)盒的轉(zhuǎn)基因植物，該表達(dá)盒含有可操作地連于RRK多聚核苷酸序列的植物的啟動子。盡管任何植物都可用于本發(fā)明，但是方便使用的是水稻和番茄。
本發(fā)明還提供了增強植物對黃單胞菌抗性的方法。該方法包括將重組的表達(dá)盒引入植物，該表達(dá)盒含有可操作地連于RRK多聚核苷酸序列的植物啟動子。該方法可方便地用于水稻和番茄植物。
定義術(shù)語“植物”包括全植株、植物器官(如葉、莖、根等)、種子和植物細(xì)胞以及它們的子代?？捎糜诒景l(fā)明方法的植物的種類一般可寬至可進(jìn)行轉(zhuǎn)化技術(shù)的高等植物類型，包括單子葉和雙子葉植物。
“異源序列”是來自不同種的序列，或者如果來自同一種則是對其最初形式經(jīng)過充分修飾的序列。例如，可操作地連于異源結(jié)構(gòu)基因的啟動子可以是來自不同于獲得該結(jié)構(gòu)基因的種，或者，如果來自同一種，則其中之一或兩者都對它們的最初形式進(jìn)行了充分的修飾。
“RRK基因”是編碼含有胞外LRR結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域的RRK多肽的一類新的抗病性基因中的成員(如在例如RLK5、Pto和Fen中所示(Martin等人，植物細(xì)胞61543-1552(1994))。如本文所用，LRR結(jié)構(gòu)域是如

圖1所示并在Cf-9和RLK5中發(fā)現(xiàn)的有約24個殘基重復(fù)單元的區(qū)域。)。用此處所公開的序列和標(biāo)準(zhǔn)的核酸雜交和/或擴(kuò)增技術(shù)，技術(shù)人員可鑒別出該類基因的成員。例如，來自Xa21基因的核酸探針可檢測在58個水稻重組近交系中與blast(Pyricularia oryzae)抗性基因(Pi7)分離的多態(tài)性。相同的探針還可在攜帶xa5和Xa10抗性基因的近同基因系中檢測多態(tài)性。
在某些優(yōu)選例子中，這類抗病性基因的成員可以通過它們能夠被簡并的、對應(yīng)于LRR和激酶結(jié)構(gòu)域的PCR引物所擴(kuò)增出而鑒別出。例如，已使用引物來分離番茄中的同源基因。用于該目的的代表性的引物是tcaag caaca atttg tcagg nca a/gat a/c/t cc(對于LRR結(jié)構(gòu)域序列GQIP)和taaca gcaca ttgct tgatt tnan g/a tcncg g/atg(激酶結(jié)構(gòu)域序列HCDIK)。
“Xa21多聚核苷酸序列”是Xa21基因如水稻Xa21基因的亞序列或全長多聚核苷酸序列，當(dāng)它存在于轉(zhuǎn)基因植物中時會將對黃單胞菌屬(如X.oryzae)的抗性賦予植物。代表性的本發(fā)明多聚核苷酸包括SEQ.ID.No.3的編碼區(qū)域。Xa21多聚核苷酸典型地長至少約3100-6500核苷酸，通常為約4000-4500核苷酸。
“Xa21多肽”是Xa21多聚核苷酸序列的基因產(chǎn)物，它有Xa21的活性，即能夠賦予對黃單胞菌屬的抗性。和其他RRK多肽一樣，Xa21多肽的特征是存在含有富含亮氨酸的重復(fù)片段(leucine rich repeats，LRR)的胞外結(jié)構(gòu)域和/或胞質(zhì)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域。代表性的本發(fā)明Xa21多肽包括在SEQ.ID.No.4中。
在轉(zhuǎn)基因的表達(dá)中，技術(shù)人員會認(rèn)識到插入的多聚核苷酸序列不必完全相同，而可以是與起源的基因序列“基本相同”。如下所述，這些變異體被該術(shù)語所具體涵蓋。
在插入的多聚核苷酸序列被轉(zhuǎn)錄和翻譯從而產(chǎn)生功能性RRK多肽的情況下，技術(shù)人員會認(rèn)識到，因為密碼子的簡并性，有大量多聚核苷酸序列可以編碼相同的多肽。這些變異體都被術(shù)語“RRK多聚核苷酸序列”所具體涵蓋。此外，術(shù)語特定地包括了全長的、與RRK基因序列基本相同(確定方法如下所述)的序列，以及編碼出保留RRK蛋白功能的蛋白質(zhì)的序列。因此，在此處公開的水稻RRK基因的情況下，上述術(shù)語包括這樣的變異多聚核苷酸序列，這些序列與此處公開的序列基本相同而且編碼的蛋白質(zhì)能夠使含有該序列的轉(zhuǎn)基因植物有抗黃單胞菌或其他植物疾病或害蟲的抗性。
按下述的最大對應(yīng)性排列時，如果兩個序列中的核苷酸或氨基酸殘基序列分別是相同的，那么這兩個多聚核苷酸或多肽就被稱為是“相同的”。術(shù)語“互補于”在此處被用于指互補序列與參照的多聚核苷酸序列的全部或部分是相同的。
在兩個(或多個)多聚核苷酸或多肽之間的序列比較一般是這樣進(jìn)行的，即在一片段或“比較窗”內(nèi)比較兩個序列的順序，以鑒別或比較局部區(qū)域的序列相似性。用于比較目的的片段至少為約20個連續(xù)位置，通常為約50-200個，更常見為約100-150個，其中在將兩個序列按最佳方式排列之后，將該序列與僅有相同數(shù)目的連續(xù)位置的參照序列進(jìn)行比較。
對于比較，序列的最佳排列的進(jìn)行可以用Smith和Waterman高級應(yīng)用數(shù)學(xué)(Adv.Appl.Math.)2482(1981)的局部同源性算法，Needleman和Wunsch分子生物學(xué)雜志(J.Mol.Biol.)48443(1970)的同源性算法，Person和Lipman美國科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.)(U.S.A.)852444(1988)的相似性搜索方法，或用計算機完成這些算法(GAP，BESTFIT，F(xiàn)ASTA，和TFASTA，在WisconsinGenetics Software Package中，Genetics Computer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI)，或者通過目測。
“序列相同百分比”是通過在比較窗內(nèi)比較兩個最佳排列的序列而確定的，其中，在比較窗內(nèi)的多聚核苷酸序列部分可包括為了最佳排列兩個序列而與對照序列(它不含有插入或缺失)相比時的添加或缺失(如缺口)。百分比是這樣計算的確定在兩個序列中相同的核酸堿基或氨基酸殘基的位置數(shù)目，用匹配的位置數(shù)目除以比較窗內(nèi)位置的總數(shù)，然后將結(jié)果乘以100，得到序列相同百分比。
術(shù)語多聚核苷酸的“基本相同”指用標(biāo)準(zhǔn)參數(shù)和上述的程序(優(yōu)選BESTFIT)與參照序列比較時，多聚核苷酸序列含有的序列至少有60％序列相同，較佳地至少80％序列相同，更佳地至少90％序列相同，最佳地至少95％序列相同。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會認(rèn)識到，通過考慮密碼子的簡并性、氨基酸相似性、閱讀框位置等因素，可以對這些數(shù)值進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，以確定由兩個核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)的相同性。出于這些目的，氨基酸序列的基本相同一般指至少40％，較佳地至少60％，更佳地至少90％，最佳地至少95％序列相同?！盎绢愃啤钡亩嚯墓灿腥缟纤龅男蛄校瞬幌嗤臍埢恢每梢杂帽Ｊ匦园被岣淖兯鎿Q。保守性氨基酸替換指具有類似側(cè)鏈的殘基的相互替代。例如，具有脂族側(cè)鏈的一組氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸；具有脂族羥基側(cè)鏈的一組氨基酸是絲氨酸、蘇氨酸；具有酰胺側(cè)鏈的一組氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族側(cè)鏈的一組氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸；具有堿性側(cè)鏈的一組氨基酸是賴氨酸、精氨酸和組氨酸；而具有含硫側(cè)鏈的一組氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。優(yōu)選的保守性氨基酸置換組是纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸，苯丙氨酸-酪氨酸，賴氨酸-精氨酸，丙氨酸-纈氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。
另一個核苷酸序列基本相同的標(biāo)志是兩個分子可在合適的條件下相互雜交。合適的條件可以是高嚴(yán)緊或低嚴(yán)緊條件，在不同的情況下有所不同。一般，嚴(yán)緊條件可選擇比特定序列在所定的離子強度和pH下的熱解鏈溫度(Tm)低約5-20℃。Tm是約50％靶序列與完全匹配的探針雜交時的溫度(在所定的離子強度和pH下)。一般，嚴(yán)緊洗滌條件是在pH7，鹽濃度為約0.02摩爾以及溫度至少約60℃。然而，在嚴(yán)緊條件下并不相互雜交的核酸仍可能是基本相同的，如果它們編碼的多肽是基本相同的。這在例如用遺傳密碼所允許的最大程度的密碼子簡并性來產(chǎn)生核酸拷貝時會發(fā)生。對于Southern雜交，高嚴(yán)緊洗滌條件可包括至少在65℃于0.1X SSC中洗滌一次。
可用標(biāo)準(zhǔn)程序并將此處公開的核酸(如SEQ.ID.No.1或3)用作探針，從cDNA或基因組文庫中鑒別出本發(fā)明的核酸。低嚴(yán)緊雜交條件典型地包括在65℃用2XSSC洗滌至少一次。洗滌后優(yōu)選在65℃用1X SSC洗滌。
如此處所用，特定的RRK基因(如此處公開的水稻Xa21基因)的同系物，是第二種編碼氨基酸序列與第一種基因產(chǎn)物的多肽序列有至少25％相同或45％相似(如上確定)的蛋白質(zhì)的基因(在相同物種或不同物種中)。一般相信，同系物具有共同的進(jìn)化起源。
附圖簡述圖1是富含亮氨酸重復(fù)片段的蛋白質(zhì)的比較。
圖2A-F顯示了含有可與Xa21-特異性探針雜交的區(qū)域的BAC和粘?？寺〉牟糠窒拗菩詧D譜。
圖3顯示了pB822(最活躍的拷貝)的限制性圖譜。
圖4顯示了在含有來自pB822克隆的Xa21基因的轉(zhuǎn)基因植物中，測量黃單胞菌抗性的測試結(jié)果。
圖5顯示了TRK1的位置圖。
圖6顯示了TRL1的位置圖。
