專利名稱：廢水生物處理系統(tǒng)中基于pcr的監(jiān)測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在用于廢水的生物處理系統(tǒng)中對(duì)微生物的基于PCR的監(jiān)測(cè)。特別地，本發(fā)明涉及指示/效應(yīng)基因或者基因組合的豐度和表達(dá)的測(cè)定，其中“效應(yīng)”基因的表達(dá)相關(guān)于某種特定的微生物樣品的降解活性，“指示”基因的豐度相關(guān)于微生物的豐度。效應(yīng)基因的表達(dá)通過定量RT-PCR進(jìn)行測(cè)定，而指示基因豐度通過定量PCR進(jìn)行測(cè)定。該指示和效應(yīng)基因可以是相同或者不同的基因。
盡管草甘膦氧化還原酶(gox)基因(US5463175，US577760)在基于活性污泥的系統(tǒng)中的表達(dá)被用于例示這樣的基于PCR的監(jiān)測(cè)，本發(fā)明的實(shí)施方案可以被廣泛地通過任意的指示/效應(yīng)基因組合并且在任意的系統(tǒng)中進(jìn)行應(yīng)用，該系統(tǒng)利用微生物的分解代謝活性進(jìn)行廢水的生物處理。本發(fā)明還涉及一些方法，這些方法用于廢水處理系統(tǒng)的主動(dòng)控制，該控制基于來自于所述基于PCR的監(jiān)測(cè)所產(chǎn)生的信息而進(jìn)行。
背景技術(shù)：
有機(jī)廢物的生物處理被用作為一種修飾生態(tài)系統(tǒng)的手段已有幾個(gè)世紀(jì)。例如，自農(nóng)業(yè)產(chǎn)生伊始，堆肥就被用于從有機(jī)廢物中產(chǎn)生土壤改善物質(zhì)并且增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)物的循環(huán)。在本世紀(jì)中，廢水的生物處理已經(jīng)被用作為一種清除有機(jī)物質(zhì)的方法(US5540840)，該方法還可以輔助通過其它多種方法進(jìn)行的廢物回收(US5792650)。
多數(shù)現(xiàn)存的廢水處理廠建立于數(shù)十年前，那時(shí)候的水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(例如，基于生物氧需求(BOD)和化學(xué)氧需求(COD)的標(biāo)準(zhǔn))較不嚴(yán)格。進(jìn)一步，這些廢水處理廠通常依賴于活性污泥的加工過程，該過程作為廢水生物處理的核心組成。盡管已經(jīng)存在僅僅使用物理化學(xué)方法來進(jìn)行水回收的處理系統(tǒng)(US4851131)，基于活性污泥的系統(tǒng)仍是標(biāo)準(zhǔn)，特別是對(duì)于需氧的廢水處理系統(tǒng)(Hallas，Laurence E.and MichaelA.Heikamp，1995.″Microbiological treatment of chemicalprocess wastewater.″InYoung，Lily Y.and Carl E.Cerniglia(eds)Microbial Iransformation and Degradation of ToxicOrganic Chemical，New YorkWiley-Liss，pp.349-387)。
盡管在廢水處理系統(tǒng)的成分單位加工(component unitprocess)上已經(jīng)有所進(jìn)展，但是將這些進(jìn)展轉(zhuǎn)化成為與之一致的高質(zhì)量的流出物的實(shí)現(xiàn)仍受阻于對(duì)監(jiān)測(cè)過程的依賴的需求，該監(jiān)測(cè)過程在控制過程中僅允許緩慢的或者被動(dòng)的調(diào)整。然而，對(duì)于某些狹隘限定的情形，監(jiān)測(cè)技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到對(duì)廢水生物處理系統(tǒng)中的單位加工進(jìn)行近于實(shí)時(shí)的控制。例如，NADH熒光和pH信號(hào)可被用于對(duì)碳營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)向無氧反應(yīng)器中的填入速率進(jìn)行最優(yōu)化(US6106718)，或者，另一個(gè)例子中，報(bào)道細(xì)菌表達(dá)某種編碼生物發(fā)光報(bào)道蛋白的基因的水平可就其同殺菌毒性在廢水處理流中的存在與否的關(guān)聯(lián)進(jìn)行光學(xué)監(jiān)測(cè)(US6110661)。
用于監(jiān)測(cè)調(diào)節(jié)廢水處理流中的目標(biāo)成分的微生物降解的蛋白的編碼基因的豐度和表達(dá)的技術(shù)總體上是缺乏的。用于通過該監(jiān)測(cè)所產(chǎn)生的信息來對(duì)廢水生物處理系統(tǒng)進(jìn)行知情的主動(dòng)控制的方法也是缺乏的。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的這些以及其它的缺陷，并且滿足了對(duì)關(guān)鍵性微生物基因的豐度和表達(dá)進(jìn)行監(jiān)測(cè)的技術(shù)的長(zhǎng)期需求，從而允許了廢水生物控制系統(tǒng)的主動(dòng)控制。
無論是對(duì)于生活廢水或者工業(yè)廢水，廢水處理一般作為一組處理而進(jìn)行，該組可被分為三個(gè)常規(guī)水平初級(jí)、次級(jí)和三級(jí)。初級(jí)處理在典型情況下涉及大量懸浮固體從廢水樣品中的清除。用于初級(jí)處理的主要技術(shù)為沉淀。在沉淀期間，可沉降的固體從未處理廢水中被除去。對(duì)于具有低至中等懸浮固體成分的有機(jī)工業(yè)排放物，如果該廢水的有機(jī)物質(zhì)含量或者水流速率隨時(shí)間發(fā)生明顯變化就可能會(huì)需要通過一種平衡池。
次級(jí)處理通?？杀灰暈樵谛再|(zhì)上為生物除污處理。次級(jí)處理通常由對(duì)在初級(jí)處理后存留的有機(jī)固體進(jìn)行的生物氧化組成。在對(duì)初級(jí)處理的流出物進(jìn)行的次級(jí)處理中常用的技術(shù)依賴于懸浮生長(zhǎng)的生物處理，并且特別依賴于活性污泥法。盡管次級(jí)處理系統(tǒng)及它們的成分單位操作和方法近幾十年來已經(jīng)成為關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)展之所在，在監(jiān)測(cè)方法上的限制通常阻礙了主動(dòng)控制方法在許多次級(jí)處理系統(tǒng)中的實(shí)施。
典型情況下需氧次級(jí)處理和通常情況下的三級(jí)處理在生物反應(yīng)器系統(tǒng)中進(jìn)行。這些系統(tǒng)分為兩大類——需氧懸浮生長(zhǎng)和附著生長(zhǎng)系統(tǒng)。在兩種情況下的原理是相同的使微生物物質(zhì)接觸于(i)作為能源的有機(jī)化合物，(ii)電子受體(例如氧或者硝酸鹽)，以及(iii)用于微生物生長(zhǎng)的適當(dāng)營(yíng)養(yǎng)物。當(dāng)有機(jī)成分被降解時(shí)必須提供一種用于從增長(zhǎng)中的生物物質(zhì)中分離被處理的液體的設(shè)備。
在需氧系統(tǒng)中，連續(xù)流動(dòng)活性污泥技術(shù)已經(jīng)成為了次級(jí)處理的主要技術(shù)。在連續(xù)流動(dòng)活性污泥系統(tǒng)中，如

圖1所示，廢水首先在通氣池50中同微生物混合并且通氣一段限定的時(shí)間。第二個(gè)池，即凈化池60，為水從沉降入活性污泥墊65的生物物質(zhì)分離(即，凈化)提供了顯著降低的有機(jī)物(某些情況下為無機(jī)物)含量。
盡管通過了充分測(cè)試的次級(jí)處理過程，但是次級(jí)處理系統(tǒng)中的水排出物還可能達(dá)不到水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。在這些水排出物中的懸浮固體、營(yíng)養(yǎng)物或者特別調(diào)節(jié)的化合物水平可能是無法接受的。在這樣的情況下需要三級(jí)處理。三級(jí)處理選項(xiàng)包括額外的化學(xué)處理(例如，活性碳過濾、臭氧化作用、凝聚、氣提以及離子交換法)和/或生物處理(例如，以活性碳或者藻酸鹽中的微生物對(duì)成分進(jìn)行高純度水處理(polish))。
正如預(yù)料，連續(xù)流動(dòng)活性污泥方法在機(jī)制上已被熟知。關(guān)鍵性的操作變量被用于對(duì)系統(tǒng)進(jìn)行成功的設(shè)計(jì)和操作。例如，在初始廢水鑒定之后進(jìn)行反應(yīng)器取樣，以便于限定操作系統(tǒng)的有機(jī)加載物(食物/微生物或者F/M比例)。另外，通氣和輸氧的速率被確定并且經(jīng)調(diào)整以獲得所需的廢水處理水平。最后還進(jìn)行了對(duì)凈化速率以及微生物(以及隨后的生物物質(zhì)廢料)生長(zhǎng)速率的類似確定和調(diào)整。成分單位加工的多種擴(kuò)充也可被用于改善連續(xù)流動(dòng)活性污泥系統(tǒng)。例如，向通氣池內(nèi)加入活性碳已經(jīng)在對(duì)稀釋但可變的廢水的處理中提供了一種成功的改變。
在廢水生物處理系統(tǒng)中需要監(jiān)測(cè)方法對(duì)處理流的參數(shù)進(jìn)行檢測(cè)并且將其維持在最優(yōu)范圍之內(nèi)，或者至少阻止這些系統(tǒng)操作中的巨大干擾并且避免超過水質(zhì)限制。除微生物的多樣性外，廢水生物處理系統(tǒng)中所測(cè)量的過程控制參數(shù)還有恒定的固體水平、F/M比例、平均細(xì)胞存留時(shí)間(MCRT)、沉積速率和污泥體積指數(shù)，以及攝氧速率(OUR)和特異性攝氧速率。
