列中較短者的核巧酸或氨基酸數(shù)目，其中可W根據(jù)Wi化ur和Lipman 算法（Wi化ur和Lipman)確定兩個序列的比對結(jié)果。可W使用VectorNTI軟件包 (Invitrogen, 1600FaradayAve. ,Carlsbad,CA)確定兩個氨基酸序列的序列同一性或序列 相似性或兩個核巧酸序列之間的序列同一性。當(dāng)RNA序列稱作是相似的或與DNA序列具有 某個程度的序列同一性或同源性時，將DNA序列的胸巧（T)視為等同于RNA序列中的尿喀 晚扣）。因此，RNA序列處于本發(fā)明的范圍內(nèi)，并且，通過將DNA序列的胸巧（T)視為等同于 RNA序列中的尿喀晚扣)，可W自DNA序列導(dǎo)出RNA序列。
[0071]IBV
[0072] 本發(fā)明的一個實施方案提供一種表征IBV毒株的過程或方法，所述過程或方法 包括步驟；a)從分離自動物的IBV毒株產(chǎn)生IBVcDNA;b)在實時聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)中 使cDNA暴露于包含正向引物和反向引物的引物對W產(chǎn)生擴增子，其中所述引物對是對IBV 基因組的S1基因特異的；C)在實時PCR后立即對包含擴增子的雙鏈產(chǎn)物進行高分辨烙解 (HRM)曲線分析；并且d)分析并比較HRM曲線，從而表征IBV毒株。
[007引可W通過將已知IBV毒株的S1基因的多核巧酸序列比對并比較S1基因的保守 區(qū)，選擇正向引物和反向引物。在實施方案的一個方面，正向引物具有如SEQIDN0:29中 所示的多核巧酸序列并且反向引物具有如SEQIDN0:30中所示的多核巧酸序列。
[0074]S1基因稱作纖突（巧糖蛋白。S1亞基攜帶血清型特異性序列和誘導(dǎo)病毒中和抗 體的抗原表位。認為不同的IBV血清型、亞型或變體由造成接種雞群中IB暴發(fā)的S1基因 核巧酸點突變、插入、缺失或重組生成狂hou等人，J.VetMed.B51，147-152, 2004)。常使用 S1糖蛋白的核巧酸測序W確定IBV毒株之間的血清型差異（Kwon等人，AvianDis. 1993)。 [00巧]可W根據(jù)制造商的說明書進行HRM曲線分析。例如，幾家制造商提供用于高分 辨率DNA烙解分析的儀器，如AppliedBiosystems(ABI)、Bio-Rad、Ce地eid、Corbett、 Elppendorf、Id址oTechnology、Roche和Stratagene。此外，存在還用于實施測定法的 市場上可獲得的幾種飽和染料，如LCGreen(i^ (Id址0TechnologyInc. )、Syto9@ (Invitrogen,Carlsbad,CA)、EvaGreen'盛炬io化rn)和LightCycler瓜 480ResoLi曲t Dye(Roche,Indianapolis,IN)(VossenRHAM等人，HumanMutation30 巧），2009)。
[0076] 可W使用W下參數(shù)實施實時PCR;a)在95°C初始變性3秒，b)在95°C變性1分鐘， C)在55°C復(fù)性1分鐘，d)在72°C延伸1分鐘，和e)重復(fù)步驟b)-d)45次，隨后解鏈曲線分 析（連續(xù)地95°C1秒，65°C15秒和95°C)并且在45°C冷卻30秒。
[0077] 本發(fā)明的方法可W用來表征并區(qū)分已知的IBV毒株。已知的IBV毒株包括但不限 于 793/B株、Massachusetts株、QX樣株、IBNC90 株、D274 株、Iowa株、Arkansas株、Holland 52 株、Connecti州t46 株、BeaudetteUS株、California株、Jilin株、Holte株、HK株、D41 株、DE072株、西班牙/92/35株、埃及/F/03株和全世界存在的其他毒株。