優(yōu)選實施例的描述本發(fā)明涉及植物RRK基因，如水稻的Xa21基因。來自RRK基因尤其是Xa21基因的核酸序列，可以被用于在植物中賦予對黃單胞菌或其他病原體的抗性。本發(fā)明可用于在會受病原體感染的所有高等植物中賦予抗性。因此，本發(fā)明可用于大量不同范圍的植物類型，包括來自下列屬的種胡桃屬(Juglans)，草莓屬(Fragaria)，百脈根屬(Lotus)，苜蓿屬(Medicago)，驢豆屬(Onobrychis)，車軸草屬(Trigonella)，胡盧巴屬(Trigonella)，豇豆屬(Vigna)，柑桔屬(Citrus)，亞麻屬(Linum)，老鸛草屬(Geranium)，木薯屬(Manihot)，胡蘿卜屬(Daucus)，擬南芥屬(Arabidopsis)，蕓苔屬(Brassica)，蘿卜屬(Raphanus)，歐白芥屬(Sinapis)，顛茄屬(Atropa)，辣椒屬(Capsicum)，曼陀羅屬(Datrua)，天仙子屬(Hyoscyamus)，番茄屬(Lycopersicon)，煙草屬(Nicotiana)，茄屬(Solanum)，碧冬茄屬(Petunia)，毛地黃屬(Digitalis)，Majorana，菊苣屬(Ciahorium)，向日葵屬(Helianthus)，萵苣屬(Lactuca)，雀麥屬(Bromus)，天門冬屬(Asparagus)，金魚草屬(Antirrhinum)，Heterocallis，Nemesis，天竺葵屬(Pelargonium)，黍?qū)?Panieum)，狼尾草屬(Pennisetum)，毛茛屬(Ranunculus)，千里光屬(Senecio)，(Salpiglossis)，香瓜屬(Cucumis)，Browaalia，大豆屬(Glycine)，豌豆屬(Pisum)，菜豆屬(Phaseolus)，黑麥草屬(Lolium)，玉蜀黍?qū)?Zea)，燕麥屬(Avena)，大麥屬(Hordeum)，黑麥屬(Secale)，三毛草屬(Triticum)和高粱屬(Sorghum)。
下面的描述對水稻中Xa21基因的分離和定性過程的實施例章節(jié)，是代表性的分離Xa21基因和其他RRK基因的通用方法。分離的基因然后可用于構(gòu)建重組載體，以便將RRK基因表達(dá)賦予轉(zhuǎn)基因植物。
一般，在下述的重組DNA技術(shù)中的術(shù)語和實驗程序是本領(lǐng)域中熟知的和通常使用的。對于克隆、分離DNA和RNA、擴(kuò)增和純化使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。一般，涉及DNA連接酶、DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶等的酶反應(yīng)根據(jù)制造商的說明進(jìn)行。這些技術(shù)和各種其他技術(shù)一般按照Sambrook等人的“分子克隆-實驗室手冊”，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，(1989)進(jìn)行。
Xa21和相關(guān)RRK基因的分離可以用多種技術(shù)來完成。例如，可使用基于此處公開序列的寡核苷酸探針來鑒別cDNA或基因組DNA文庫中所需的基因。為了構(gòu)建基因組文庫，可通過隨機斷裂(如通過限制性內(nèi)切酶)產(chǎn)生基因組DNA的大片段，然后與載體DNA連接從而形成可被包入合適載體中的多聯(lián)體。為了制備cDNA文庫，從所需的器官如葉子中分離出mRNA，然后用mRNA制備含有RRK基因轉(zhuǎn)錄物的CDNA文庫?；蛘?，可從表達(dá)RRK基因或同系物的其他組織中抽提而得的mRNA制備cDNA。
然后，用基于克隆的RRK基因如此處公開的水稻Xa21基因的探針，來篩選cDNA或基因組文庫?？捎锰结樑c基因組DNA或cDNA序列雜交以分離出相同或不同植物種中的同源基因。
或者，可用擴(kuò)增技術(shù)從核酸樣品中擴(kuò)增出感興趣的核酸。例如，用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)從基因組DNA、cDNA、基因組文庫或cDNA文庫中直接擴(kuò)增出RRK和有關(guān)基因的序列。PCR和其他體外擴(kuò)增方法還可用于，例如，克隆編碼待表達(dá)的蛋白質(zhì)的核酸序列，制備用作在樣品中檢測所需mRNA存在與否的探針的核酸，核酸測序或其他目的。
用于從組織中鑒別出RRK序列的合適引物和探針，可以通過比較此處提供的序列而得出。對于PCR的總體回顧，可參見PCR ProtocolsA Guide to Methods andApplications.(Innis，M，Gelfand，D.，Sninsky，J.和White，T.編輯)，AcademicPress，San Diego(1990)，該文獻(xiàn)在此引用作為參考。
還可用熟知的技術(shù)如在科技文獻(xiàn)中所描述的技術(shù)，合成多聚核苷酸。參見例如Carruthers等人，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47411-418(1982)和Adams等人，J.Am.Chem.Soc.105661(1983)。然后或者通過合成互補鏈，在合適的條件下將鏈退火在一起，或者用合適的引物序列通過DNA聚合酶而添加互補鏈，可以獲得雙鏈DNA片段。
接著，如此處描述而制備的分離序列可用于在所需的植物中提供RRK基因表達(dá)，從而提供黃單胞菌抗性。技術(shù)人員會認(rèn)識到，編碼有功能的RRK蛋白的核酸(如SEQ.ID.No.2和4)不必具有與此處公開的代表性基因相同的序列。此外，與其他蛋白質(zhì)一樣，由RRK基因編碼的多肽具有執(zhí)行不同功能的不同結(jié)構(gòu)域。因此，RRK基因序列不必是全長的，只要所需的蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域被表達(dá)即可。如下詳細(xì)描述的那樣，本發(fā)明的蛋白質(zhì)含有胞外的富含亮氨酸的重復(fù)片段結(jié)構(gòu)域，以及胞內(nèi)的激酶結(jié)構(gòu)域?？捎帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員熟知的各種重組DNA技術(shù)方便地設(shè)計出修飾的蛋白質(zhì)鏈。例如，通過氨基酸置換、插入、缺失等可以在一級結(jié)構(gòu)水平使鏈不同于天然存在的序列。修飾還可包括，將來自本發(fā)明蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域與來自其他害蟲抗性基因的相關(guān)結(jié)構(gòu)域進(jìn)行互換。例如，本發(fā)明蛋白質(zhì)的胞外結(jié)構(gòu)域(包括富含亮氨酸重復(fù)片段的區(qū)域)可被番茄Cf-9基因的胞外結(jié)構(gòu)域替換，從而提供對水稻真菌病原體的抗性。這些修飾形式可以大量組合形式使用，從而產(chǎn)生最終的修飾的蛋白質(zhì)鏈。
為了在上述的技術(shù)中使用分離的RRK序列，制備適合轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的重組DNA載體。用于轉(zhuǎn)化各種不同的高等植物種的技術(shù)是眾所周知的，并且描述于技術(shù)和科學(xué)文獻(xiàn)中。例如，參見Weising等人，Ann.Rev.Genet.22421-477(1988)。
編碼所需的RRK多肽的DNA序列，例如編碼全長蛋白質(zhì)的cDNA或基因組序列，可用于構(gòu)建能夠引入所需植物的重組表達(dá)盒。一個表達(dá)盒典型地包括RRK多聚核苷酸，該多聚核苷酸可操作地連于指導(dǎo)RRK基因序列在轉(zhuǎn)化植物的所需組織中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始調(diào)節(jié)序列。
例如，可采用能在再生植株的所有組織中指導(dǎo)RRK表達(dá)的植物啟動子片段。這種啟動子在此處被稱為“組成型”啟動子，它在絕大多數(shù)環(huán)境條件和發(fā)育或細(xì)胞分化階段下是活躍的。組成型啟動子的例子包括花椰菜花葉病毒(CaMV)35S轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域、來自根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumafaciens)的T-DNA的1′或2′啟動子、和技術(shù)人員已知的來自各種不同植物基因的其他轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域。
或者，植物啟動子可指導(dǎo)RRK基因在特定組織中的表達(dá)，或者處在更精確的環(huán)境或發(fā)育控制下。這種啟動子在此處被稱為“誘導(dǎo)型”啟動子?？捎绊懻T導(dǎo)型啟動子轉(zhuǎn)錄的環(huán)境條件包括病原體侵襲、厭氧條件或存在光。
處在發(fā)育控制下的啟動子的例子包括僅在某些組織如葉、根、果、種子或花中引發(fā)轉(zhuǎn)錄的啟動子。啟動子的操作也可不同，這取決于它在基因組中的位置。因此，誘導(dǎo)型啟動子在某些位置是全部或部分組成型的。
來自本發(fā)明的RRK基因的內(nèi)源啟動子可用于指導(dǎo)基因的表達(dá)。這些啟動子還可用于指導(dǎo)異源結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。因此，啟動子可用于重組表達(dá)盒中以驅(qū)動基因的表達(dá)，而該基因可賦予對任何病原體包括真菌、細(xì)菌等的抗性。
為了鑒別啟動子，分析此處描述的克隆的5′部分是否有啟動子序列的序列特征。例如，啟動子序列元件包括TATA盒共有序列(TATAAT)，它通常位于轉(zhuǎn)錄起始位點上游20-30堿基對處。在植物中，在TATA盒的更上游，在位置-80至-100處，典型地有一啟動子元件，它具有一系列圍繞著三聚核苷酸G(或T)NG的腺嘌呤。J.Messing等人，植物遺傳工程(Genetic Engineering in Plants)，pp.221-227(Kosage，Meredith和Hollaender編輯，1983)。
如果需要合適的多肽表達(dá)，那么應(yīng)在RRK編碼區(qū)域的3′端引入聚腺苷酸化區(qū)域。聚腺苷酸化區(qū)域可來自天然基因，或來自各種不同的其他植物基因，或來自T-DNA。
含有來自RRK基因序列的載體典型地含有標(biāo)記基因，該標(biāo)記基因使植物細(xì)胞有可選擇的表型。例如，標(biāo)記基因可以編碼抗生劑抗性，尤其是對抗生素如對卡那霉素、G418、博來霉素、潮霉素的抗性，對除草劑的抗性如對chlorosluforon或Basta的抗性。
這些DNA構(gòu)建物可用各種常規(guī)技術(shù)引入所需植物宿主的基因組中。例如，對植物細(xì)胞原生質(zhì)體或胚愈傷組織用諸如電穿孔、PEG穿孔、顆粒轟擊和微注射等技術(shù)，可以將DNA構(gòu)建物直接導(dǎo)入植物細(xì)胞的基因組DNA，或者用沖擊方法如DNA顆粒轟擊，可以將DNA構(gòu)建物直接引入植物組織?；蛘?，DNA構(gòu)建物可與合適的T-DNA側(cè)翼區(qū)域合并，然后導(dǎo)入常規(guī)的根瘤土壤桿菌宿主載體中。當(dāng)細(xì)胞被細(xì)菌感染時，根瘤土壤桿菌宿主的毒力功能可以指導(dǎo)構(gòu)建物和相鄰的標(biāo)記插入到植物細(xì)胞DNA中。
轉(zhuǎn)化技術(shù)是本領(lǐng)域中熟知的，在科學(xué)和專利文獻(xiàn)中有充分的描述。用聚乙二醇引入DNA構(gòu)建物的方法描述于Paszkowski等人，歐洲分子生物學(xué)協(xié)會雜志(Embo J.)2717-2722(1984)。電穿孔技術(shù)描述于Fromm等人，美國科學(xué)院院報，825824(1985)。轟擊轉(zhuǎn)化技術(shù)描述于Klein等人，自然，32770-73(1987)。使用大量方法，可以轉(zhuǎn)化谷類種如黑麥(de la Pena等人，自然，325274-276(1987))、玉米(Rhodes等人，科學(xué)，240 204-207(1988))和水稻(Shimamoto等人，自然，338274-276(1989)，用電穿孔；Li等人，Plant Cell Rep.12250-255(1993)，用轟擊技術(shù))。