這種類型的信息有助于決定需要進(jìn)行什么樣的調(diào)整，例如，引導(dǎo)返回的活性污泥流以及廢活性污泥流(分別見于圖1的67和69；又見于Wastewater EngineeringTreatment，Disposal，andReuse(McGraw-Hill Series in Water Resources and EnvironmentalEngineering，1991)，George Tchobanoglous，F(xiàn)ranklin L.Bruton，and Metcalf & Eddy，Inc.Staff)。
生物氧需求(BOD)是在一升水中的所有有機(jī)物質(zhì)被微生物所氧化的情況下將消耗的氧的量。在測(cè)定5天BOD(BOD5)的基本方法中，從一個(gè)測(cè)試池中取出等體積的兩份水并將每一份以已知體積的蒸餾水進(jìn)行稀釋，該水進(jìn)行徹底地振蕩以確保氧飽和。隨后使用氧測(cè)量計(jì)測(cè)定一份水中的氧濃度，而剩下的那一份被密封并且置于完全的黑暗中。5天之后，使用氧測(cè)量計(jì)測(cè)定在第二份中的氧含量。BOD5通過從第一次測(cè)定值中減去第二次的值而確定。
需氧化的有機(jī)物質(zhì)的相對(duì)量越高，在廢水生物處理系統(tǒng)中的微生物用于氧化該量的有機(jī)物所需的氧氣的相對(duì)量就越多。進(jìn)一步，該微生物來源和樣品微生物對(duì)被用作為BOD5測(cè)定的底物的廢物成分的適應(yīng)程度顯著影響B(tài)OD5。作為這些相關(guān)關(guān)系的結(jié)果，BOD5可被用于測(cè)定對(duì)于特定物質(zhì)的廢水生物處理效率。例如，在特定類型的廢水中的甲醛可被多種活性污泥進(jìn)行生物氧化并且因此可用BOD5檢測(cè)。但是，如果在活性污泥中沒有表達(dá)gox的微生物，那么可能無法用BOD5對(duì)來自于相同的廢水的草甘膦(即，N-膦酰甲基甘氨酸)以及N-膦酰甲基亞氨基二乙酸(PIA)的降解進(jìn)行檢測(cè)。
在替代的情況下，氧需求可以使用化學(xué)氧化劑進(jìn)行測(cè)定。這稱為化學(xué)氧需求(COD)。COD可以表示為對(duì)一升廢水中的有機(jī)污染物進(jìn)行化學(xué)氧化所需的氧毫克數(shù)。COD值通常高于BOD值。生活廢水的典型的COD值為200到500mg/L。COD提供了理論氧需求的指數(shù)并且通常被用于代替BOD，特別是因?yàn)镃OD的測(cè)定可在僅僅數(shù)小時(shí)后完成，而標(biāo)準(zhǔn)的BOD5測(cè)定需要5天。
許多年以來已經(jīng)將測(cè)定廢水中的總有機(jī)碳(TOC)水平用作估計(jì)污染水平的方法。可以使用幾種方法測(cè)量廢水TOC，但所有方法一般都是測(cè)量水樣品的有機(jī)碳含量。生活廢水的典型TOC值為100-300mg/L。
平均細(xì)胞存留時(shí)間(MCRT)是微生物保持在處理過程(如連續(xù)流動(dòng)活性污泥過程)中的平均時(shí)間長(zhǎng)度，其中考慮了微生物的清除(如，通過污泥消耗)。MCRT也可以表達(dá)為固體存留時(shí)間或污泥年齡。例如，如果平均需要五天時(shí)間清除等于一般在系統(tǒng)中保持的污泥量，污泥微生物將在該系統(tǒng)所含的污泥中平均存留五天。因此，用于該處理過程的污泥年齡將為五天。對(duì)于一個(gè)通過常規(guī)的活性污泥過程處理生活廢水的處理廠，典型范圍的MCRT應(yīng)為五到十五天。對(duì)于處理工業(yè)廢水的處理廠，典型的范圍應(yīng)為三十到一百天。
在處理系統(tǒng)中的微生物多樣性特征隨著環(huán)境條件而變化，該條件包括溶解的氧濃度和水力存留時(shí)間(HRT)。HRT指的是一個(gè)生物處理系統(tǒng)的水相或者液相在該系統(tǒng)中存留的平均時(shí)間。一些系統(tǒng)的MCRT和HRT可能差異明顯，例如使用了固定化細(xì)菌技術(shù)的系統(tǒng)。完全混合活性污泥系統(tǒng)為MCRT和HRT的差異提供了另一個(gè)例子。應(yīng)用了完全混合活性污泥系統(tǒng)的工業(yè)生物系統(tǒng)常常具有2-7天的HRT，但是其MCRT為30到80天。
但是，在多數(shù)系統(tǒng)中，隨著HRT的提高，更多的底物有機(jī)物質(zhì)被吸著(即，被吸收和吸附)，并且被微生物所生物降解。因此，底物有機(jī)物質(zhì)與微生物生物物質(zhì)的比值降低了，這可以顯著改變?cè)撐⑸锶郝涞慕Y(jié)構(gòu)。
混合液中的揮發(fā)性懸浮固體(MLVSS)包括活體以及非活體有機(jī)物質(zhì)，代表生物物質(zhì)的量的粗略近似值?；旌弦褐械膽腋」腆w(MLSS)還包括無機(jī)固體，并且由此是生物量的更為粗略的近似值。在典型的情況下□MLVSS為MLSS的70到80％。
F/M比例在維持生物處理系統(tǒng)中也是重要的。因?yàn)锽OD(或者COD)乘以流入物(或者流出物)流速是分子F的估測(cè)值，MLVSS是分母F的估測(cè)值，BOD(或者COD)乘以每單位MLVSS的流入物(或者流出物)流速提供了F/M比例的一種估測(cè)值。
盡管這些參數(shù)已經(jīng)被成功地用于監(jiān)測(cè)生物廢水處理系統(tǒng)，但是它們受到一些缺陷的困擾。特別地，MLVSS的測(cè)量?jī)H僅是總生物含量的一個(gè)近似值并且該測(cè)定值還進(jìn)一步包括了該活性污泥中的所有生物體。這些生物體通常多種多樣，并且可能包括細(xì)菌、原生動(dòng)物、輪蟲、真菌和線蟲，以及藻類和昆蟲幼蟲。另外，該MLVSS測(cè)定并不能將存活和非存活微生物加以區(qū)分。
對(duì)于給定的MLVSS值來監(jiān)測(cè)微生物活性的主要方法是進(jìn)行非特異攝氧速率(OUR)分析。但是，這樣的分析反應(yīng)了對(duì)廢水樣品中的多種成分的微生物降解活性而非對(duì)某種單一成分，例如對(duì)草甘膦的降解活性。攝氧速率還受到更易降解的成分是否存在于廢水樣品中的明顯影響。
微生物群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化同廢水生物處理系統(tǒng)的性能是緊密相關(guān)的。因此，精確測(cè)定負(fù)責(zé)特定生物學(xué)過程的微生物的有效方法在水再生中具有相當(dāng)大的益處，這是因?yàn)樗蛇M(jìn)行對(duì)廢水生物處理系統(tǒng)的更精細(xì)監(jiān)測(cè)和控制。以一種不依賴于細(xì)胞培養(yǎng)方法的方式對(duì)細(xì)菌和其它微生物群落的結(jié)構(gòu)進(jìn)行監(jiān)測(cè)是特別理想的，這種不依賴于細(xì)胞培養(yǎng)方法的方式目的在于不僅測(cè)定負(fù)責(zé)某種特別調(diào)節(jié)的化合物的降解的微生物類型，而且還測(cè)定這些微生物的豐度和活性。
基于PCR的方法(US4683202和引用它的US專利)已經(jīng)可用于對(duì)來自參與異生素化合物降解的微生物的基因進(jìn)行檢測(cè)。例如，進(jìn)行DNA提取后繼之以PCR，已經(jīng)被用于檢測(cè)一些微生物的基因，這些微生物在對(duì)污染沉積物中的多氯化聯(lián)苯基有機(jī)物的降解(Erb et al.，1993，Appl.Environ.Microbiol.594065-4073)和萘的降解(Herricket al.，1993，Appl.Environ.Microbiol.69697-694)中很重要，被檢測(cè)的其它基因還包括，在經(jīng)石油烴污染的地下水中檢測(cè)兒茶酚2，3-二加氧酶基因(Joshi and Walia，1996，F(xiàn)EMS Microbiol.Ecol.195-15)和變兒茶酚酶同源基因(Joshi and Walia，1996，J.Microbiol.Methods 27121-128)。
基于PCR的方法已經(jīng)被用于不僅檢測(cè)，而且定量估測(cè)降解4-氯聯(lián)苯基有機(jī)物的土壤細(xì)菌(Durocq et al.，1999，Appl.Soil.Ecol.1215-27)以及未經(jīng)培養(yǎng)的菌株(Lee et al.，1996，Appl.Environ.Microbiol.623787-3793)。定量PCR方法(qPCR)，尤其是競(jìng)爭(zhēng)性qPCR(US5213961以及引用其的美國(guó)專利)已經(jīng)被用于對(duì)在適應(yīng)苯酚的活性污泥中的細(xì)菌群體多樣性的波動(dòng)進(jìn)行跟蹤(Watarabe et al.，1999，Appl.Environ.Microbiol.652813-2819)。Mesarch等人(2000，Appl.Environ.Microbiol.66678-683)開發(fā)出特異于假單胞菌某些菌株的兒茶酚2，3-二加氧酶基因的引物，從而使競(jìng)爭(zhēng)性qPCR可被用于直接的不基于培養(yǎng)的工藝，以進(jìn)行土壤樣品中微生物群的計(jì)數(shù)。