[007引本發(fā)明也提供新IBV毒株的鑒定，其中IBV序列不W緊密同源性與一個或多個IBV序列的任一者對齊。該方法包括步驟；a)從分離自動物的IBV毒株產(chǎn)生IBVcDNA;b)在實 時聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)中使cDNA暴露于包含正向引物和反向引物的引物對W產(chǎn)生擴增子， 其中所述引物對是對IBV基因組的S1基因特異的；C)在實時PCR后立即對包含擴增子的 雙鏈產(chǎn)物進行高分辨烙解化RM)曲線分析；d)分析并比較HRM曲線，并且e)鑒定新IBV毒 株。如此通過HRM曲線分析鑒定的新IBV毒株可W通過W下方式進一步表征；對擴增子測 序并將IBV擴增子序列與已知IBV序列比對。新IBV毒株可W與任何已知的IBV序列具有 約 50%、約 60%、約 70%、約 75%、約 80%、約 85%、約 90%、約 91 %、約 92%、約 93%、約 94%、約95 %、約96 %、約97 %、約98 %或約99 %序列同一性。序列可W是核巧酸序列或氨 基酸序列（擴增子序列的翻譯）。
[0079] 該方法的實施方案的另一個方面提供一種用于區(qū)分感染動物和接種值IVA)動物 的手段。該方法包括步驟；a)從動物分離的IBV毒株產(chǎn)生IBVcDNA;b)在實時聚合酶鏈反 應(yīng)（PCR)中使cDNA暴露于包含正向引物和反向引物的引物對W產(chǎn)生擴增子，其中所述引物 對是對IBV基因組的S1基因特異的；C)在實時PCR后立即對包含擴增子的雙鏈產(chǎn)物進行 高分辨烙解（HRM)曲線分析；和d)分析并比較HRM曲線，因而確定所述cDNA是否來自疫苗 型毒株或感染動物的毒株。
[0080] 本發(fā)明的一個實施方案提供分離的多核巧酸或引物，所述分離的多核巧酸或引物 具有如SEQIDNO:29或SEQIDNO:30中所述的序列。
[0081] 本發(fā)明的另一個實施方案提供一種用于檢測IBV毒株的試劑盒，所述試劑盒包 含；a)引物對，其包含具有如SEQIDNO: 29中所示序列的正向引物和具有如SEQIDNO: 30 中所示序列的反向引物；和b)描述進行實時PCR的參數(shù)和條件的說明書。
[0082]CSFV
[0083] 本發(fā)明的一個實施方案提供一種表征CSFV毒株的過程或方法，所述過程或方法 包括步驟；a)從分離自動物的CSFV毒株產(chǎn)生CSFVcDNA;b)在實時聚合酶鏈反應(yīng)（PCR) 中使cDNA暴露于包含正向引物和反向引物的引物對W產(chǎn)生擴增子，其中所述引物對是對 CSFV基因組的NS5B或3'NTR區(qū)特異的；C)在實時PCR后立即對包含擴增子的雙鏈產(chǎn)物進 行高分辨烙解（HRM)曲線分析；和d)分析并比較HRM曲線，從而表征CSFV毒株。
[0084] 可W通過將已知CSFV毒株的NS5B區(qū)或3'NTR區(qū)的多核巧酸序列對齊并比較NS5B 區(qū)或3'NTR區(qū)的保守區(qū)，選擇正向引物和反向引物。在實施方案的一個方面，正向引物具有 如SEQIDN0:8中所示的多核巧酸序列并且反向引物具有如SEQIDN0:9中所示的多核巧 酸序列。
[0085]NS5B是RNA依賴性RNA聚合酶基因。3'NTR區(qū)是病毒基因組的3'非翻譯區(qū)。先 前研究已經(jīng)顯示（Pan等人，JVetDiagInv，2008)在野生型CSFV中不存在的在疫苗型 CSFV3'NTR中的明顯T豐富插入位點使得該兩種基因成為區(qū)分野生型株和疫苗株的合適 遺傳標(biāo)記。
[0086] 可W根據(jù)制造商的說明書進行HRM曲線分析。