根瘤土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)在科學(xué)文獻(xiàn)中充分描述。參見例如Horsch等人，科學(xué)，233496-498(1984)和Fraley等人，美國科學(xué)院院報，804803(1983)。盡管土壤桿菌主要用于雙子葉，但是某些單子葉植物也可用土壤桿菌轉(zhuǎn)化。例如Hiei等人，Plant J.6271-282(1994)中描述了用土壤桿菌轉(zhuǎn)化水稻。
用上述任何的轉(zhuǎn)化技術(shù)衍生而得的轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞，可以被培養(yǎng)至再生完整的植株，該植株具有轉(zhuǎn)化的基因型，從而具有所需的RRK控制的表型。這種再生技術(shù)依賴于在組織培養(yǎng)生長培養(yǎng)基中某些植物激素的作用，典型地依賴于已與RRK核苷酸序列一起被包含的抗生劑和/或除草劑標(biāo)記。從培養(yǎng)的原生質(zhì)體再生植物描述于Evan等人，Protoplasts Isolation and Culture，Handbook of Plant CellCulture，pp.124-176，MacMillilan Publishing Company，New York，1983；和Binding，Regeneration of Plants，Plant Protoplasts，pp.21-73，CRC Press，Boca Raton，1985。還可從植物愈傷組織、外植體、器官或其部分而再生。這種再生技術(shù)在Klee等人，Ann.Rev.Of Plant Phys.38467-486(1987)中有全面描述。
本發(fā)明方法特別適用于將RRK多聚核苷酸以在自然界沒有的方式和情況下引入轉(zhuǎn)化的植物中。具體地，RRK多聚核苷酸可以不同于天然植物的特征而時?；虼罅康剡M(jìn)行表達(dá)。
技術(shù)人員還認(rèn)識到，在表達(dá)盒穩(wěn)定地被引入轉(zhuǎn)基因植物并證實可操作之后，它可以通過有性雜交而被引入其他植物?？梢允褂么罅繕?biāo)準(zhǔn)雜交技術(shù)中的任何技術(shù)，這取決于待雜交的種。
RRK基因表達(dá)的修飾效果可以在mRNA水平通過檢測增加或減少而確定，例如通過Northern印跡法。此外，基因表達(dá)的表型效果可通過測量植物中的病痕長度而檢測。下面描述了合適的確定抗性的分析方法。
以闡述方式給出下列實施例，它們不起限制作用。
實施例1也可以用基于圖譜的克隆法來分離植物基因。該方法包括對與目標(biāo)基因緊密連鎖的DNA標(biāo)記進(jìn)行鑒定。對大的染色體區(qū)域進(jìn)行基于圖譜的克隆和物理分析獲得成功的一個要求是得到含有基因組DNA大插入片段的基因文庫。最近，Shizuya.H.等在美國科學(xué)院院報(Proc.Natl.Acad.Sci.)89，8794-8797(1992)中描述了一種細(xì)菌人工染色體(BAC)系統(tǒng)，用于克隆人基因組DNA大片段。該系統(tǒng)使用基于F因子的載體，能夠包含大于300kb的人基因組DNA片段。DNA能夠高效克隆在大腸桿菌(E.coli.)中，操作簡便，保存穩(wěn)定。下文是利用該技術(shù)分離本發(fā)明基因的說明。
攜帶Xa21相關(guān)序列的BAC和粘?？寺〉姆蛛xBAC克隆A.材料與方法水稻高分子量DNA的制備將國際水稻研究會(IRRI)的一水稻系，攜帶Xa-21的IR-BB21用作植物材料。植物在暖房中生長3至5周。收集葉組織，用蒸餾水洗滌，然后粉碎。根據(jù)Hatano，S.等在(植物科學(xué)雜志)(Plant Scince)，83，55-64(1992)和Zhang，H.B.等人在植物(Plant)，7，175-184(1994)中所述，進(jìn)行以下修改，從水稻組織中抽取高分子量DNA在液氮中，用冷的研缽與研杵將約20g葉組織研成粉末。將粉末攪拌懸浮在200ml冷的核萃取(NE)緩沖液(1MM亞精胺，1mM精胺，10mM Na2EDTA，10mm Trizma堿，80mM KCl，0.15％Triton-X100和0.4M蔗糖，pH9.4)中。將此混合物通過兩層干酪濾布過濾到GSA瓶中，在4℃以1200g離心20分鐘。棄去上清液，將細(xì)胞核沉淀(淺綠色)重懸在50ml冷的NE緩沖液中。重懸后的沉淀經(jīng)80微米的篩過濾到一個50ml試管中以去除綠色的組織碎片，然后以1000g離心10分鐘。如上所述再次將沉淀重懸和離心，但不經(jīng)80微米的篩過濾。細(xì)胞核沉淀(約5×108個/ml)重懸在2.5ml SCE緩沖液(1M山梨醇，0.1M檸檬酸鈉，60mM EDTA，pH7.0)中，埋入2.5ml 1％低熔點(LMP)瓊脂糖(Ultrapure)中。80μl的塊在25ml的ESP溶液(0.5M EDTA，pH9.3，1％十二烷基肌氨酸鈉，5mg/ml蛋白酶K，Boehringer Mannheim)于50℃培養(yǎng)2天，期間更換一次緩沖液。每個塊中含有5μgDNA。高分子量DNA的部分消化和利用PFGE的大小分離瓊脂糖塊在50℃對加有1mm PMSF(苯基甲基磺?；?的TE(10mm Tris-HCl和1mM EDTA，PH8.0)進(jìn)行兩次1小時的透析，然后在室溫下用HindIII緩沖液(50mM NaCl，10mM Tris-HCl，10mM MgCl2和1mM二硫赤蘚糖醇，pH7.9)進(jìn)行兩次1小時的平衡。在65℃用15分鐘將塊熔化，在37℃保溫5分鐘，然后部分消化。在DNA溶液中加入5至7單位/塊的HindIII(NEB，USA)，在37℃孵育30分鐘。加入1/10體積pH8.0的0.5％EDTA終止反應(yīng)。用切割成2mm內(nèi)徑的尖嘴移液管將部分消化后的DNA馬上加入0.8％LMP瓊脂糖中，利用PFGE(CHEF DR II系統(tǒng)，BioRad USA)分離。使用了兩種不同的PFGE方法構(gòu)建文庫。第一種，凝膠在150V電泳，使用8秒的起始和終止切換時間，在14℃進(jìn)行16小時。未分離的DNA(≥200kb)集中成一條窄條帶。第二種，凝膠在150V電泳，切換時間由60秒增加至90秒，在14℃進(jìn)行16小時。將兩種方法中含有部分消化的DNA的凝膠切下，浸在TE中，同時用溴乙錠染色凝膠的標(biāo)記物泳道。從凝膠中切取含有大于200kb片段(第一種PFGE方法)或含有250-350kb片段(第二種方法)的瓊脂糖條。瓊脂糖條于4℃在TE中平衡2小時，放入1.5ml的試管中，在60℃熔化10分鐘，用凝膠酶(Gelase)(Epicenter，USA)(每100g瓊脂糖加1單位酶)消化，在45℃孵育1小時。將該DNA溶液直接用于連接反應(yīng)。載體的制備和分離，以及連接反應(yīng)載體pBeloBAC II，由H.Shizuya和M.Simon博土(California Institute ofTechnology，USA)提供。該載體在pBAC108L中插入了lacz基因。Shizuya等(1992)。將一個單菌落接種到5ml含有12.5μg/ml氯霉素的LB培養(yǎng)基中，在37℃生長4至5小時，然后加入6毫升LB培養(yǎng)基。接種物在37℃生長約16小時，直至OD600nm達(dá)1.3-1.5。用Qiagen的質(zhì)粒最大分離試劑盒(Qiagen，USA)分離質(zhì)粒。載體DNA通過45,000RPM的氯化銫/溴乙錠平衡離心60小時進(jìn)行純化。使用固定的角轉(zhuǎn)子70.1(Beckman，USA)，將轉(zhuǎn)子減速至35,000 RPM離心1小時，使梯度松散。用HindIII將質(zhì)粒消化完全，用凝膠電泳進(jìn)行分析。載體末端用HK磷酸酶(Epicenter，USA)在30℃脫磷酸化1小時，每1μg載體DNA使用1單位的酶。在65℃加熱30分鐘使HK磷酸酶失活。在100μl中進(jìn)行連接反應(yīng)，其中用400單位的T4 DNA連接酶(NEB，USA)將約40ng經(jīng)大小選擇的水稻DNA(約85μl)與10ng HindIII消化的載體(1μl)連接(摩爾比約10比1，載體過量)。轉(zhuǎn)化前，在ULTRAFREE-MC過濾試管(Millipore，USA)中，連接反應(yīng)液用TE于4℃通宵透析。BAC轉(zhuǎn)化根據(jù)如下設(shè)定，利用Cell-Porator(GIBCO-BRL，USA)以電穿孔法轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌DH10B細(xì)胞(GIBCOBRL，USA)電壓400；電荷速度快；加壓電阻4,000；電容300μ；電阻低。每一次電穿孔將13μl感受態(tài)細(xì)胞與0.5-1.0μl連接反應(yīng)液混合。電穿孔后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1ml SOC溶液(2％細(xì)菌胰蛋白酶解胨，0.5％細(xì)菌酵母提取物，10MM NaCl，2.5mM KCl，10mM MgCL2，10mM MgSO4，20mM葡萄糖，pH7.0)中，在37℃輕微振蕩(90-95RPM)培養(yǎng)45分鐘。將細(xì)胞分散在含有氯霉素(12.5μg/ml)、X-gal(40μg/ml)和IPTG(異丙基硫-β-D-半乳糖苷)(0.072μg/ml)的LB培養(yǎng)板中。將板在37℃培養(yǎng)24小時。將含有水稻DNA插入片段的白色菌落選取到新鮮的LB培養(yǎng)板上，進(jìn)行第二次顏色篩選。將BAC克隆轉(zhuǎn)移到384格微滴板(Genetix，UK)上，格中含有60μl LB冷凍緩沖液(36mM K2HPO4，13.2mM KH2PO4，1.7mM檸檬酸，0.4MM MgSO4，6.8mM(NH4)2SO4，4.4％v/v甘油，12.5μg/ml氯霉素，LB)，在37℃培養(yǎng)24小時。由于95％以上的菌落在第二次篩選時仍為白色，在以下實驗中只進(jìn)行一次篩選，直接將白色菌落選取到384格微滴板上。將文庫復(fù)制兩次，保存在不同的兩個-80℃冰箱中。濾膜的制備將384格微滴板上每一格中的BAC菌落都復(fù)制到Hybond N+濾膜(Amersham，USA)上。將濾膜放在含有LB/瓊脂糖和12.5μg/ml氯霉素的塑料盒中，盒在37℃保溫過夜，直至菌落直徑達(dá)約2至3mm。如Nizetic，D等人在核酸研究(Nucl.Acids Res.)19，182(1990)；Hoheisel，J.D.等人在細(xì)胞(Cell)73，109-120(1993)中所述處理濾膜。雜交和洗滌條件如Hoheisel等人(1993)所述。用隨機引物延伸反應(yīng)來標(biāo)記探針。Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.，生物化學(xué)分析(Anal.Biochem.)132，6-13(1983)；附錄137，266-267(1984)。B.結(jié)果上述BAC文庫包括11,000個克隆。用兩種方法來構(gòu)建該文庫。具有7269個克隆的前半個文庫是用Ramsay，M和Wicking，C.，在人分子遺傳學(xué)方法(Protocols inHuman Molecular Genetics)，197-221(1991)中所述的壓縮區(qū)帶法經(jīng)一次大小選擇構(gòu)建而成的。具有3731個克隆的后半個文庫是利用對部分消化的DNA進(jìn)行兩次大小選擇構(gòu)建而成的。但是，兩次大小選擇不能提高DNA插入片段的平均大小。顯然，在經(jīng)大小選擇的DNA溶液(只分離出250至350kb的DNA)中仍然有小分子DNA存在。以下實驗證明，用于連接的350至500kb之間的DNA的兩次大小選擇提高了BAC克隆中的較大平均插入片段。在從文庫中選出54個隨機BAC克隆中，其中50個含有水稻DNA(93.0％)。部分克隆不含插入片段(7％)。DNA插入片段的大小在30至250kb之間，平均值為125kb。