Watanable等人(2000，Appl.Environ.Microbiol.663905-3910)還使用基于qPCR的方法來估測(cè)存在于活性污泥中的Ralstonia eutropha E2細(xì)菌的密度。除使用qPCR，以pox基因特異性引物來估測(cè)存在于活性污泥中的Ralstonia eutropha E2細(xì)菌的密度之外，Watanable等人(2000)還使用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)方法在活性污泥中檢測(cè)這些細(xì)菌對(duì)該pox基因的表達(dá)，但并非對(duì)其進(jìn)行定量。通過pox基因表達(dá)，Ralstonia eutropha E2細(xì)菌能夠在含有苯酚作為全部碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。Watanable在qPCR和非定量的RT-PCR中設(shè)計(jì)并使用相同的pox基因特異性DNA引物。Dionisi等人(2002)近來使用基于qPCR的方法對(duì)來自于城市活性污泥和工業(yè)活性污泥的氨氧化和亞硝酸鹽氧化性細(xì)菌進(jìn)行計(jì)數(shù)(Dionisi，H.M.et al.，2000 Appl and Environ Microbiol，Vol.68(1)245-253)。然而，未曾有過測(cè)定特異的硝化細(xì)菌群的活性的嘗試。
盡管基于PCR的方法已被證明具有鑒定在廢水生物處理系統(tǒng)的活性污泥中表達(dá)的基因的用途，但仍需要精準(zhǔn)地對(duì)這些基因的相對(duì)豐度和相對(duì)表達(dá)水平這兩者進(jìn)行定量的監(jiān)測(cè)方法。進(jìn)一步，廢水生物處理系統(tǒng)需要將來自于該監(jiān)測(cè)方法的豐度和表達(dá)水平值轉(zhuǎn)換成為最優(yōu)控制參數(shù)的操作程序。換句話說，所需的是以接近于實(shí)時(shí)的方式對(duì)指示/效應(yīng)基因組合的豐度和表達(dá)這兩者進(jìn)行精準(zhǔn)監(jiān)測(cè)的廢水鑒定方法，以及使用這些豐度和表達(dá)測(cè)定值來主動(dòng)地控制廢水處理系統(tǒng)，從而達(dá)到最優(yōu)水再生的方法。年復(fù)一年，對(duì)這樣的方法(以及用于該方法的組合物)的需求變得更為顯著。
發(fā)明概述ABC-活性生物除污物含量(active bioremedial content)，直接正比于效應(yīng)基因RT-PCR產(chǎn)物的水平。
AMC-活性微生物含量，直接正比于指示基因PCR產(chǎn)物的水平。
BOD-生物氧需求。
BOD5-五天生物氧需求BODgly-對(duì)于草甘膦的生物氧需求。
cgox-在該情況下一種在競(jìng)爭(zhēng)性PCR方案中被用作為內(nèi)部對(duì)照的截短的gox基因；也可為一種插入或者序列變體；其它內(nèi)部對(duì)照亦可。
COD-化學(xué)氧需求。
競(jìng)爭(zhēng)性定量PCR-DNA含量的一種定量測(cè)定，其中一種內(nèi)部同源DNA標(biāo)準(zhǔn)被用于作為擴(kuò)增效率的變異的對(duì)照。
競(jìng)爭(zhēng)性定量RT-PCR-RNA含量的一種定量測(cè)定，其中一種內(nèi)部同源RNA標(biāo)準(zhǔn)被用于作為逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增效率的變異的對(duì)照。
經(jīng)驗(yàn)確定的最優(yōu)操作范圍-指的是最優(yōu)ABC、AMC和SBC值，這些值由操作者根據(jù)經(jīng)驗(yàn)預(yù)先確定，以提供特定的廢水成分的最有效降解。
效應(yīng)基因-任何基因或其一部分，這些基因編碼一種目的降解性酶，優(yōu)選為一種特定的降解途徑的限速酶。
F/M-食物與微生物的比例。
FBOD/M-食物與微生物的比例，其中F作為BOD測(cè)量。
GDA-草甘膦降解活性。
gox-草甘膦氧化還原酶基因。
HRT-水力存留時(shí)間。
指示基因-任何基因或其一部分，該基因通常對(duì)于目的微生物是唯一性的；該基因可與效應(yīng)基因相同；該基因被用于測(cè)定目的微生物在微生物群中的豐度。
內(nèi)部對(duì)照-在該情況下被例示為與指示和/或效應(yīng)基因同源的基因，但內(nèi)部對(duì)照具有小的變異。小的序列變異，例如改變的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)也是可能的。其它的內(nèi)部對(duì)照也可被使用，但同源對(duì)照是優(yōu)選的。
MCRT-平均細(xì)胞存留時(shí)間。
MLSS-混合液中的懸浮固體。
MLVSS-混合液中的揮發(fā)性懸浮固體。
OUR-攝氧速率。
PCR-聚合酶鏈反應(yīng)。
qPCR-定量PCR-定量PCR在此例示為使用了一種內(nèi)部同源對(duì)照的競(jìng)爭(zhēng)性技術(shù)，該內(nèi)部同源對(duì)照由于少量的插入或者缺失而有異于目標(biāo)。但是，也可以使用非競(jìng)爭(zhēng)性和動(dòng)力學(xué)定量PCR。設(shè)計(jì)了實(shí)驗(yàn)以合并實(shí)時(shí)、動(dòng)力學(xué)PCR檢測(cè)和內(nèi)部同源對(duì)照，該對(duì)照可以與靶序列一起同時(shí)檢測(cè)。例如，BoiTechniques 26(1)112-125(1999)提供了關(guān)于定量PCR，特別是RT-PCR的極好的討論。
qRT-PCR-定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)，同樣可被用于qRT-PCR的相關(guān)技術(shù)的描述可見于對(duì)qPCR的描述。
RT-PCR-逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)。
SBC-比生物除污物含量，SBC＝ABC/AMC。
TOC-總有機(jī)碳。
TMC-總微生物含量，可通過對(duì)遍在基因的PCR測(cè)定來測(cè)量。
總體來說，本發(fā)明為一種以任何有效手段從廢水處理系統(tǒng)中進(jìn)行廢水取樣并且從樣品中收集固體(包括其中的微生物群)從而對(duì)廢水處理系統(tǒng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)的方法。從固體中分離出DNA和RNA并且進(jìn)行定量擴(kuò)增以測(cè)定特定微生物群的豐度以及特定降解性基因的表達(dá)水平。如果必要，可通過在擴(kuò)增前進(jìn)行寡聚dT雜交進(jìn)一步純化來自真核微生物的mRNA。
微生物豐度通過測(cè)量一種“指示”基因的水平進(jìn)行評(píng)估，降解潛能通過測(cè)量一種“效應(yīng)”基因的表達(dá)水平而進(jìn)行評(píng)估。指示基因的豐度相關(guān)于所述的樣品的活性微生物含量(AMC)，效應(yīng)基因的表達(dá)水平相關(guān)于活性生物除污物含量(ABC)。比生物除污物含量(SBC)為ABC除以AMC。精確單位并不重要，而且可以根據(jù)方便而改動(dòng)。
該廢水處理系統(tǒng)通過諸如加入營(yíng)養(yǎng)物而進(jìn)行擾動(dòng)，并且對(duì)該過程進(jìn)行重復(fù)直至AMC和ABC以及/或者SBC處于根據(jù)經(jīng)驗(yàn)而預(yù)定的最優(yōu)操作范圍。高ABC值顯示了效應(yīng)基因的高水平表達(dá)。很低的AMC值表明這些細(xì)胞已經(jīng)死亡并且在檢測(cè)點(diǎn)之上降解。高的SBC值表明細(xì)胞非常健康并且效應(yīng)基因表達(dá)很強(qiáng)。
該方法可被用于實(shí)現(xiàn)對(duì)廢水處理系統(tǒng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，并且因此特別可用于對(duì)某一給定的系統(tǒng)進(jìn)行最優(yōu)化，這是因?yàn)榭蛇M(jìn)行非常迅速的反應(yīng)評(píng)估。進(jìn)一步，該監(jiān)測(cè)方法比現(xiàn)有的方法更為靈敏，并且還具有顯著更高的特異性，這是因?yàn)楸环治龅氖侵鲃?dòng)產(chǎn)生降解潛能的活細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，該方法使用了競(jìng)爭(zhēng)性定量PCR和競(jìng)爭(zhēng)性定量RT-PCR來分別測(cè)量指示基因豐度和效應(yīng)基因的表達(dá)。但是，還可以使用qPCR和qRT-PCR的非競(jìng)爭(zhēng)性的，動(dòng)力學(xué)以及組合方法。本發(fā)明以一種內(nèi)部對(duì)照構(gòu)建體進(jìn)行例示，它產(chǎn)生了指示/效應(yīng)基因PCR產(chǎn)物的一種大小上的變體。這在最大程度上降低了序列特異性的PCR偽跡，并且有助于確保定量的精確。競(jìng)爭(zhēng)物經(jīng)仔細(xì)測(cè)試以保證在被擴(kuò)增片段大小上的微小改變并不會(huì)顯著地影響PCR擴(kuò)增的效率，但是測(cè)試顯示大小上的微小改變(50bp)并不明顯地影響循環(huán)效率。其它內(nèi)部對(duì)照也是可能的。
gox基因在本發(fā)明中被用作指示和效應(yīng)基因兩者，但是其它的指示基因也是可能的，只需要該指示基因在基因組中穩(wěn)定并且具有某些對(duì)于目的微生物是獨(dú)特的序列。該效應(yīng)基因可以是任何降解性基因，但是該基因優(yōu)選編碼在給定降解途徑中的限速基因。其它的效應(yīng)基因的例子包括nahAc、pox、ditAl、merP、merT、amoA和mntA基因。