[0087] 可W使用W下參數(shù)實施實時PCR;a)在95°C初始變性3秒，b)在95°C變性1分鐘， c)在55°C復(fù)性1分鐘，d)在72°C延伸1分鐘，和e)重復(fù)步驟b)-d)45次，隨后解鏈曲線分 析（連續(xù)地95°C1秒，65°C15秒和95°C)并且在45°C冷卻30秒。
[008引本發(fā)明的方法可W用來表征并區(qū)分已知的CSFV毒株。已知的CSFV毒株包括但不 限于ALD株、中國株（C株）、GPE株（日本株）、C/HVRI株（來自中國，基因型1. 1)、化ems 株（來自中國）、Alfo;rt187 株、Ames株、Margarita株、Baker株、紐約株、Purdue115 株、 Paderborn株、Spreda株、Oregon株、Singer株、Osloss株、Moredun株、Rrijters株和可 W在文獻中找到的其他毒株。
[0089] 本發(fā)明也提供新CSFV毒株的鑒定，其中CSFV序列不W緊密同源性與一個或多個 CSFV序列的任一者對齊。該方法包括步驟；a)從分離自動物的CSFV毒株產(chǎn)生CSFVcDNA; b)在實時聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)中使cDNA暴露于包含正向引物和反向引物的引物對W產(chǎn)生 擴增子，其中所述引物對是對CSFV基因組的NS5B或3'NTR區(qū)特異的；C)在實時PCR后立 即對包含擴增子的雙鏈產(chǎn)物進行高分辨烙解（HRM)曲線分析；d)分析并比較HRM曲線，并 且e)鑒定新CSFV毒株。如此通過HRM曲線分析鑒定的新CSFV毒株可W通過W下方式進 一步表征；對擴增子測序并將CSFV擴增子序列與已知CSFV序列比對。新CSFV毒株可W與 任何已知的CSFV序列具有約50%、約60%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約 91 %、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%序列同一性。序 列可W是核巧酸序列或氨基酸序列（擴增子序列的翻譯）。
[0090] 該方法的實施方案的另一個方面提供一種用于區(qū)分感染動物和接種值IVA)動物 的手段。該方法包括步驟；a)從分離自動物的CSFV毒株產(chǎn)生CSFVcDNA;b)在實時聚合酶 鏈反應(yīng)（PCR)中使cDNA暴露于包含正向引物和反向引物的引物對W產(chǎn)生擴增子，其中所述 弓I物對是對CSFV基因組的NS5B或3'NTR區(qū)特異的；C)在實時PCR后立即對包含擴增子的 雙鏈產(chǎn)物進行高分辨烙解（HRM)曲線分析；和d)分析并比較HRM曲線，因而確定所述cDNA 是否來自疫苗株或感染動物的毒株。
[0091] 本發(fā)明的一個實施方案提供分離的多核巧酸，所述分離的多核巧酸具有如SEQID N0:8或SEQIDN0:9中所述的序列。
[0092] 本發(fā)明的另一個實施方案提供一種用于檢測CSFV毒株的試劑盒，所述試劑盒包 含；a)引物對，其包含具有如SEQIDNO: 8中所示序列的正向引物和具有如SEQIDNO: 9中 所示序列的反向引物；和b)描述進行實時PCR的參數(shù)和條件的說明書。
[0093]NDV
[0094] 本發(fā)明的一個實施方案提供一種表征NDV毒株的過程或方法，所述過程或方法包 括步驟；a)從分離自動物的NDV毒株產(chǎn)生NDVcDNA;b)在實時聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)中使 cDNA暴露于包含正向引物和反向引物的引物對W產(chǎn)生擴增子，其中所述引物對是對NDV基 因組的F、NP、P、M、HN或L基因特異的；C)在實時PCR后立即對包含擴增子的雙鏈產(chǎn)物進 行高分辨烙解（HRM)曲線分析；和d)分析并比較HRM曲線，從而表征NDV毒株。