用于構(gòu)建BAC文庫的高分子量DNA分離自純化的水稻細(xì)胞核。低速離心(＜1000g)去除了大部分的葉綠體和線粒體。新BAC文庫中發(fā)現(xiàn)葉綠體或線粒體克隆的低幾率(＜0.3％)降低了細(xì)胞器DNA/細(xì)胞核DNA連接的可能性。
BAC文庫被用于構(gòu)建一組跨越Xa21基因座的毗連克隆(毗連(序列)群)。用兩個Xa21連鎖的DNA標(biāo)記，RG103(1kb，參見Ronald等人，分子遺傳學(xué)(Mol.Gen.Genet.)236113-120(1992))和pTA818(1.2kb，相當(dāng)于Ronald等人的RAPD818)篩選BAC文庫。在含Xa21的品系中發(fā)現(xiàn)RG103有8個拷貝，并與該品系中8個基因組HindIII DNA片段雜交。這些片段都在遺傳和物理上與Xa21抗病性基因座連鎖。pTA818與2個DNA片段雜交，其中最少一個片段與Xa21基因座連鎖。Ronald等人(1992)。
用pTA818(2個拷貝)和RG103(8個拷貝)探針與7296個BAC克隆雜交。分別鑒定出7個與RG103雜交的BAC克隆和5個與pTA818雜交的BAC克隆。從這些克隆中分離BAC DNA，并用HindIII消化。用PFGE分離DNA片段。Southern分析顯示，7個與RG103雜交的BAC克隆攜帶有RG103基因組HindIII片段的4種不同拷貝。探針與一段4.3kb和9.5kb片段雜交，與一段9.6kb和6.2kb片段雜交。DNA片段的大小是從用HindIII消化的λDNA推算的。
分離出4個攜帶一種pTA818 HindIII片段的BAC克隆，并鑒定出一個攜帶另一種拷貝的BAC克隆。含BAC的pTA818與標(biāo)記PTA248(相當(dāng)于Ronald等(1992)的RAPD248)雜交，這證實，這兩個被克隆的RAPD標(biāo)記基因均在60kb以內(nèi)，且相互包含。Ronald等人(1992)。
鑒定出12個與2種克隆DNA序列(對應(yīng)于水稻基因組中的10個DNA片段)雜交的BAC克隆，這略低于根據(jù)2x基因組當(dāng)量篩選(7296個菌落，450,000kb基因組，平均插入大小125kb)預(yù)計的20個菌落。具體地說，在文庫的這一部分，pTA818序列和4個RG103雜交序列(8個中的4個)過度表現(xiàn)。相反，另外4個RG103序列表現(xiàn)不足。這些克隆的DNA插入片段大小在40至140kb之間。
粘?？寺.材料與方法水稻葉中高分子量(HMW)DNA的制備攜帶Xa21基因座的水稻系1188用作分離HMW DNA的植物材料。收集120g的4至6周齡的葉組織，在液氮中用冷的研缽和研杵研磨成細(xì)粉。然后將粉末攪拌懸浮在800ml冷的H緩沖液[4mM亞精胺，1mM精胺，10mM EDTA，10mMTris-HCl，80mM KCl，0.5M蔗糖，1mM PMSF(苯基甲基磺酰基氯，使用前加入)，0.5％(v/v)Triton-X100，1/1000(v/v)β巰基乙醇(使用前加入)，pH9.5]中?；旌衔锝?jīng)80微米的篩過濾到GSA瓶中，將沉淀重懸在400ml H緩沖液中并再次過濾。合并兩次的濾液，在4℃以3500rpm離心10分鐘。將沉淀重懸在300ml洗滌緩沖液(與H緩沖液相同，但是不含PMSF和β巰基乙醇)中，在4℃以3500rpm離心10分鐘。沉淀再洗滌兩次，直至沉淀的顏色為淺綠色。將沉淀重懸在40ml洗滌緩沖液中，加入等體積的含2mg/ml蛋白酶K(Boehringer Mannhein)的裂解緩沖液(2％十二烷基肌氨酸鈉，100mM Tris-HCl，0.5M EDTA，pH9.5)裂解細(xì)胞核。在50℃反應(yīng)5小時，然后在室溫下用等體積的苯酚-氯仿-異戊醇(24∶24∶1)萃取30分鐘(溫和倒轉(zhuǎn))，由此去除蛋白質(zhì)。溫和加入一層1/10體積的3M乙酸鈉(pH5.5)和一層2體積的乙醇，并溫和倒轉(zhuǎn)數(shù)次，由此沉淀HMW DNA。最后，用大口徑尖嘴移液管從乙醇中吸取DNA，用70％乙醇洗滌，干燥，溶解在1mlTE(10mM Tris-HCl，1mm EDTA，pH8.0)中靜置過夜。通常，可從120g葉中分離得到250μg HMW DNA。插入DNA的制備(A)HMW DNA的部分消化預(yù)試驗。將30μg(70μl)HMW DNA與10μl 10×Sau3AI緩沖液(NEB)混合，在37℃預(yù)熱5分鐘。然后在DNA溶液中加入20μl(2單位)Sau3AI，用大口徑尖嘴吸管輕微混合，在37℃培養(yǎng)。在0，5，10，20，30和70分鐘時取出等量的15μl，立即在冰上與0.5M EDTA 5μl(pH8.0)混合以終止反應(yīng)。然后在低溫室內(nèi)，在0.3％瓊脂糖/TBE凝膠中，以2V/cm凝膠長度電泳分析樣品。
重復(fù)預(yù)試驗，使用37℃時的最佳培育間期20分鐘，可獲得大規(guī)模的DNA部分消化。(B)大小選擇在SW27轉(zhuǎn)子中，在20℃，進(jìn)行26,000rpm的5至40％蔗糖梯度離心13小時，分離部分消化的DNA。將毛細(xì)管伸入離心試管底部，以非常緩慢的速度吸取梯度溶液，由此小心收集0.8ml的各份溶液(總共20ml)。每份樣品取20μl在0.3％瓊脂糖凝膠上以2V/cm凝膠長度電泳36小時。將35至50kb的DNA組份匯集在一起。用等體積的水稀釋蔗糖溶液，然后用2倍體積的乙醇沉淀DNA。使用標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行不完全反應(yīng)。連接、包裝和轉(zhuǎn)染粘粒載體pHC80由ScotHulbert博士提供。載體與插入DNA以2比1摩爾比例連接，最終濃度為0.8μg/μl。連接反應(yīng)使用600單位T4 DNA連接酶(NEB，USA)在16℃進(jìn)行過夜。連接后的DNA在體外用GigapackII包裝提取物(Stratagene，USA)根據(jù)Stratagene的說明，進(jìn)行包裝，然后轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌NM554。文庫的篩選將160個384格微滴板上的61440個粘粒菌落(大于5個基因組當(dāng)量)轉(zhuǎn)移到Hybond N+濾膜(Amersham，USA)上，形成兩種密度。在第一種方法中，用手動復(fù)制儀(Genetix，U.K.)低密度(1536菌落/11.5×15cm濾膜)復(fù)制粘?？寺?，在含10μg/ml氨芐青霉素的LB/瓊脂上生長過夜。用40張濾膜覆蓋整個粘粒文庫。在第二種方法中，用Beckman BiomekTM機動操作儀成排地高密度復(fù)制粘粒，使用與上述相同的方法進(jìn)行生長。使用3×3排，將3456個菌落轉(zhuǎn)移到一張8.5×12cm的濾膜上。為了在陰性背景上準(zhǔn)確定位陽性菌落，在每個3×3柵格的頭一個位置培養(yǎng)一個參照粘粒菌落(包含RG103標(biāo)記基因)。其后的8個位置培養(yǎng)來自粘粒文庫8個微滴板的菌落。此時，20張8.5×12cm的濾膜可覆蓋整個文庫。為了與一特殊探針雜交，RG103與該特殊探針以1∶4的比例混合，形成參照樣式。
利用經(jīng)以下修改的水蒸氣浴方法裂解濾膜上的細(xì)菌并固定化菌落面向上在浸于裂解溶液(0.5M NaOH，1.5M NaCl)的兩張3MM Whatman上，室溫下放置4分鐘，裝有濾膜的塑料盒在85℃的水蒸氣浴中孵育6分鐘，然后將濾膜轉(zhuǎn)移到浸在中和溶液(1M Tris-HCl(pH7.4)，1.5M Nacl)中的3MM Whatman上，放置4分鐘。浸在蛋白酶K溶液(50mM Tris-HCl(pH8.0)，50mM EDTA(pH8.0)，100MmNaCl，1％(v/v)十二烷基肌氨酸鈉，250μg/μl蛋白酶K)中于37℃孵育20分鐘，去除蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片。濾膜在室溫下用2×SSC溶液溫和洗滌5分鐘，干燥后距離10cm以UV處理2.5分鐘。
根據(jù)以下標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行雜交濾膜用預(yù)雜交溶液(7％SDS，0.5MNa2PO4(pH7.2)，1mM EDTA，100μg/ml ssDNA)在65℃處理2小時至通宵。用隨機引物延伸法標(biāo)記探針，在65℃通宵振蕩雜交。室溫下略微洗滌(40mMNa2PO4(pH7.2)，1％SDS)濾膜，然后將濾膜在相同的溶液中于65℃溫和振蕩孵育20分鐘。B.結(jié)果用三個Xa21連鎖標(biāo)記(RG103、RAPD248和RAPD818)篩選粘粒文庫?；蚪MSouthern分析顯示，三個標(biāo)記在抗性品系中的拷貝數(shù)分別是8，1和2(未公開結(jié)果)。鑒定出6個與RG103標(biāo)記雜交的陽性粘?？寺?，并經(jīng)進(jìn)一步的Southern分析所證實。但是，沒有鑒定出含RAPD248和RAPD818的陽性克隆。
實施例2Xa21基因的鑒定在實施例1中分離的5個粘?？寺『?個BAC克隆進(jìn)一步以限制性酶圖譜進(jìn)行鑒定。圖2A至2E是粘粒克隆的部分限制性酶切圖。圖2F是BAC克隆的部分限制性酶切圖。
在其中一個克隆pB806中鑒定出一個開放讀碼框(SEQ.ID.No.1)。它包括啟動子區(qū)、推定的內(nèi)含子和一部分3’序列。SEQ.ID.No.2顯示推定的氨基酸序列。推定的內(nèi)含子已切除。
推定的氨基酸序列揭示了蛋白質(zhì)的兩項特性，這兩項特性表明它是由一批新類型植物抗病性基因，本文中稱RRK基因編碼的。第一，由這些基因編碼的蛋白質(zhì)其胞外域包含了一塊約23個串聯(lián)富含亮氨酸重復(fù)序列(LRR)，平均長度為24個氨基酸。LRR基序已被認(rèn)為在多種蛋白質(zhì)中與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)反應(yīng)和配體結(jié)合有關(guān)。胞外域還包含位于LRR和信號肽之間的區(qū)域，其中包含SWNTS基序，該基序在許多蛋白質(zhì)中是保守的，其中包括Df-9、PGIP和RLK5。此外，該蛋白還包含一個區(qū)域，與PLPK5和TMK1之類受體樣蛋白激酶(PLPK)(Walker等人，植物雜志(Plant J.)3451(1993)；Chang等人植物細(xì)胞(Plant Cell)41263(1992)；Valon等人，植物分子生物學(xué)Plant Molec.Biol.)23415(1993))和番茄抗性基因產(chǎn)物Pto(Martin等人，科學(xué)(Scince)2621432(1993))具有高度的序列一致性。SEQ.ID.No.2中確定了信號域、胞外域(包含LRR區(qū))，跨膜域和胞質(zhì)激酶域。