本文的方法的例示為在經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后對(duì)染色的PCR產(chǎn)物的密度測(cè)定，但許多定量方法是可行的。一些沒有完全實(shí)現(xiàn)的技術(shù)可能會(huì)在以后證明是可用的，這些技術(shù)包括基于NMR或者質(zhì)譜的方法。但是，當(dāng)前的標(biāo)準(zhǔn)為基于雜交的方法?；陔s交的定量方法相當(dāng)靈敏并且通過使用DNA芯片或者微量滴定板掃描儀可很容易地進(jìn)行自動(dòng)化。例如，產(chǎn)物特異性引物可進(jìn)行示差標(biāo)記，以此而允許對(duì)兩種產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。定量的方法有很多，廣義形式下的本發(fā)明并不限于此方面的具體方法學(xué)。
本方法通過一種連續(xù)流動(dòng)活性污泥系統(tǒng)進(jìn)行例示，但可以應(yīng)用以任何系統(tǒng)類型，其例子包括程序化分批測(cè)試反應(yīng)器、填充床反應(yīng)器系統(tǒng)、固定化細(xì)菌系統(tǒng)、流化床反應(yīng)器系統(tǒng)、滴濾系統(tǒng)以及旋轉(zhuǎn)生物接觸器系統(tǒng)。
附圖簡(jiǎn)述圖1.連續(xù)流動(dòng)活性污泥系統(tǒng)的典型組件。
圖2.單級(jí)測(cè)試反應(yīng)器。
圖3.反應(yīng)器A的gox mRNA定量。在對(duì)gox和cgox的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離和密度測(cè)量定量后，對(duì)于每個(gè)內(nèi)標(biāo)濃度的cgox的PCR產(chǎn)物和gox的PCR產(chǎn)物之比例對(duì)加入至每個(gè)反應(yīng)的已知cgox(pg)值進(jìn)行作圖。使用線性回歸分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。cgox∶gox之比等于1的點(diǎn)代表等值點(diǎn)。
圖4.反應(yīng)器B的gox mRNA的定量。詳見圖3。
圖5.反應(yīng)器溶解氧(DO)擾動(dòng)實(shí)驗(yàn)。
圖6.DO擾動(dòng)實(shí)驗(yàn)期間的草甘膦透過(breakthrough)圖7.DO擾動(dòng)實(shí)驗(yàn)期間的草甘膦DNA。
圖8.DO擾動(dòng)實(shí)驗(yàn)期間的草甘膦RNA。
本發(fā)明實(shí)施方案的詳述本發(fā)明通過gox基因進(jìn)行例示，但是可以以任何在生物處理過程中很重要的基因進(jìn)行實(shí)施，只要關(guān)于指示/效應(yīng)基因組合的序列信息可用于產(chǎn)生特異性引物。在理想情況下，效應(yīng)基因編碼某種給定的降解性或者生物除污途徑的限速酶，并且指示基因?qū)τ趹?yīng)用于該途徑的微生物是獨(dú)特的。因此，基因拷貝數(shù)和表達(dá)水平應(yīng)同該生物處理過程良好地相關(guān)。
指示和效應(yīng)基因可以是相同的基因。這簡(jiǎn)化了過程并且保證了兩種測(cè)量同該系統(tǒng)的降解潛能相關(guān)。但是，在另一個(gè)實(shí)施方案中，指示基因和效應(yīng)基因是分離的基因。指示基因可同效應(yīng)基因(例如gox基因)緊密連接，從而使指示和效應(yīng)基因并不分離。或者，該指示基因可以為任何具有獨(dú)特序列的單拷貝基因，為存活必須對(duì)該基因進(jìn)行維持，因此該基因的豐度精確地相關(guān)于目的微生物的豐度。該指示基因甚至可為一種常見的管家基因，只要用于擴(kuò)增該指示基因的引物對(duì)于該目的微生物是獨(dú)特的。通過這樣的方法，基因的豐度精確地顯示了具有降解潛能的微生物的豐度，并且其它的微生物未被定量。如果需要，也可通過分析遍在基因的水平而測(cè)量總微生物含量(TMC)。
盡管該系統(tǒng)在此通過參考gox基因進(jìn)行例示，但是其它多種基因可被使用。例如，微生物已經(jīng)被用于螯合、沉淀多種重金屬離子或者改變其氧化狀態(tài)(Pazirandeh et al.，1998，Appl.Environ.Microbiol.644068-4076)。鎘或者汞的再生效率可以分別通過測(cè)定攝取基因mntA(Hao et al.，1999，Appl.Environ.Microbiol.654746-4752)或者merP(或merT)(Ravel et al.，2000，J.Bacteriol.，1822345-2349)的豐度和表達(dá)來進(jìn)行測(cè)定。表1列出了一些可能在本發(fā)明中有用的基因。
表1底物和效應(yīng)基因
本發(fā)明提供了基于PCR的方法以用于對(duì)給定的指示基因的DNA的量和效應(yīng)基因的表達(dá)水平進(jìn)行定量測(cè)量。這樣的測(cè)量提供了存在于某種給定的生態(tài)系統(tǒng)中的特定的生物處理微生物的量的具體信息(例如，由指示基因水平所反映的AMC值)，還提供了生物處理活性水平的具體信息(即，由效應(yīng)基因表達(dá)水平所反映的ABC值)。將該信息同目前所測(cè)量的廢水處理系統(tǒng)參數(shù)相結(jié)合，不僅用以提供對(duì)這些系統(tǒng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)的手段，而且用于改進(jìn)對(duì)這些系統(tǒng)進(jìn)行主動(dòng)的，近于實(shí)時(shí)控制的方法。
本發(fā)明在本領(lǐng)域的應(yīng)用在典型情況下涉及從用于處理含草甘膦的廢水流的活性污泥進(jìn)行取樣，還涉及從該樣品進(jìn)行指示/效應(yīng)基因組合的PCR擴(kuò)增。近于實(shí)時(shí)的控制通過由這些基于PCR的方法提供的信息而實(shí)現(xiàn)。對(duì)草甘膦降解性微生物的豐度和這些微生物的gox表達(dá)介導(dǎo)的草甘膦降解活性水平的定量測(cè)量可允許在控制參數(shù)中進(jìn)行知情的改變，從而完成更為有效的廢水生物處理，例如，草甘膦降解。
例如，正如低活性微生物含量(AMC)所反映，當(dāng)指示基因水平很低時(shí)，以額外的微生物對(duì)活性污泥進(jìn)行重新補(bǔ)充可能是必需的。當(dāng)由低活性生物除污物含量(ABC)所反映的效應(yīng)基因表達(dá)值低，而AMC顯示存在所需的微生物時(shí)，可能必須在開始該系統(tǒng)的大規(guī)模加載之前使樣品進(jìn)行適應(yīng)。當(dāng)ABC和AMC低于最優(yōu)值時(shí)，ABC和AMC測(cè)量值可被用于對(duì)系統(tǒng)反應(yīng)進(jìn)行給定參數(shù)改變的快速校準(zhǔn)，所述參數(shù)例如pH、氮水平、加載速率和流速。因此，ABC和AMC測(cè)量可以提供廢水處理系統(tǒng)的近于實(shí)時(shí)的監(jiān)測(cè)，并且由此而提供對(duì)該系統(tǒng)的迅速得多的優(yōu)化。
在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，在避免草甘膦透過的同時(shí)所達(dá)到的廢水加載增加的速率是以一種基本主動(dòng)的方式進(jìn)行測(cè)定，該方式特異于草甘膦降解活性(GDA)的主要機(jī)制——gox介導(dǎo)的分解代謝。草甘膦的透過在廢水加載量超過設(shè)備的草甘膦處理系統(tǒng)的處理能力的情況下發(fā)生；如果未觀察到草甘膦的透過，則加載量在某種程度上相當(dāng)于或者低于處理能力。另一方面，常規(guī)的方式(例如，基于OUR的測(cè)量方法，結(jié)合以對(duì)廢水流出物中的關(guān)鍵成分進(jìn)行的分析)在避免草甘膦透過的同時(shí)，在最優(yōu)的被動(dòng)和非特異方式下僅僅提供了對(duì)廢水加載增加的速率的粗略估計(jì)。
基于PCR的測(cè)量，特別是競(jìng)爭(zhēng)性qPCR和競(jìng)爭(zhēng)性qRT-PCR，在對(duì)草甘膦廢水處理能力和比生物除污物活性的測(cè)定方面提供了迄今尚無先例的精確性。通過使用活性微生物含量(AMC)的測(cè)定而非粗略的MLVSS估測(cè)而完成了對(duì)gox基因拷貝的精確定量或者微生物計(jì)數(shù)，由此而提供了可被用于對(duì)生物處理系統(tǒng)的降解活性進(jìn)行更精準(zhǔn)預(yù)測(cè)的信息。進(jìn)一步，通過對(duì)活性生物除污物含量(ABC)的測(cè)定以及比生物除污物含量(SBC)值(SBC＝ABC/AMC)的測(cè)定，可以獲得一種系統(tǒng)的gox基因拷貝的相對(duì)表達(dá)或者活性的直接信息。ABC、AMC和SBC值亦可被用于估測(cè)一種系統(tǒng)對(duì)草甘膦加載量的變化作出迅速反應(yīng)的能力。
在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了改進(jìn)的方法，該方法用于測(cè)定能夠降解草甘膦的微生物生物物質(zhì)的特定估計(jì)值。對(duì)這些估計(jì)值進(jìn)行測(cè)定的常規(guī)方法依賴于F/M比例的測(cè)量，特別是依賴于FBOD/M比例，即，BOD(kg/天)/MLVSS(kg)。然而，可用于對(duì)BOD(特別是對(duì)于草甘膦特異性的BOD或者BODgly)和MLVSS的估計(jì)值進(jìn)行測(cè)定的方法通常是冗長(zhǎng)的并且不允許對(duì)草甘膦的降解進(jìn)行主動(dòng)的，近于實(shí)時(shí)的控制。