[009引可W通過將已知NDV毒株的F基因、或NP基因、或P基因、或M基因、或HN基因、 或L基因的多核巧酸序列分別對齊并比較F基因、或NP基因、或P基因、或M基因、或HN基 因、或L基因的保守區(qū)，選擇正向引物和反向引物。在實施方案的一個方面，正向引物具有 如SEQIDNO: 17或31中所示的多核巧酸序列并且反向引物具有如SEQIDNO: 18或32中 所示的多核巧酸序列。
[0096] 融合（巧蛋白負責(zé)介導(dǎo)病毒包膜與細胞膜的融合，血凝素-神經(jīng)氨酸酶（HN)蛋白 參與細胞接合和釋放（Phi1lips等人，Arch.Virol, 143:1993-2002, 1998;Tan等人，Arch. Virol, 155:63-70, 2010)。NDV毒株劃分成3個基因型，高度強毒（強毒）、中等毒力（中 等毒）或無毒力（弱毒）。傳統(tǒng)上，最常見地通過測序和氨基酸序列分析區(qū)分NDV基因型。 強毒株和中等毒力株的F蛋白切割位點的共有序列是112(R/K)RQ(R/K)RF117 ;弱毒F切割 位點的共有序列是112佑/E)(K/R)Q佑/巧化117。最新研究結(jié)果報道了（SamalS等人，J. Gen.Virol. 2011)，F(xiàn)切割位點的位置114處谷氨酷胺變成堿性殘基精氨酸（時降低病毒復(fù) 制并減弱病毒致病性。該論文還報道，當(dāng)位置118處的異亮氨酸（I)由鄉(xiāng)氨酸置換時，致病 性進一步減少。
[0097] 可W根據(jù)制造商的說明書進行HRM曲線分析。
[009引可W使用W下參數(shù)實施實時PCR;a)在95°C初始變性3秒，b)在95°C變性1分鐘，C)在60°C復(fù)性1分鐘，d)在72°C延伸1分鐘，和e)重復(fù)步驟b)-d)45次，隨后解鏈曲線分 析（連續(xù)地95°C1秒，65°C15秒和95°C)并且在45°C冷卻30秒。
[0099] 本發(fā)明的方法可W用來表征并區(qū)分已知的NDV毒株。已知的NDV毒株包括但不 限于Avinew株、LaSota株、MVP-Mukteswar株、ND-B1 株、韓國Dalguban株、He;rts33 株、 Essex，70 株、135/93 株、617/83 株、34/90 株、BeaudetteC株、D26 株、MC110 株、1154/98 株和可W在文獻中記錄的其他毒株。
[0100] 本發(fā)明也提供新NDV毒株的鑒定，其中NDV序列不W緊密同源性與一個或多個NDV 序列的任一者對齊。該方法包括步驟；a)從分離自動物的NDV毒株產(chǎn)生NDVcDM;b)在 實時聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)中使cDNA暴露于包含正向引物和反向引物的引物對W產(chǎn)生擴增 子，其中所述引物對是對NDV基因組的F、NP、P、M、HN或L基因特異的；c)在實時PCR后立 即對包含擴增子的雙鏈產(chǎn)物進行高分辨烙解（HRM)曲線分析；d)分析并比較HRM曲線；并 且e)鑒定新NDV毒株。如此通過HRM曲線分析鑒定的新NDV毒株可W通過W下方式進一 步表征：對擴增子測序并將NDV擴增子序列與已知NDV序列比對。新NDV毒株可W與任何 已知的NDV序列具有小于50%、小于60%、小于70%、小于75%、小于80%、小于85%、小 于90%、小于91 %、小于92%、小于93%、小于94%、小于95%、小于96%、小于97%、小于 98%、或小于的99%序列同一性。序列可W是核巧酸序列。序列也可W是氨基酸序列（擴 增子序列的翻譯）。