圖3是另一個克隆，pB822的限制性酶圖，該克隆用于根據(jù)下文實施例3中所述的轉(zhuǎn)化實驗中所用的質(zhì)粒。該克隆中的Xa21基因也被測序(SEQ.ID.No.3)。推定氨基酸序列(SEQ.ID.No.4)顯示有相同的SEQ.ID.No.2中鑒定出的基序。
蛋白質(zhì)激酶域攜帶有11個亞域，亞域中包含15個保守的蛋白質(zhì)激酶特征性殘基，兩側(cè)分別是一個33aa的并膜域(aa 677-707)和一個C末端域。推定的內(nèi)含子在推定催化域中兩個高度保守的殘基P和E(aa892和aa893)之間。亞域VI(DIKSSN)和VIII(GTGYAAPE)中共有序列明顯表明，Xa21具有絲氨酸/蘇氨酸激酶(與酪氨酸相反)活性。
先前的研究證明，磷酸化的RLK5蛋白與2C型絲氨酸-蘇氨酸蛋白磷酸酶的激酶反應(yīng)域(KID)反應(yīng)(Stone等人，科學(xué)(Scince)，266793-795(1994))。KID與磷酸化的含RLK5和TMK1蛋白質(zhì)的LRR結(jié)合，但不能與S相關(guān)受體激酶ZmpK1和RLK4結(jié)合。該結(jié)果表明，擬南芥KID在功能上與動物蛋白的SH2結(jié)構(gòu)域類似。將擬南芥受體樣激酶RLK5、TMK1的序列與Xa21排列顯示圍繞著一個絲氨酸殘基有一組保守性氨基酸(N/Q)X(L/V)S(G/S)(L/A)(F/V)(P/E)，該絲氨酸殘基是最后一個殘基(精氨酸)的羧基端，在所有蛋白質(zhì)激酶中高度保守(Xa21基因產(chǎn)物的999位)。這些蛋白質(zhì)中共有的羧基端位置與Rous肉瘤病毒的癌基因產(chǎn)物pp60c-Src中磷酸酪氨酸羧基端類似，后者是與含SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)結(jié)合所必需的。在不與KID結(jié)合的S相關(guān)受體激酶ZmpK1，RLK4和SRK6和細(xì)胞間激酶中缺少這些保守性氨基酸。所以，該區(qū)域起著與KID蛋白高度親和性和特異性結(jié)合位點的作用。所以可利用改變Xa21區(qū)域的氨基酸序列來改變對KID蛋白質(zhì)的親和性，由此調(diào)節(jié)LRR結(jié)構(gòu)域的配體結(jié)合引起的胞間信號傳遞。
實施例3用Xa21基因轉(zhuǎn)化植物可用上述Xa21基因轉(zhuǎn)化水稻植株來證明該基因可使易感植株具有黃單胞菌抗性。對Li等人，植物細(xì)胞報道(Plant Cell Rep.)12250-255(1993)中的方法加以修改，以此將基因?qū)胍赘械乃局仓辍：喍灾?，用潮霉素?gòu)建物pMON410(Monsanto提供)和含有目標(biāo)序列的Bluscreipt載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。此外，將pB822的Kpn片段克隆到pTA818載體中，該載體來自Invitrogen載體pcr1000并含有1kb的片段RAPD818(Ronald等人，同上)。形成的質(zhì)粒稱pC822。用潮霉素(30mg/L)選擇植株，然后篩選對Xoo種6的抗性。
利用標(biāo)準(zhǔn)方法來測試轉(zhuǎn)化株的黃單胞菌抗性。根據(jù)Kaufma等人，植物疾病報道(Plant Disease Rep.)57537-541(1973)中的方法進(jìn)行實驗。簡而言之，Xoo種6在PSA平皿上生長3天。刮取細(xì)菌，懸浮在水中，調(diào)節(jié)OD值為109菌落形成單位/ml。將剪刀在懸浮液中浸一下，在距葉尖5cm處剪切轉(zhuǎn)化植株(轟擊后4個月)的葉。就接種后11天病痕的出現(xiàn)對植株進(jìn)行評定。
圖4顯示病痕長度數(shù)據(jù)，來自使用含pC822克隆的基因的表達(dá)載體進(jìn)行的實驗。由不同的轉(zhuǎn)化子發(fā)育成的個體106、-9、-22、11、-17、-1、-12、-4、16和29攜帶pC822構(gòu)建物，并且，與易感的未轉(zhuǎn)化對照(IR24)和用載體(1-15)轉(zhuǎn)化的水稻植株相比，抗性提高。
實施例4從番茄中分離RRK基因如上所述，Xa21序列可用于利用簡并引物或低嚴(yán)緊性雜交方法從其它植物種中分離RRK基因。本實施例說明了利用簡并引物法從番茄中分離并鑒定兩個RRK基因。
制備簡并引物，使得PCR(聚合酶鏈反應(yīng))產(chǎn)物擴(kuò)增LRR和激酶域間的序列，由此跨越跨膜域。正向引物來自Xa21和幾種其它植物蛋白(例如，cf-9，RLK5和PGIP)的LRR區(qū)中的保守性基序。反向引物來自Xa21激酶域和其它植物絲氨酸-蘇氨酸激酶域(例如，RLK5，Pto和Fen)(Martin等人，植物細(xì)胞(PlantCell)61543-1551(1994))的保守性基序。
用于PCR產(chǎn)物擴(kuò)增的簡并引物如下1.LRR區(qū)TCA AGC AAC AAT TTG TCA GGN CA(A/G)AT(A/C/T)CC(SEQ.ID.No.5)2.激酶區(qū)TAA CAG CAC ATT GCT TGA TTT NAN(G/A)TC NCG(G/A)TG(SEQ.ID.No.6)TAA CAG CAC ATT GCT TGA TTT NAN(G/A)TC(G/A)CA(G/A)TG(SEQ.ID.No，7)TAA CAG CAC ATT GCT TGA TTT NAN(G/A)TC(T/C)CT(G/A)TG(SEQ.ID.No.8)PCRPCR條件如下(20微升的反應(yīng))首循環(huán)94℃，30秒(變性)55℃，30秒(退火)72℃，1分鐘(延長)在其后的19輪循環(huán)中，每輪循環(huán)的退火溫度下降1℃。在第20輪循環(huán)結(jié)束后，反應(yīng)液在72℃孵育10分鐘。
在使用上述引物的初擴(kuò)增之后，使用以下特異性引物進(jìn)行第二次擴(kuò)增TAAGCAACAATTTG(SEQ.ID.No.9)TAACAGCACATTGCTTGA(SEQ.ID.No.10)此次擴(kuò)增的條件如下94℃， 15秒55℃， 15秒72℃， 15秒35輪循環(huán)后，反應(yīng)液在72℃孵育10分鐘。
克隆PCR產(chǎn)物，用作篩選番茄cDNA文庫的探針。番茄cDNA與寡聚dT引物雜交，與EcoRI銜接頭連接，克隆到λGT11載體中，由此構(gòu)建文庫。
以上引物被用于分離屬于抗病性基因RRK家族的兩種番茄PCR產(chǎn)物和cDNA。第一種克隆TRK1(番茄受體激酶1)是一個250bp的PCR產(chǎn)物，被用于分離部分cDNA。DNA序列顯示于SEQ.ID.No.11。TRK1的推定氨基酸序列顯示于SEQ.ID.No.12。
該克隆在番茄基因組中有一兩個拷貝，其中一個在酶切圖上位于1號染色體的短臂，靠近黃單胞菌campestris pv.vesicatoria抗性基因(Rxl)(Zu等人，遺傳(Genetics)141675-682(1995))(參見圖5)。
第二個克隆TRL1(番茄受體樣1)是一段496bp的PCR產(chǎn)物。DNA序列顯示于SEQ.ID.No.13。推定的氨基酸序列為SEQ.ID.No.14。TRL1在酶切圖上在3號染色體上的突變mcn的數(shù)個cM內(nèi)，突變mcn引起植株的點狀壞死，這是一種典型的防衛(wèi)性表型。
以上結(jié)果顯示，Xa21基因可用于從其它植物種中分離RRK基因。例如，分離得到的TRK1和TRL1基因是引起防衛(wèi)反應(yīng)的植物內(nèi)信號傳遞途徑的重要組成。這些基因可用于在番茄和其它植物種中以基因工程法產(chǎn)生抗病性。
以上實施例用于說明本發(fā)明而不是對其范圍的限制。對本領(lǐng)域一般技術(shù)人員來說，本發(fā)明的其它改變形式是顯而易見的，這些都在所附的權(quán)利要求范圍之內(nèi)。本文引用的全部公開文獻(xiàn)、質(zhì)粒和專利公開均被引用參考。SEQ.ID.No.1RRK-FaagctttctaaattatttaactctaagtctgttattatccccaagtacatcatcatcatacataatatttcatattcacgacatccttaagctagatgcttttggccattctcttatctttttaaagaaattctctcccaattaagatgagagtgtcttctagcaatttgccagtttttacaatgtctttgagtcctcacacattttcatgatgttaccaataaattacggacgccgtgtttagttctaaagtttttcttcaaacttacaacttttcaatcgcatcaaaactttctcctacacacacaaactttcaacttttccatcacatcgttccaatttcaaccaaacttccaattttggtatgaactaaacacagccgaaaacaaaatctgtgtgttatggccctgtttagattctaacttttccattacatcaaactttcctacatacacgaactttcaacttttccgtcacatcgtttcaattttttaaaacttccatttttaacgtggaactaaacacaacctatataacggaatttgtcaaaaactcaatggtgaaagtcacacctcacaggaagggcgcgctctagtcaagacatcattaaacaggtacacaggttgtactagcttgtcatgtttatcttgcgtctgcgagacgtaaatccatgccaaacaaaagtgcttctatagagatatcataaggatatggtttggggccatatccaactgctcaggagagatctcgttcggaggtgaggttagatgttcacctctccacacataacgaaggcgatcttcttcgcatatgattaggcattagataaaataaccttaaaaaataaatcaatatgatttttttagaaaaaaattatatacactaagtataagcattgtcaaggaggaagaaacacacactcccatatagagagatagaaacatagctataggtagtgtcactgagtattttccatcacgcatatccatataaaattagggggtgttacatccataggtgtaaagttttggcatgttatatcgagtattacgtagaatgccgtattaggtgtccgggcactaataaaaaaataattacagaatccgttagtaaaccgcgagataaatttattaagcctaattaatcccatcattaacaaatgtttaccgtagcaccacattgtcaaatcatggagcaattaggtttaaaagattcgtctcgcaaattagtcataatctgtgcaattagttatttttagactatatttaagacttcgtacaggtgttcaaacgttcgatgtgacatggtgcaaaattttagggtgtcatctagacactcccttaattagaaagttaggaagaggcggtaaagaacgcagcatgactgaaactttgaaaatttgataaggtacaccaactggagtatcttttattttcattgaagactttgaccagaagagcttgacccgtttttcttggagtagccagtaatgtttcattcttttccttttgctgggacttctttttattttttttgacaggagccatttgttgggacttgggatccctttactgttataggaccagtgcttgaatccaaacactgcattgatcagctcagctcattgtagcgcactcctccgcatgcATGGCGAGATCACCAACGTCGGTCATGATCTCTTCTTTGCTGCTGCTGCTGTTGATCGGCCCAGCGAGCAGTGACGATGATGCTGCTGCTGCTGCTGCTCGTACCAGTACAGGCGGCGTCGCGGCGACGAACTCGCGCTGCTCTCTTTCAAGTCATCCCTGCTACACCAGGGGGGCTTGTACGCTGGCATCTTGGAACACGTCCGGCCACGGCCAGCACTGCACATGGGTGGGTGTTGTGTGCGGCCGCGCGCGCCGGCACCCACACAGGGTGGTGAAGCTGCTGCTGCGCTCGTCCAACCTGTCCGGGATCATCTCGCCGTCGCTGGGCAACCTGTCCTTCCTCAGGGAGCTGGACCTCAGCGACAACTACCTCTCCGGCGAGATACCACCGGAGCTCAGCCGTCTCAGCAGGCTTCAGCTGCTGGAGCTGAGCGGTAACTCCATCCAAGGGAGCATCCACGCGGCCATTGGAGCATGCACCAAGTTGACATCGCTAGACCTCAGCCACAACCAACTGAGATTGGTGCCAGCTGAAACATCTCTCGAATTTGTACCTTCACACCAATGGTTATGTCAGGAGAGATTCCATCTGATTTTGGGCAATCTCACTACGCCTTCAGTATTTGATTTGACCTGCAACAGATTATCACGGAGCTATACCTTCATCGCTAGGGCAGCTCAGCAGCAGTCTATTGACTATGAATTTTGTGCTACGAACAATCTAACTGGCATGATCCCCAATTCTATCTGGAACCTTTCGTCTCTAGCAGCGTTTAGCTGTCAAGCGAAAAACAAGCTAGGTGGTATGATCCCTACAAATGCATTCAAAACCCTTCACCTCCTCGAGGTGGTAGATATGGGCACTAACCGATTCCATGGCAAAATCCCTGCCTCAGTTGCTAATGCTTCTCATCTGACACGGCTTCAGATTGATGGCAACTTGTTCAGTGGAATTATCACCTCGGGGTTTGGAAGGTTAAGAAATCTCACAACACTGTATCTCTGGAGAAATTTGTTTCAAACTAGAGAACAAGAAGATTGGGGGTTCATTTCTGACCTAACAAATTGCTCCAAATTACAAACATTGGACTTGGGAGAAAATAACCTGGGGGGAGTTCTTCCTAATTCGTTTTCCAATCTTTCCACTTCGCTTAGTTTTCTTGCACTTGATTTGAATAAGATCACAGGAAGCATTCCAAAGGATATTGGCAATCTTATTGGCTTACAACATCTCTATCTCTGCAACAACAATTTCAGAGGGTCACTTCCATCATCGTTGGGCAGGCTTAGAAACTTAGGCATTCTAGTCGCCTACGAAAACAACTTGAGCGGTTCGATCCCATTGGCCATAGGAAATCTTACTGAACTTAATATCTTACTGCTCGGCACCAACAAATTCAGTGGTTGGATACCATACACACTCTCAAACCTCACAAACTTGTTGTCATTAGGCCTCTCGCACCTCGCACCACAATCAGGGTTGGATACCTACACATCTCAACCTCACAACTGTGTCATAGCCTTCACTATACCTAGTGGGTCCCAAATACCCCAGGTGAAATTAATTCAAATAGTCCAAACACCTATCAAAAAGATGATCAATGTATCAAAAAATACACTTGGAGGGATCAGATACCCACAAGAAATAGGGCATCTCAAAAATCTAGTAGAATTCATGCAGAATCGAATAGATATCAGTAAAATCCCTAACACGCTTGGTGATTGCCAGCTCTTACGGTATCTTTATCTGCAAAATAATTTGTTATCTGGTAGCATCCCATCAGCCTTGGGTCAGCTGAAAGGTCTCGAAACTCTTGATCTCTCAAGCAACAATTTGTCAGGCCAGATACCCACATCCCTTAGCAGATATTACTATGCTTCATTCCTTGAACCTTTCTTTCAACAGCTTTGTGGGGGAAGTGCCAACCATTGCGTGCTTTCGCAGATGCATCCGGGATCTCAATCCAAGGCAATGCCAAACTCTGTGGTGGAATACCTGATCTACATCTGCCTCGATGTTGTCCCATTACTAGAGAACAGAAAGCATTTTCCAGCTCTACCTATTTCTGTTTCTCTGGTCGCAGCACTGGCCATCCTCTCATCACTCTACTTGCTTATAACCTGGAACAAGAGAACTAAAAAGGGAGCCCCTTCAAGAACTTCCATGAAAGGCCACCCATTGGTCTCTTATCCGCAGTTGGTAAAAGCAACAGATGGTTTCGCGCCGACCAATTTGTTGGGTTCTGGATCATTTGCCTCAGTATACAAACGAAAGCTTGAAAATCCTAAGGCACTCAAGAGTTTCACTGCCGAATGTGAAGCACTACGAAATATGCGACATCGAAATCTTGTCAAGATAGTTACAATTTGCTCGAGCATTGATAACAGAGGGAACGATTTCAAAGCAATTGTGTATGACTTCATGCCCAACGGCAGTCTGGAAGATTGGATACACCCTGAAACAAATGATCAAGCAGACCAGAGGCACTTGAATCTGCATCGAAGAGTGACCATACTACTTGATGTTGCCTGTGCATTGGACTATCTTCACCGCCATGGCCCTGAACCTGTTGTACACTGTGATGTTAAATCAAGCAATGTGCTGTTAGATTCTGATATGGTAGCGCATGTTGGAGATTCTGGGCTTGCAAGAATACTTGTTGATGGGACCTCATTGATACAACAGTCAACAAGCTCGATGGGATTTAGAGGGACAATTGGCTATGCAGCACCAggtcagcaagtccttccagtattttgcattttctgatctctagtgctatatgaaatagtttttacctctagtgaaactgatggagaatataagtaattaattgaactaattaaattgcacaaaaataagattatttgccatatctattcagatgctaaatatagctagttcatagaggtacatattttttttatataggaatctagagctactacacactcaaatcaaattatgggtgttttctgctctacactgcaatatgaaatgattatcagaaggatcaaatttgagtaaatttgtcaattctacatttaagaaacacttttttttgtatgtactagttattacaattttttatttcaagaacttgcattgaccatgaaaagtacttggtactacttctaattcccacatggaggtggtgaaaataatatagatacaaaaacgaagtatcatatgttgtgt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N LSGIISPSLGNLSFLRELDLSD NYLSGEIPPELSRLSRLQLLELSG NSIQGSIHAAIGACTKLTSLDLSH NQLRLVPAETSLEFVPSHQWLCQERFHLILGNLTTPSVFDLTC NRLSRSYTFIARAAQQQSIDYEFCAT NNLTGMIPNSIWNLSSLAAFSCQAKNKLGGMIPTNAFKTLHLLEVVDMGT NRFHGKIPASVANASHLTRLQIDG NLFSGIITSGFGRLRNLTTLYLWR NLFQTREQEDWGFISDLTNCSKLQTLDLGE NNLGGVLPNSFSNLSTSLSFLALDL NKITGSIPKDIGNLIGLQHLYLCN NNFRGSLPSSLGRLRNLGILVAYE NNLSGSIPLAIGNLTELNILLLGT NKFSGWIPYTLSNLTNLLSLGLSHLAPQSGLDTYTSQPHNCVIAFTIPS GSQIPQVKLIQIVQTPIKKMINVSK NTLGG IRYPQEIGHLKNLVEFMQNRID ISK IPNTLGDCQLLRYLYLQN NLLSGSIPSALGQLKGLETLDLSS NNLSGQIPTSLSRYYYASFLEPFFQQLCGGSANHCVLSQMHPGSQSKAMPNSVVEYLIYICLDVVPLLENRKHFPALPISVSLVAALAILSSLYLLITWNKRTKKGAPSRTSMKGHPLVSYPQLVKATDGFAPTNLLGSGSFASVYKRKLENPKALKSFTAECEALRNMRHRNLVKIVTICSSIDNRGNDFKAIVYDFMPNGSLEDWIHPETNDQADQRHLNLHRRVTILLDVACALDYLHRHGPEPVVHCDVKSSNVLLDSDMVAHVGDSGLARILVDGTSLIQQSTSSMGFRGTIGYAAPEYGVGHIASTHGDIYSYGILVLEIVTGKRPTDSTFRPDLGLRQYVELGLHGRVTDVVDTKLILDSENWLNSTNNSPCRRITECIVSLLRLGLSCSQDL*(F)PLSRRHPEISPTNZ*L“N”＝“G”F“N”＝“C”SEQ.ID.No.3ORF 3918(3075bp 