基于PCR的方法提供了AMC的測(cè)量以替代粗略的MLVSS測(cè)量?；趃ox基因拷貝的精確定量的AMC估測(cè)值，即，AMCgox估測(cè)值，提供了可被用于對(duì)一種生物處理系統(tǒng)降解草甘膦的最大能力進(jìn)行更精準(zhǔn)預(yù)測(cè)的信息。進(jìn)一步，基于PCR的方法還提供了對(duì)ABC的精確的功能特異的測(cè)量，以替代易出錯(cuò)的非特異性O(shè)UR測(cè)量。ABC測(cè)量提供gox基因表達(dá)的直接信息，即，ABCgox測(cè)量，并且可被進(jìn)一步用于估測(cè)gox的SBC值，即SBCgox值，這是因?yàn)镾BCgox是ABCgox/AMCgox之比。針對(duì)某種特定效應(yīng)基因的基于PCR的SBC估測(cè)提供了一種生物處理系統(tǒng)降解某種廢水成分的能力的近于即時(shí)的或者快速成像的快照。
本發(fā)明的方法(例如，用于估測(cè)微生物生物物質(zhì)和活性)是用于評(píng)估過程性能的常規(guī)方法的重大突破。如上文指出，常規(guī)方法依賴于以BOD(kg/天)/MLVSS(kg)表示的對(duì)總體和特異性F/M值的估測(cè)，而本發(fā)明一個(gè)方面提供了對(duì)特異于草甘膦的F/M比值的估測(cè)，該估測(cè)部分地使用了與效應(yīng)基因gox連鎖的指示基因的拷貝數(shù)進(jìn)行基于PCR的定量。例如，特異于草甘膦的F/M比值的估計(jì)值應(yīng)等于草甘膦流入(kg/天)/AMCgox(kg)，其中AMCgox為具有一個(gè)拷貝的gox效應(yīng)基因的活微生物的千克質(zhì)量。再舉一例，特異于草甘膦的一種潛在地更為有用的F/M比值估測(cè)應(yīng)等于草甘膦流入(kg/天)/ABCgox(kg)，在本例中ABCgox為，被表達(dá)的gox的mRNA的量。
由于常規(guī)方法的F/M比值可被用于將生物處理過程的性能同總體廢水加載量進(jìn)行關(guān)聯(lián)(但對(duì)廢水中多種特異性成分具有困難)，本發(fā)明方法各方面所提供的F/M比值不僅可被用于將生物處理過程的性能同總體廢水加載量進(jìn)行關(guān)聯(lián)，而且還可將該生物處理過程的性能同某種具體的廢水成分，例如草甘膦的加載量進(jìn)行關(guān)聯(lián)。用于測(cè)定過程參數(shù)的常規(guī)方法不能提供這種信息，這是因?yàn)镕/M比值的分母的估計(jì)值，即，MLVSS，(a)僅僅為生物物質(zhì)的一個(gè)粗略估計(jì)并且不能分辨存活或者非存活細(xì)胞；(b)并不能對(duì)生物物質(zhì)的具體關(guān)鍵成分加以辨別，例如對(duì)并不攜帶效應(yīng)基因(如gox)的微生物同攜帶該基因的微生物進(jìn)行辨別；以及(c)并不提供由mRNA水平所顯示的有關(guān)特定的降解性活性的信息。
草甘膦流入(kg/天)/ABCgox(kg)的F/M比值并不具有上述的缺點(diǎn)。該分母ABCgox基于攜帶gox效應(yīng)基因的活細(xì)胞所表達(dá)的mRNA水平。因此，在本發(fā)明的一個(gè)方面中提供了用于修飾廢水生物處理中的有效GDA的控制參數(shù)的信息，該修飾通過基于PCR的監(jiān)測(cè)所實(shí)現(xiàn)的測(cè)量而進(jìn)行。
實(shí)施例1基于PCR的測(cè)量為進(jìn)行活性污泥的分析，根據(jù)下文描述而獲取3.0-4.5ml的樣品并且將其轉(zhuǎn)入滅菌的1.5ml微量離心管并且立即置于冰上。隨后的全部操作在＜4℃，或在離液核酸穩(wěn)定劑(BIO101TM，Vista，CA，目前是OBIOGENE，Carlsbad，CA)存在下完成。3.0ml活性污泥的樣品含有大約150-200mg污泥固體(濕重)。目前對(duì)異養(yǎng)微生物群落的估計(jì)表明，所述3.0ml的樣品含有大約2.1×108個(gè)細(xì)菌細(xì)胞。通過在15,300rpm下離心30秒而收集懸浮固體。
然后傾析活性污泥混合的液體，立即在-80℃下冷凍污泥沉淀物。樣品在進(jìn)行核酸提取之前必須在-80℃下保存，除非在傾析之后立即進(jìn)行從污泥沉淀物的提取。-80℃的保存優(yōu)選持續(xù)少于一周，并且不超過一個(gè)月。
活性污泥的冷凍沉淀物在冰上進(jìn)行融化并且重懸浮于無菌水中。隨后使用標(biāo)準(zhǔn)試劑盒(例如FASTDNA或者FASTRNA試劑盒(BIO101TM)，根據(jù)制造商的建議)迅速提取核酸(DNA或者RNA)。所提取的DNA在-20℃下保存。所提取的RNA在-80℃下保存并且在30天之內(nèi)進(jìn)行分析，盡管在必要的情況下RNA穩(wěn)定劑可以延長(zhǎng)RNA保存期。
或者，在必需更大量的RNA的情況下(例如，當(dāng)gox表達(dá)水平低時(shí))，可以使用經(jīng)改動(dòng)的熱苯酚法(Fleming et al.，1993 Eviron.Sci.Technol.271068-74)來提取RNA。使用對(duì)該方法進(jìn)行的改動(dòng)而進(jìn)行的RNA提取如下將活性污泥沉淀物與500μl裂解緩沖液(0.05M乙酸鈉(NaAc)，0.05M NaCl，0.003M EDTA，1.0％SDS，pH5.2)進(jìn)行混合，在中等設(shè)置下渦旋，并在60℃下溫育5分鐘。加入500μl酸化苯酚(以NaAc進(jìn)行緩沖，pH5.2，預(yù)加熱至60℃)以及100μl氯仿∶異戊醇(24∶1)，并在中等設(shè)置下將該混合物渦旋10秒，隨后在60℃下再進(jìn)行5分鐘的溫育。隨后在冰上溫育該樣品(4℃)5分鐘并且在15,300rpm下離心15分鐘。
隨后將上清液轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的無RNA酶的微量離心管中，同一倍體積的100μl氯仿∶異戊醇(24∶1)進(jìn)行混合，渦旋振蕩10秒種(中速)，并且進(jìn)行離心(15,300rpm)5分鐘。隨后將該水相(頂層)轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的無RNA酶的管中，同1/10體積的3M NaAc(經(jīng)DEPC處理)和一倍體積的異丙醇相混合，顛倒該管以完全混合，并且在室溫下溫育5分鐘。在15,300rpm下離心15分鐘之后，棄去上清液并且以DEPC處理過的70％乙醇洗滌沉淀。在100μl經(jīng)DEPC處理過的水中溶解RNA沉淀并且在-80℃下保存。
在進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性qRT-PCR分析之前必需將污染DNA除去。將RNA樣品與1/10體積的100mM MgCl2/10mM DTT以及100單位的DNA酶I(無RNA酶)進(jìn)行混合。混勻該樣品并在37℃下溫育15分鐘。隨后將樣品再度混勻并再溫育15分鐘。加入1/10體積的3M NaAc以及1體積的異丙醇并將該樣品溫育5分鐘，并且離心15分鐘。以70％的乙醇(經(jīng)DEPC處理)洗滌沉淀一次。隨后將RNA模板沉淀物溶解于DEPC處理過的水中(終濃度1μg/μl)。
gox引物和各種PCR產(chǎn)物示于表2。
表2A序列鑒定
表2B序列鑒定
INVITROGEN Carlsbad，CA使用GA1/GA2引物組或者GA4/GA2引物組(關(guān)于gox PCR的更多信息見US5463175以及US5776760)產(chǎn)生了長(zhǎng)為504bp(SEQ ID NO.3)或者192bp(SEQ ID NO.1)的gox PCR產(chǎn)物。使用PCR還產(chǎn)生了一種競(jìng)爭(zhēng)物模板，該模板在504bp和192bp的gox PCR產(chǎn)物的3′-末端附近含有一個(gè)50bp的缺失。從該504bp gox PCR產(chǎn)物中缺失50bp以產(chǎn)生該cgox PCR產(chǎn)物的過程通過使用GA3引物而輔助進(jìn)行，該GA3引物靶定于該gox基因的3′-末端和在該結(jié)合位點(diǎn)上游50bp的區(qū)域。引物的結(jié)合導(dǎo)致了50bp的gox DNA成環(huán)狀脫離引物位點(diǎn)，并且因此而被排除于PCR延伸之外。這產(chǎn)生了一個(gè)454bp的DNA序列(SEQ IDNO.4)；具體說來，504bp gox PCR產(chǎn)物中435位的胸腺嘧啶殘基到484位的胸腺嘧啶殘基所限定的50bp的序列缺失。這一競(jìng)爭(zhēng)物gox(即，cgox)DNA片段被連接入一個(gè)PCRII-TOPO質(zhì)粒載體(INVITROGENTMCarlesbad，CA)，該載體含有兩個(gè)啟動(dòng)子位點(diǎn)(T7和SP6)，該載體允許進(jìn)行直接的轉(zhuǎn)錄，該轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生反義或者反義RNA鏈。
用于競(jìng)爭(zhēng)性RT-PCR的cgox mRNA的常規(guī)制備如下進(jìn)行從細(xì)菌宿主中對(duì)質(zhì)粒DNA進(jìn)行提取(例如，根據(jù)制造商的指導(dǎo)使用Plasmid Midi試劑盒(目錄號(hào)#12143，QIAGENTM，Valencia，CA)進(jìn)行)。使用EcoRV和BspHI限制性內(nèi)切酶剪切5μg的質(zhì)粒DNA，消化物使用1.0％低熔點(diǎn)瓊脂糖進(jìn)行電泳。下一步，將含有該cgox DNA片段的1654bp的EcoRV-BspHI片段從凝膠中切出并進(jìn)行純化(例如，使用QIAGENTM的凝膠提取試劑盒)。隨后對(duì)經(jīng)純化的DNA進(jìn)行定量并隨后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄(例如，AMBIONTM，Austin TX的MEGAscriptTM體外轉(zhuǎn)錄試劑盒)。SP6啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始產(chǎn)生了cgox mRNA的有義鏈。隨后對(duì)cgox mRNA進(jìn)行DNA酶處理并且使用酸化苯酚和氯仿進(jìn)行純化，進(jìn)行定量并保存于-80℃下直至使用。
使用DEPC處理的滅菌水，在0.2ml的PCR管中將0.1-5.0μg無DNA的RNA模板與25.2pmol的反義引物(GA2S或者GA2)和0.01-25pg的cgox mRNA混合，將反應(yīng)體積調(diào)整至9.5μl。在70℃下加熱該引物/模板混合物5分鐘并且迅速冷卻至4℃(在進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄溫育之前，反應(yīng)混合物被維持于4℃)。向該混合物加入5.5μl主混合物，該混合物含有200單位的MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶/反應(yīng)，1×MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)緩沖液(例如，目錄號(hào)#M1701，PROMEGATM，Madison WI)以及1.0μl的10mM dNTP混合物(ROCHETM，Indianapolis，IN)。通過將完整的反應(yīng)混合物在37℃下溫育1小時(shí)而進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。隨后進(jìn)行5分鐘的75℃(用以滅活逆轉(zhuǎn)錄)和0-4℃溫育(短期保存)。通過逆轉(zhuǎn)錄而制備的DNA混合物可在-20℃下長(zhǎng)期保存。
隨后使用以下的PCR方案對(duì)通過逆轉(zhuǎn)錄而制備的DNA樣品進(jìn)行分析。兩種主混合物被優(yōu)選地使用以使產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增偽跡的可能性最小化。第一種主混合物為引物混合物，該混合物含有0.4-1.0μM的每種引物(GA1/GA2或者GA4/GA2)以及0.2mM的每種dNTP；使用無菌的PCR級(jí)水將該引物混合物的體積調(diào)節(jié)至24μl/引物混合物。在0-4℃下冷藏該引物混合物直至PCR。
第二種主混合物為Taq酶混合物，該混合物含有Taq DNA聚合酶(1-5單位/反應(yīng))以及1×PCR緩沖液(10mM Tris-HCl，pH9.0，50mMKCl，0.1％Triton X-100以及2.0mM MgCl2)；總體積被調(diào)至24μl酶混合物。在0-4℃下冷藏該引物混合物直至PCR。隨后在0.2μl的PCR管中將2.0μl的通過逆轉(zhuǎn)錄而制備的cDNA同24μl引物混合物以及24μl Taq酶混合物進(jìn)行混合。
在混合期間PCR管被保持于0-4℃下并且立即在PCR熱循環(huán)儀中進(jìn)行溫育，溫育根據(jù)以下方案進(jìn)行1)在95℃下進(jìn)行5分鐘的起始變性，繼之以PCR循環(huán)，該循環(huán)使用92℃的變性溫度15秒，在57.5℃下退火30秒并且在72℃下延伸30-45秒；以及2)在進(jìn)行20-50個(gè)PCR循環(huán)之后，在72℃下進(jìn)行7分鐘的延長(zhǎng)延伸。該P(yáng)CR產(chǎn)物可在4℃下短期保存；長(zhǎng)期保存在-20℃。
對(duì)于DNA分析，盡管用DNA樣品替換了RNA樣品，這一相同的PCR方案使用以下的改動(dòng)而實(shí)施1)根據(jù)所需循環(huán)數(shù)和DNA的來源而調(diào)節(jié)模板濃度(例如，染色體DNA的模板濃度應(yīng)為0.1-1μg)；以及2)每個(gè)PCR反應(yīng)的總體積為50μl。
PCR產(chǎn)物的定量通過瓊脂糖凝膠電泳而進(jìn)行，但其它方法亦可被使用，包括，基于雜交的方法，如DNA芯片定量。將PCR反應(yīng)與5.5μl加載染料(例如，含有40％蔗糖溶液的被1∶10稀釋的天然瓊脂糖10×凝膠加載染料，AMBIONTM)進(jìn)行混合。將50μl該混合物加載至含有0.4μg/ml的溴化乙錠的1.2-2.5％瓊脂糖凝膠之中。隨后在80-140伏下進(jìn)行2-4小時(shí)的電泳。
使用凝膠記錄系統(tǒng)(例如ALPHAIMAGERTM2200TM，ALPHA INNOTECHCORP.TM，San Leandro CA)對(duì)凝膠進(jìn)行成像并且使用密度測(cè)量法測(cè)定DNA的量(例如，根據(jù)ALPHA INNOTECH CORPORATION.TM)。
在替代和優(yōu)選的情況下，實(shí)時(shí)PCR監(jiān)測(cè)被用于觀察PCR產(chǎn)物。gox/cgox競(jìng)爭(zhēng)性PCR和RT-PCR策略最適于進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR監(jiān)測(cè)，該監(jiān)測(cè)使用能夠?qū)Χ嘀豍CR產(chǎn)物進(jìn)行定量的PCR熱循環(huán)儀進(jìn)行。該P(yáng)CR監(jiān)測(cè)可在商業(yè)化的設(shè)備中完成，例如BIORADTM(Hercules，CA)ICYCLERIQTM、STRATAGENETM(La Jolla，CA)的MX4000TM或者ROCHETM的LIGHTCYCLERTM。
該實(shí)時(shí)PCR方法可使用cgox產(chǎn)物所固有的50bp缺失作為區(qū)分gox和cgox產(chǎn)物的機(jī)制。理論上，靶定于該50bp缺失區(qū)域的探針可被用于檢測(cè)該gox產(chǎn)物(使用一種熒光波長(zhǎng)，例如紅色)并且第二種探針可被用于通過靶定另一種共有區(qū)域而檢測(cè)所有的cgox和gox產(chǎn)物。(使用第二種熒光信號(hào)，藍(lán)色)。在替代的情況下，按照LIGHTCYCLERTM，該擴(kuò)增反應(yīng)可使用一種非特異性的雙鏈DNA結(jié)合染料，例如SYBRGREEN ITM(ROCHETM)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，該監(jiān)測(cè)結(jié)合于對(duì)cgox和gox產(chǎn)物的區(qū)分而進(jìn)行，該區(qū)分基于這兩種產(chǎn)物的特異的解鏈溫度。
這些方法將會(huì)明顯地減少分析時(shí)間，這是因?yàn)樗鼈儫o需對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離并且無需隨后通過密度測(cè)量而進(jìn)行定量。實(shí)時(shí)PCR將完全對(duì)異雙鏈體的形成進(jìn)行校正，可以立即鑒別出失敗的實(shí)驗(yàn)并且通過設(shè)置精確點(diǎn)(exact point)而允許提高靈敏度，在該精確點(diǎn)偽跡開始積累。
實(shí)施例2對(duì)Fayetteville活性污泥進(jìn)行的增強(qiáng)RNA提取根據(jù)實(shí)施例1的詳細(xì)描述，使用熱苯酚法對(duì)Fayetteville活性污泥實(shí)施RNA提取，該活性污泥獲自位于Fayetteville，North Carolina(即，Cedar Creek Road，F(xiàn)ayetteville，NC 28301)的Monsanto制造廠。使用RNA提取的熱苯酚法增加了核酸收率，該方法同F(xiàn)ASTRNATM方法相關(guān)。在典型的情況下，RNA提取的熱苯酚法從每4.5ml的活性污泥中產(chǎn)生約20μg無DNA的RNA。該熱苯酚法還可被擴(kuò)大規(guī)模以從活性污泥固體中提取更大量的RNA，并且由此而更進(jìn)一步提高了總體產(chǎn)量。然而，為了實(shí)施的便利，F(xiàn)ASTRNATM方法對(duì)于常規(guī)的RNA提取仍然具有吸引力，特別是在通過常規(guī)方法可得足量的RNA產(chǎn)量的情況下。
實(shí)施例3增強(qiáng)的gox競(jìng)爭(zhēng)性定量RT-PCR在該競(jìng)爭(zhēng)性qRT-PCR過程中可實(shí)現(xiàn)多種額外的增強(qiáng)。這些增強(qiáng)包括，增強(qiáng)了含有g(shù)ox或cgox mRNA標(biāo)準(zhǔn)的貯存溶液的穩(wěn)定性(例如，使用1.0mM的檸檬酸鈉)，降低了對(duì)于gox或cgox mRNA的檢測(cè)限制，并且提高了對(duì)gox進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性qRT-PCR過程的PCR步驟中逆轉(zhuǎn)錄/復(fù)制的保真度。
使用10mM的Tris緩沖H2O(對(duì)于cgox DNA標(biāo)準(zhǔn))以及1.0mM的檸檬酸鈉(對(duì)于cgox RNA標(biāo)準(zhǔn))而制備競(jìng)爭(zhēng)物gox內(nèi)標(biāo)梯度。對(duì)于cgox DNA，使用常規(guī)方法制備標(biāo)準(zhǔn)溶液，該溶液在每100μl mM Tris緩沖H2O中含有25pg到1.0pg的cgox-質(zhì)粒載體DNA(例如25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.2以及0.1pg，即，分別為2.87、1.44、0.72、0.36、0.18、0.09、0.04、0.02以及0.01pg的實(shí)際cgox序列DNA，其中實(shí)際cgox序列DNA的質(zhì)量等于載體DNA質(zhì)量乘以gox插入片段大小與總載體長(zhǎng)度的比值)。對(duì)于cgox RNA標(biāo)準(zhǔn)，使用常規(guī)方法制備在大約每100μl 1.0mM檸檬酸鈉中含有10到0.01pg cgoxRNA(例如，10、5、2.2、1.25、0.63、0.31、0.16、0.08、0.04、0.02和0.1pg)的溶液。
在RT-PCR之前進(jìn)行全面DNA酶處理很重要，在實(shí)施例1中已經(jīng)詳細(xì)描述。針對(duì)特異性逆轉(zhuǎn)錄方案而進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)顯示，RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)可顯著地影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。通過加入一個(gè)預(yù)先的變性步驟，使用0.5到5.0μg分離自Fayetteville活性污泥的總RNA觀察到了gox cDNA產(chǎn)量的線性提高。對(duì)于這些研究，提高的RNA加載量和緩沖mRNA標(biāo)準(zhǔn)的配合使用已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)每1.0到5.0μg總RNA中的少至約9.08fg goxmRNA(即，1×10-15g gox mRNA)的檢測(cè)。
根據(jù)在2.0％的瓊脂糖凝膠電泳分離之后進(jìn)行的cgox和gox產(chǎn)物的定量測(cè)定，gox競(jìng)爭(zhēng)性qRT-PCR實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示了對(duì)cgox mRNA的線性擴(kuò)增。在進(jìn)行這樣的電泳之后的陰性對(duì)照泳道中(即，不經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄步驟而制備的RNA樣品)無帶。對(duì)密度測(cè)定值進(jìn)行的回歸分析表明，如圖3和4所示，這些數(shù)據(jù)在可接受限之內(nèi)擬合為線性模型。
特別地，在對(duì)PCR產(chǎn)物水平進(jìn)行密度測(cè)量之后，反應(yīng)器A中的cgox濃度(見圖3)經(jīng)計(jì)算為3.77×104個(gè)拷貝的gox mRNA/μg總RNA，如下y＝mx+b，其中m＝斜率，b＝y(tǒng)軸截距y＝0.071x-0.0275(通過對(duì)這些數(shù)據(jù)點(diǎn)的線性回歸分析)當(dāng)x＝1時(shí)，即，cgox/gox＝1時(shí)，y＝0.0442pg cgox＝0.0442pg gox，但是使用了5.0μg總RNA，因此0.0442pg cgox÷5.0μg總RNA＝0.0088pg cgox/μg總RNA0.0088pg cgox/μg總RNA×4280249個(gè)拷貝的cgox/pgcgox＝3.77×104個(gè)拷貝的cgox/μg總RNA起始物質(zhì)。因此同樣有3.77×104個(gè)拷貝的gox RNA/μg總RNA起始物質(zhì)。
類似地，在對(duì)PCR產(chǎn)物水平進(jìn)行光密度測(cè)量之后，反應(yīng)器B中的cgox濃度(見圖4)經(jīng)計(jì)算為1.24×105個(gè)拷貝的gox mRNA/μg總RNA，如下y＝mx+b，其中m＝斜率，b＝y(tǒng)軸截距y＝0.068x+0.0044(通過對(duì)三個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的線性回歸分析)當(dāng)x＝1，即，cgox/gox＝1時(shí)，y＝0.0724pg cgox＝0.00724pg gox但是使用了2.5μg總RNA，因此0.0724pg cgox÷2.5μg總RNA＝0.0290pg cgox/μg總RNA0.0290pg cgox/μg總RNA×4280249個(gè)拷貝的cgox/pgcgox＝1.24×105個(gè)拷貝的cgox/μg總RNA起始物質(zhì)。因此同樣有1.24×105個(gè)拷貝的gox RNA/μg總RNA起始物質(zhì)。
表3為對(duì)cgox和gox的集成光密度(IOD)，它被用于產(chǎn)生圖3和圖4的三個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，如表3所述。
表3GOX RNA拷貝數(shù)估測(cè)值的集成光密度(IOD)
前述的實(shí)施例描述了gox mRNA的定量。為對(duì)gox DNA進(jìn)行定量而使用了同樣的方法，不同之處在于使用了僅僅0.1μg總DNA而不是5.0μg總RNA(對(duì)于反應(yīng)器A)或者2.5μg總RNA(對(duì)于反應(yīng)器B)。因此，pg cgox DNA值被除以0.1μg總DNA。進(jìn)一步，該商值被乘以2140125拷貝cgox DNA/pg cgox的換算因子。
實(shí)施例4廢水處理的模擬在該研究中使用Eckenfelder設(shè)計(jì)的兩種連續(xù)流動(dòng)反應(yīng)器(Adams，C.E.，D.L.Ford，and W.W.Eckenfelder，1981，Developmentof Design and Operational Criteria for Wasterwater Treatment.Enviro Press Inc.，Nashville，TN.)。圖2所示為一種單級(jí)測(cè)試反應(yīng)器的通用設(shè)計(jì)。廢液池(或反應(yīng)器)71由混合器83進(jìn)行混合?？諝馔ㄟ^氣管73提供并經(jīng)氣石75擴(kuò)散。如果必要，包括閥門81，以用于在經(jīng)廢水流出管77排出液體之前使固體沉積在堰79附近。通過填料管85對(duì)池71進(jìn)行填料。
進(jìn)行了一些實(shí)驗(yàn)以測(cè)定用于使草甘膦在上述兩個(gè)反應(yīng)器中降解的最優(yōu)操作參數(shù)。這些反應(yīng)器的混合通過使用一種電子實(shí)驗(yàn)室混合器以及一個(gè)水池型氣石而進(jìn)行?；旌系奈勰嘁邕^堰而進(jìn)入置于該臺(tái)階下的凈化器。流出物從該凈化器流出(通過重力)而進(jìn)入一個(gè)廢水容器并且沉積的污泥使用一種速率可調(diào)節(jié)的蠕動(dòng)泵(MASTERFLEXTM，COLE-PARMER INSTRUMENT CO.TM，Chicago IL.)而被泵回該反應(yīng)器，該蠕動(dòng)泵鉤住一個(gè)間隔計(jì)時(shí)器(CONTROLTM，LINDBURG ENTERPRISES，INC.TM，San Diego CA)。空氣(具有對(duì)池內(nèi)氣體的緊急轉(zhuǎn)換系統(tǒng))通過蒸餾水瓶而被泵入，該蒸餾水瓶被用于在泵入反應(yīng)器之前進(jìn)行加濕。反應(yīng)器中的溶解氧水平維持于2.0到4.0mg/L。水池型加熱器配以電子控制器而進(jìn)行使用以維持混合液體的溫度為19到23℃。
各個(gè)反應(yīng)器均填入2.2L的活性污泥，該污泥收自位于Fayetteville，North Carolina的Monsanto制造廠。來自于Fayetteville制造廠的真實(shí)的流入廢水被用作為實(shí)驗(yàn)室生物反應(yīng)器的填料并且在維持于4℃下的冷室中保存直至使用。
用96.2％的硫酸調(diào)節(jié)反應(yīng)器的流入pH以將混合液體pH維持為6.8到7.8。加入NH4OH溶液以向該反應(yīng)器填料中額外補(bǔ)充15-30mg/L的NH4+。使用蠕動(dòng)泵(COLE-PARMER INSTRUMENT CO.TM，Chicago IL.)將流入廢水補(bǔ)充入該反應(yīng)器，其水力流速足以產(chǎn)生3.3天的反應(yīng)器HRT。同樣使用蠕動(dòng)泵將自來水連續(xù)地加入該反應(yīng)器以補(bǔ)償蒸發(fā)的損失。定期從反應(yīng)器中除去一定體積的混合液體以維持MLVSS值于4000到5000mg/L并且維持污泥年齡值為60到100天。FBOD/M比值被維持于0.14-0.25天-1以提供反應(yīng)器中草甘膦降解的恒定水平。
這些測(cè)試表明，草甘膦降解的最優(yōu)參數(shù)為40到80天的MCRT、3到6天的HRT、4到8g/L的MLVSS、3500到6000mg/L的流入BOD、0.14到0.23天-1的FBOD/M、18到35℃的溫度、10到30mg/L的流入氮濃度以及50到250mg/L的流入草甘磷濃度。
同樣的系統(tǒng)使用在實(shí)施例1中所描述的PCR方法進(jìn)行了測(cè)試。在如前所述的最優(yōu)操作參數(shù)下對(duì)競(jìng)爭(zhēng)性qPCR以及競(jìng)爭(zhēng)性qRT-PCR所產(chǎn)生的產(chǎn)物水平進(jìn)行了測(cè)量，并且從多種方面對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行了擾動(dòng)以觀察PCR產(chǎn)物的改變。對(duì)多種參數(shù)進(jìn)行了測(cè)定，包括活性微生物含量(AMC)為競(jìng)爭(zhēng)性qPCR產(chǎn)物量×CF1，其中CF1為第一換算因子?；钚陨锍畚锖?ABC)為競(jìng)爭(zhēng)性qRT-PCR產(chǎn)物量×CF2，其中CF2為第二換算因子。比生物除污物含量(SBC)為ABC/AMC×CF3。這些換算因子可為1或者便于操作者的任何單位。