被一個內(nèi)含子(843bp)中斷)ATGATATCACTCCCATTATTGCTCTTCGTCCTGTTGTTCTCTGCGCTGCTGCTCTGCCCTTCAAGCAGTGACGACGATGGTGATGCTGCCGGCGACGAACTCGCGCTGCTCTCTTTCAAGTCATCCCTGCTATACCAGGGGGGCCAGTCGCTGGCATCTTGGAACACGTCCGGCCACGGCCAGCACTGCACATGGGTGGGTGTTGTGTGCGGCCGCCGCCGCCGCCGGCACCCACACAGGGTGGTGAAGCTGCTGCTGCGCTCCTCCAACCTGTCCGGGATCATCTCGCCGTCGCTCGGCAACCTGTCCTTCCTCAGGGAGCTGGACCTCGGCGACAACTACCTCTCCGGCGAGATACCACCGGAGCTCAGCCGTCTCAGCAGGCTTCAGCTGCTGGAGCTGAGCGATAACTCCATCCAAGGGAGCATCCCCGCGGCCATTGGAGCATGCACCAAGTTGACATCGCTAGACCTCAGCCACAACCAACTGCGAGGTATGATCCCACGTGAGATTGGTGCCAGCTTGAAACATCTCTCGAATTTGTACCTTTACAAAAATGGTTTGTCAGGAGAGATTCCATCCGCTTTGGGCAATCTCACTAGCCTCCAGGAGTTTGATTTGAGCTTCAACAGATTATCAGGAGCTATACCTTCATCACTGGGGCAGCTCAGCAGTCTATTGACTATGAATTTGGGACAGAACAATCTAAGTGGGATGATCCCCAATTCTATCTGGAACCTTTCGTCTCTAAGAGCGTTTAGTGTCAGAGAAAACAAGCTAGGTGGTATGATCCCTACAAATGCATTCAAAACCCTTCACCTCCTCGAGGTGATAGATATGGGCACTAACCGTTTCCATGGCAAAATCCCTGCCTCAGTTGCTAATGCTTCTCATTTGACAGTGATTCAGATTTATGGCAACTTGTTCAGTGGAATTATCACCTCGGGGTTTGGAAGGTTAAGAAATCTCACAGAACTGTATCTCTGGAGAAATTTGTTTCAAACTAGAGAACAAGATGATTGGGGGTTCATTTCTGACCTAACAAATTGCTCCAAATTACAAACATTGAACTTGGGAGAAAATAACCTGGGGGGAGTTCTTCCTAATTCGTTTTCCAATCTTTCCACTTCGCTTAGTTTTCTTGCACTTGAATTGAATAAGATCACAGGAAGCATTCCGAAGGATATTGGCAATCTTATTGGCTTACAACATCTCTATCTCTGCAACAACAATTTCAGAGGGTCTCTTCCATCATCGTTGGGCAGGCTTAAAAACTTAGGCATTCTACTCGCCTACGAAAACAACTTGAGCGGTTCGATCCCGTTGGCCATAGGAAATCTTACTGAACTTAATATCTTACTGCTCGGCACCAACAAATTCAGTGGTTGGATACCATACACACTCTCAAACCTCACAAACTTGTTGTCATTAGGCCTTTCAACTAATAACCTTAGTGGTCCAATACCCAGTGAATTATTCAATATTCAAACACTATCAATAATGATCAATGTATCAAAAAATAACTTGGAGGGATCAATACCACAAGAAATAGGGCATCTCAAAAATCTAGTAGAATTTCATGCAGAATCGAATAGATTATCAGGTAAAATCCCTAACACGCTTGGTGATTGCCAGCTCTTACGGTATCTTTATCTGCAAAATAATTTGTTATCTGGTAGCATCCCATCAGCCTTGGGTCAGCTGAAAGGTCTCGAAACTCTTGATCTCTCAAGCAACAATTTGTCAGGCCAGATACCCACATCCTTAGCAGATATTACTATGCTTCATTCCTTGAACCTTTCTTTCAACAGCTTTGTGGGGGAAGTGCCAACCATTGGTGCTTTCGCAGCTGCATCCGGGATCTCAATCCAAGGCAATGCCAAACTCTGTGGTGGAATACCTGATCTACATCTGCCTCGATGTTGTCCATTACTAGAGAACAGAAAACATTTCCCAGTTCTACCTATTTCTGTTTCTCTGGCCGCAGCACTGGCCATCCTCTCATCACTCTACTTGCTTATAACCTGGCACAAGAGAACTAAAAAGGGAGCCCCTTCAAGAACTTCCATGAAAGGCCACCCATTGGTCTCTTATTCGCAGTTGGTAAAAGCAACAGATGGTTTCGCGCCGACCAATTTGTTGGGTTCTGGATCATTTGGCTCAGTATACAAAGGAAAGCTTAATATCCAAGATCATGTTGCAGTGAAGGTACTAAAGCTTGAAAATCCTAAGGCGCTCAAGAGTTTCACTGCCGAATGTGAAGCACTACGAAATATGCGACATCGAAATCTTGTCAAGATAGTTACAATTTGCTCGAGCATTGATAACAGAGGGAACGATTTCAAAGCAATTGTGTATGACTTCATGCCCAACGGCAGTCTGGAAGATTGGATACACCCTGAAACAAATGATCAAGCAGACCAGAGGCACTTGAATCTGCATCGAAGAGTGACCATACTACTTGATGTTGCCTGCGCACTGGACTATCTTCACCGCCATGGCCCTGAACCTGTTGTACACTGTGATATTAAATCAAGCAATGTGCTGTTAGATTCTGATATGGTAGCCCATGTTGGAGATTTTGGGCTTGCAAGAATACTTGTTGATGGGACCTCATTGATACAACAGTCAACAAGCTCGATGGGATTTATAGGGACAATTGGCTATGCAGCACCAGGTCAGCAAGTCCTTCCAGTATTTTGCATTTTCTGATCTCTAGTGCTATATGAAATAGTTTTTACCTCTAGTGAAACTGATGGAGAATATAAGTAATTAATTGAACTAATTAAATTGCACAAAAATAAGATTATTTGCCATATCTATTCAGATGCTAAATATAGCTAGTTCATAGAGGTACAGATTTTTTTATATAGGACTCTAGAGCTACCACACACTCAAATCAAATTATGGGTGTTTTCTGCTCTACACTGCAATATGAAATGATTATTACTTCTACATGAACTGATGGAGGAGTTTCAGAAGGATCAAATTTGAGTAAATTTTTTCAATTCTACATTTAAGAAACACTTTTTTTTCATATGCTAGTTACATTTTTTTATTTCACGAGCTTACATTGACCATGAAAAATACTTGGCACTACTTACTAATTCCCACATGGAGGTAGTGAAAATAATATAGATACAAAAACGAAATATCCTATGTTGTGTGATATACTATAATCACAATGAACACAAACAGGATTCGTACAAAAGTAATTAGCCATCATAGCAACTGATTGCTTGGGGTAACTGTATAGCACAATCATACCAAATTTCTTTAGATATGTATCTGTAAATTAGATTCTTAAAGTTAAATATGAAATTTCATTGGTATTTATGTTTCTTTATATAATAAAAATTAATCCAGCCTTTGCATCTATCATTTGTCCAGACATCCTTGTTATTTGTGATATTTAACACGTAAATTTACATAATTATACATCCAAGTTCTTTTTATTTAACACTGTAAATTTCAAATCGTACATGTTATAAAGAATGTACTATATTTCCTGCTCAAACAGAGTATGGCGTTGGGCTCATTGCATCAACGCATGGAGATATTTACAGCTATGGAATTCTAGTGCTGGAAATAGTAACCGGGAAGCGGCCAACTGACAGTACATTCAGACCCGATTTGGGCCTCCGTCAGTACGTTGAACTGGGCCTACATGGCAGAGTGACGGATGTTGTTGACACGAAGCTCATTTTGGATTCTGAGAACTGGCTGAACAGTACAAATAATTCTCCATGTAGAAGAATCACTGAATGCATTGTTTGGCTGCTTAGACTTGGGTTGTCTTGCTCTCAGGAATTGCCATCGAGTAGAACGCCAACCGGAGATATCATCGACGAACTGAATGCCATCAAACAGAATCTCTCCGGATTGTTTCCAGTGTGTGAAGGTGGGAGCCTTGAATTCTGASEQ.ID.No.41025個氨基酸A MISLPLLLFVLLFSALLLCPSSS 23B DDDGDAAGDELALLSFKSSLLYQGGQSLASWN 55TSGHGQHCTWVGVVCGRRRRRHPHR 80C VVK LLLRSSN LSGIISPS 98LGNLSFLRE LDLGDNY LSGEIPPE122LSRLSRLQL LELSDNS IQGSIPAA146IGACTKLTS LDLSHNQ LRGMIPREI 171GASLKHLSN LYLYKNG LSGEIPSA195LGNLTSLQE FDLSFNR LSGAIPSS219LGQLSSLLT MNLGQNN LSGMIPNS243IWNLSSLRA FSVRENK LGGMIPTNA 268FKTLHLLEV IDMGTNR FHGKIPAS292VANASHLTV IQIYGNL FSGIITSG316FGRLRNLTE LYLWRNL FQTREQDDWGFISD 346LTNCSKLQT LNLGENN LGGVLPNSF 371SNLSTSLSF LALELNK ITGSIPKD395IGNLIGLQH LYLCNNN FRGSLPSS419LGRLKNLGI LLAYENN LSGSIPLA443IGNLTELNI LLLGTNK FSGWIPYT467LSNLTNLLS LGLSTNN LSGPIPSE491LFNIQTLSIMINVSKNN LEGSIPQE516IGHLKNLVE FHAESNR LSGKIPNT540LGDCQLLRY LYLQNNL LSGSIPSA564LGQLKGLET LDLSSNN LSGQIPTS588LADITMLHS LNLSFNS FVGEVPT 611IGAFAAASG ISIQGNAKLCGGIP 634D DLHLPRCCPLLENRKH 650E FPVLPISVSLAAALAILSSLYLLITW676F HKRTKK682G GAPSRTSMKGHPLVSYSQLVKATDG 707H FAPTNLLGSGSFGSVYKGKLNIQDHVAVKVLKLENPKALKSFTA 751ECEALRNMRHRNLVKIVTICSSIDNRGNDFKAIVYDFMPNGSLE 795DWIHPETNDQADQRHLNLHRRVTILLDVACALDYLHRHGPEPVV 839HCDIKSSNVLLDSDMVAHVGDFGLARILVDGTSLIQQSTS 879SMGFIGTIGYAAPEYGVGLIASTHGDIYSYGILVLEI 916VTGKRPTDSTFRPDLGLRQYVELGLHGRVTDVVDTKLILDSENW 960LNSTNNSPCRRITECIVWLLRLGLSCSQELPSSRTPTGDIIDEL 1004I NAIKQNLSGLFPVCEGGSLEF 1025SEQ.ID.No.5TCAAGCAACAATTTGTCAGGNCA A/G AT A/C/T CCSEQ.ID.No.6TAACAGCACATTGCTTGATTTNAN G/A TCNCG G/A TGSEQ.ID.No.7TAA CAG CAC ATT GCT TGA TTT NAN (G/A)TC (G/A)CA (G/A)TGSEQ.ID.No.8TAA CAG CAC ATT GCT TGA TTT NAN (G/A)TC (T/C)CT (G/A)TGSEQ.ID.No.9TAAGCAACAATTTGSEQ.ID.No.10TAACAGCACATTGCTTGASEQ.ID.No.11TRK1開放讀碼框(DNA序列)TCGACGTCGAACAATCGCTTGTCTGGTGCACTTCCTAGTGCTATTGGAAACTATTCAGGGCTGAAGAATCTTGTGTTAACTGGAAATGGTTTCTCAGGTGATATCCCTTCTGATATTGGCAGACTAAAGAGCATCTTAAAGCTGGACCTGAGTAGAAACAACTTCTCTGGCACAATCCCTCCTCAGATTGGTAACTGTCTTTCCTTAACTTACTTGGATTTGAGCCAAAATCAACTTTCTGGTCCTATCCCAGTTCAAATTGCTCAAATTCACATCTTAAATTACATCAATATTTCCTGGAATCACTTCAACGAGAGCCTTCCCGCGGAGATTGGCTTGATGAAGAGTTTAACTTCAGCAGATTTTTCCCACAATAACTTATCTGGATCAATACCTGAAACAGGCCAATATTTATATTTCAACTCAACTTCCTTCACCGGCAACCCTTATCTCTCTGGATCCGACTCGACTCCTAGCAACATTACATCCAACTCACCGTCAGAACTTGGAGACGGAAGTGACAGCAGAACTAAGGTTCCTACAATATACAAGTTCATATTTGCATTTGGGCTCTTATTCTGCTCCCTCATTTTCGTTGTCTTAGCAATAATCAAGACAAGAAAGGGGAGTAAGAATTCAAATTTGTGGAAGCTGACAGCATTTCAGAAGCTTGAGTTCGGAAGTGAAGACGTCTTGCAGTGCTTGAAAGACAACAACGTCATAGGGAGAGGTGGAGCAGGGATAGTGTATAAGGGAACTATGCCAAATGGTGATCATGTCGCGGTGAAGAAATTGGGAATAAGCAAAGGCTCACATGATAACGGCCTATCTGCTGAACTTAACACATTAGGGAAGATCAGGCATAGGTACATTGTGAGACTGCTCGCGTTTTGTTCAAACAAGGAAGTCAACTTGCTAGTTTATGAGTACATGCTAAATGGAAGCTTAGGTGAAGTGCTTCATGGGAAGAACGGCGGGCAACTCCAATGGGAAACTAGGCTAAAAATAGCCATAGAAGCTGCCAAGGGCCTTTCTTATTTGCACCACGATTGCTCCCCTATGATAATCCACCGCGATGTCAAGTCCAACAATATATTGTTGAACTCTGAACTTGAAGCTCATGTTGCAGATTTTGGATTAGCCAAGTACTTTCGTAACAATGGTACCTCTGAGTGCATGTCTGCAATTGCAGGATCTTATGGCTACATTGCTCCAGAATATGCATACACGCTGAAAATTGATGAGAAAAGCGATGTGTATAGCTTTGGAGTGGTGTTGTTGGAGCTTATAACAGGACGAAGGCCAGTAGGAAATTTTGGAGAAGAAGGAATGGACATTGTACAATGGGCGAAAACGGAGACAAAATGGAGCAAAGAAGGGGTGGTGAAAATCTTGGATGAGAGGCTAAAAAATGTTGCAATTGTTGAAGCTATGCAAGTATTTTTTGTAGCAATGCTTTGTGTTGAAGAGTACAGCATTGAGAGGCCTACAATGAGGGAAGTAGTCCAAATGCTTTCTCAAGCTAAACAACCAAATACTTTCCAAATCCAATAASEQ.ID.No.12STSNNRLSGALPSAIGNYSGLKNLVLTGNGFSGDIPSDIGRLKSILKLDLSRNNFSGTIPPQIGNCLSLTYLDLSQNQLSGPIPVQIAQIHILNYINISWNHFNESLPAEIGLMKSLTSADFSHNNLSGSIPETGQYLYFNSTSFTGNPYLSGSDSTPSNITSNSPSELGDGSDSRTKVPTIYKFIFAFGLLFCSLIFVVLAIIKTRKGSKNSNLWKLTAFQKLEFGSEDVLQCLKDNNVGRGGAGIVYKGTMPNGDHVARSAGFAAASSRGGIVYKGTMPNGDHVAVKKLGISKGSHDNGLSAELNTLGKIRHRYIVRLLAFCSNKEVNLLVYEYMLNGSLGEVLHGKNGGQLQWETRLKIEAAKGLSYLHHDCSPMIIHRDVKSNNILLNSELEAHVADFGLAKYFRNNGTSECMSAIAGSYGYIAPEYAYTLKIDEKSDVYSFGVVLLELITGRRPVGNFGEEGMDIVQWAKTETKWSKEGVVKILDERLKNVAIVEAMQVFFVAMLCVEEYSIERPTMREVVQMLSQAKQPNTFQIQSEQ.ID.No.13TRL1DNA序列TCAAGCAACAATTTRTCAGGACAAATACCTTCAGGCTTGGCCAATGTGACCACACTGGCAGCATTTAACGTTTCTTTCAATAATCTGTCTGGGCCACTGCCTCTTAACAAAGATTTGATGAAGTGTAATAGTGTTCAGGGAAACCCCTTTCTGCAATCGTGCCATGTATTTTCTCTATCAACACCTTCTACAGATCAGCAGGGAAGAATAGGGGACTCACAAGATTCTGCTGCGTCTCCTTCAGGTTCAACCCAGAAAGGAGGGTGCAGCGGTTTCAACTCCATAGAGATTGCATCCATAACATCTGCGGCAGCTATTGTGTCAGTTCTTCTTGCTCTGATAGTCCTGTTCTTTTACACCAGAAAATGGAATCCAAGATCTAGAGTTGCTGGATCTACCAGGAAAGAAGTCACAGTGTTTACAGAAGTTCCGGTTCCTTTAACATTTGAAAATGTAGTGCGGGCCACAGAGATCTCAAATCAAGCAATGTGCTGTT
權(quán)利要求
1.一種分離的核酸構(gòu)建物，其特征在于，它含有RRK多聚核苷酸序列，該多聚核苷酸與SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.3在嚴(yán)緊條件下雜交。
2.如權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建物，其特征在于，RRK多聚核苷酸序列編碼具有富含亮氨酸重復(fù)片段基序的RRK多肽。
3.如權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建物，其特征在于，RRK多聚核苷酸序列編碼具有胞質(zhì)蛋白激酶結(jié)構(gòu)域的RRK多肽。
4.如權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建物，其特征在于，多聚核苷酸序列是全長的基因。
5.如權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建物，其特征在于，RRK多聚核苷酸序列是Xa21基因，它編碼SEQ.ID.No.2所示的Xa21多肽。
6.如權(quán)利要求5所述的核酸構(gòu)建物，其特征在于，Xa21多聚核苷酸序列編碼SEQ.ID.No.4所示的Xa21多肽。
7.如權(quán)利要求5所述的核酸構(gòu)建物，其特征在于，Xa21多聚核苷酸如SEQ.ID.No.1所示。
8.如權(quán)利要求5所述的核酸構(gòu)建物，其特征在于，Xa21多聚核苷酸如SEQ.ID.No.3所示。
9.如權(quán)利要求1所述的核酸構(gòu)建物，其特征在于，還含有可操作地連于RRK多聚核苷酸序列的啟動子。
10.如權(quán)利要求9所述的核酸構(gòu)建物，其特征在于，啟動子是組織特異型啟動子。
11.如權(quán)利要求9所述的核酸構(gòu)建物，其特征在于，啟動子是組成型啟動子。
12.一種核酸構(gòu)建物，其特征在于，它含有來自RRK基因的啟動子序列，該啟動子序列連于異源的多聚核苷酸序列。
13.如權(quán)利要求12所述的構(gòu)建物，其特征在于，異源多聚核苷酸序列是賦予植物抗病原體抗性的結(jié)構(gòu)基因。
14.如權(quán)利要求12所述的構(gòu)建物，其特征在于，啟動子來自SEQ.ID.No.1。
15.一種轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，它含有重組表達(dá)盒，該表達(dá)盒含有可操作地連于Xa21多聚核苷酸序列的植物啟動子。
16.如權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，植物啟動子是異源啟動子。
17.如權(quán)利要求15所示的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，該植物是水稻。
18.如權(quán)利要求15所示的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，該植物是番茄。
19.如權(quán)利要求15所述的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于，RRK多聚核苷酸序列是Xa21基因，它編碼SEQ.ID.No.2或SEQ.ID.No.4所示的Xa21多肽。
20.如權(quán)利要求19所述的轉(zhuǎn)基因植株，其特征在于，Xa21多聚核苷酸序列如SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.3所示。
21.一種增加植物對黃單胞菌抗性的方法，其特征在于，該方法包括，將重組表達(dá)盒引入植物，該表達(dá)盒含有可操作地連于RRK多聚核苷酸序列的植物啟動子。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，該植物組織來自水稻。
23.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，該植物組織來自番茄。
24.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，該多聚核苷酸序列編碼SEQ.ID.No.2或SEQ.ID.No.4所示的Xa21多肽。
25.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，該多聚核苷酸序列如SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.3所示。
26.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，該啟動子是組織特異型啟動子。
27.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，該啟動子是組成型啟動子。
28.一種在植物中分離RRK序列的方法，其特征在于，該方法包括提供從植物中制備的DNA；將DNA與具有來自SEQ.ID.No.1或SEQ.ID.No.3的序列的引物接觸；和確定擴(kuò)增反應(yīng)是否已發(fā)生。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其特征在于，該DNA是cDNA。
30.一種來自用權(quán)利要求28所述的方法分離出的RRK基因的序列。
31.一種在植物中分離RRK序列的方法，其特征在于，該方法包括提供從植物中制備的DNA；將DNA與具有基于SEQ.ID.No.2或SEQ.ID.No.4的氨基酸序列的序列的引物接觸；和確定擴(kuò)增反應(yīng)是否已發(fā)生。
全文摘要
本發(fā)明提供的核酸可編碼賦予對黃單胞菌屬抗性的多肽。該核酸可用于產(chǎn)生對病原體有抗性的轉(zhuǎn)基因植物。
文檔編號B65D85/88GK1191573SQ96191493
公開日1998年8月26日 申請日期1996年1月17日 優(yōu)先權(quán)日1995年1月17日
發(fā)明者P·C·羅納德, 王國梁, 宋文遠(yuǎn), V·紹博 申請人:加利福尼亞大學(xué)董事會