用于改變實(shí)驗(yàn)室反應(yīng)器的草甘膦加載量的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在表4中描述。
表4使用實(shí)驗(yàn)室反應(yīng)器進(jìn)行的草甘膦加載量研究
表5提供了一個(gè)例子，該例子詳述了在向兩個(gè)反應(yīng)器加載草甘膦之前和之后的gox DNA和gox mRNA產(chǎn)量表5在草甘膦加載前后的GOX DNA和MRNA產(chǎn)量
*等于或者低于檢測(cè)限，**檢測(cè)到，但未定量在表5中，AMC被任意地選定以每μg提取自特定樣品的起始DNA的fg PCR產(chǎn)物為單位而表達(dá)，而不是每μg起始DNA的含有g(shù)ox基因的生物物質(zhì)的質(zhì)量(kg)。因此，該測(cè)定假定對(duì)于不同樣品的DNA提取效率是相等的，否則樣品的處理則是一致的。設(shè)計(jì)了一些實(shí)驗(yàn)用于證實(shí)提取效率是一致的，并且如果觀察到了變異，可以進(jìn)行核酸摻加研究，該項(xiàng)研究對(duì)數(shù)據(jù)或者提取和/或逆轉(zhuǎn)錄方法學(xué)進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化，該方法學(xué)對(duì)結(jié)果一致性進(jìn)行了優(yōu)化。
類似地，表5中的ABC被任意地選定以每μg用于qRT-PCR的起始RNA的fg gox mRNA為單位而表達(dá)。在該情況下使用的為總RNA，但是如果考慮到靈敏度，聚A+RNA可被用于真核生物處理生物。在兩種情況下都應(yīng)該進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來保證提取效率、逆轉(zhuǎn)錄、擴(kuò)增以及，如果使用，聚A+選擇效率并非RT-PCR方法中顯著變異的來源。確保提取一致性的一種途徑為在液氮中迅速冷凍樣品沉淀并且將該樣品在苯酚中融化，這樣便防止了收集后的RNA酶活性。當(dāng)然，有很多可靠的提取和操作RNA的方法，在這一點(diǎn)上，實(shí)施者是充分熟練的。
表6為在穩(wěn)態(tài)條件下受測(cè)PCR產(chǎn)物對(duì)草甘膦加載量的可重復(fù)的反應(yīng)提供了額外的例子。這些實(shí)驗(yàn)在3或4天中進(jìn)行，使用含量可能不同的真正的流出物。
表6在草甘膦加載階段3和4中GOX DNA以及mRNA水平
*ND＝未檢測(cè)在本實(shí)施例中，在相等的草甘膦加載量條件下所測(cè)定的gox DNA和mRNA水平是相近的。與之相反，gox DNA和mRNA PCR產(chǎn)物的豐度在反應(yīng)器B中隨著流入草甘膦的濃度從1000減至300mg/L而有所降低。
因此，實(shí)施例顯示gox DNA和mRNA水平與草甘膦降解活性相關(guān)。gox PCR產(chǎn)物的產(chǎn)生隨著草甘膦到反應(yīng)器的加載量的提高而增加(表5)。近一步，gox PCR產(chǎn)物的水平隨著草甘膦到實(shí)驗(yàn)室反應(yīng)器加載量的減少而降低(表6，反應(yīng)器B)。
進(jìn)行了一個(gè)實(shí)驗(yàn)，用于測(cè)定反應(yīng)于模擬的零mg/L溶解氧(DO)的系統(tǒng)擾動(dòng)或者過程干擾條件的gox DNA和mRNA水平。使用一種連續(xù)流動(dòng)實(shí)驗(yàn)室反應(yīng)器將DO濃度從4-5降至0mg/L，維持在0mg/L下24小時(shí)，并且隨后返回至正常的4-5mg/L的操作條件(見圖5)。反應(yīng)于系統(tǒng)擾動(dòng)，混有液體的反應(yīng)器的pH從8.0-8.3降至6.7，這同活性污泥微生物的生物活性的降低相一致。
在相同的實(shí)驗(yàn)中，在4小時(shí)后草甘膦從該反應(yīng)器中最初被檢測(cè)到并且在24小時(shí)后達(dá)到40mg/L的水平(圖6)。這些結(jié)果同氧氣在將草甘膦向AMPA的轉(zhuǎn)化中被GOX酶被利用的發(fā)現(xiàn)是一致的(US5463175)。盡管gox DNA豐度在本實(shí)驗(yàn)的最初2小時(shí)內(nèi)下降得很緩慢(圖7)，但gox mRNA豐度迅速下降；在10分鐘內(nèi)約降低了66％(圖8)。
這些數(shù)據(jù)支持，草甘膦降解活性的迅速改變是通過gox mRNA產(chǎn)生或者ABC的控制而受到調(diào)節(jié)，而且基于PCR的監(jiān)測(cè)手段可以迅速地檢測(cè)到生物處理效力的變化。在3-6小時(shí)的周期時(shí)間內(nèi)，通過對(duì)gox DNA豐度的測(cè)定而提供了負(fù)責(zé)GDA的微生物群的大小的定量估測(cè)，這可被認(rèn)為是測(cè)量草甘膦降解潛能。與之協(xié)同，通過對(duì)gox mRNA水平的測(cè)定而提供了gox基因表達(dá)的定量估測(cè)，這代表了負(fù)責(zé)GDA的微生物群在取樣時(shí)間點(diǎn)上所表達(dá)的GDA。這樣的數(shù)據(jù)可被用于將給定的gox DNA和RNA水平同給定的草甘磷處理能力相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的該實(shí)施方案所產(chǎn)生的結(jié)果，即，gox DNA豐度和gox mRNA表達(dá)水平，提供了一種主動(dòng)而非被動(dòng)的方法以用于草甘膦生物處理系統(tǒng)的過程控制。這樣的數(shù)據(jù)在本發(fā)明的該實(shí)施方案中預(yù)示了一個(gè)系統(tǒng)對(duì)于草甘膦的生物處理的能力，或者在其它的實(shí)施方案中預(yù)示了對(duì)于生物處理設(shè)備處理其它特異的目標(biāo)成分的能力。
實(shí)施例5對(duì)PIA降解的監(jiān)測(cè)在一個(gè)填入了處理含有N-膦酰甲基亞氨基二乙酸(PIA)的廢水的活性污泥的反應(yīng)器中明顯檢測(cè)到了gox DNA，PIA是gox蛋白的另一種底物。但是，在缺乏PIA的對(duì)照反應(yīng)器中并未檢測(cè)到gox DNA。因此，這些結(jié)果表明根據(jù)本發(fā)明的方面而進(jìn)行的基于PCR的監(jiān)測(cè)可不僅被用于檢測(cè)草甘膦的降解，還可以監(jiān)測(cè)PIA的降解。
實(shí)施例6氮/微量營(yíng)養(yǎng)物對(duì)GDA的影響的測(cè)定前人的研究已經(jīng)表明，添加氨可以在生物處理系統(tǒng)中提高草甘膦處理效力(Hallas et al.1992.Appl.Environ.Microbiol.581215-1219；Heitkamp et al.1992.Can.J.Microbiol.38921-928)。但是，直到如今仍沒有用于特異性測(cè)定氮對(duì)GDA的影響的方法，而且已經(jīng)觀察到的提高可能是由于促進(jìn)細(xì)菌硝化作用的間接影響或者直接增加了草甘膦降解性細(xì)菌的數(shù)量和/或活性所造成的。同樣還缺少用于特異性測(cè)定在有或者無氮(例如，以氨的形式)的情況下添加微量營(yíng)養(yǎng)物對(duì)GDA的影響的方法。
以實(shí)施例4中所述的方式應(yīng)用的本發(fā)明(即，提供了對(duì)含有諸如gox這樣的效應(yīng)基因的微生物的豐度和活性的測(cè)量)，將定量地顯示氨對(duì)于功能性草甘膦降解群的大小和/或活性的任何影響，而不是對(duì)于整個(gè)活性污泥微生物群落的影響。現(xiàn)有的常規(guī)方法不能提供如此詳細(xì)的信息，因此這些方法不能實(shí)現(xiàn)對(duì)控制過程的有效修飾。
以實(shí)施例4中所述的方式應(yīng)用的本發(fā)明，還可以定量地顯示微量營(yíng)養(yǎng)物的添加對(duì)于功能性草甘膦降解群的大小和/或活性的任何影響。然而，對(duì)于微量營(yíng)養(yǎng)物的添加，微量營(yíng)養(yǎng)物添加對(duì)于gox AMC和/或ABC的影響可在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)使用酵母提取物作為微量營(yíng)養(yǎng)物補(bǔ)充物而進(jìn)行初步估測(cè)——酵母提取物為維生素和微量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的一種常見來源。如果有利，進(jìn)行隨后的實(shí)驗(yàn)以評(píng)估添加商業(yè)化微營(yíng)養(yǎng)制劑對(duì)于大規(guī)模生物處理系統(tǒng)的效果。
實(shí)施例7毒性分子(或者任何抑制性因子)對(duì)GDA的影響類似地，本發(fā)明提供了一些方法，這些方法可被用于測(cè)試毒性物質(zhì)(或者任何抑制性因子)對(duì)于GDA的影響，并且測(cè)定毒性(或抑制)是由于細(xì)胞致死所導(dǎo)致還是由于對(duì)基因表達(dá)的總體效果所導(dǎo)致。毒性物質(zhì)可包括多種殺細(xì)胞化合物，包括氰化物中的任何一種。抑制性因子所包括的范圍甚廣，例如，pH、溫度、溶解氧、離子強(qiáng)度或者任何超出設(shè)計(jì)操作限之外的活性污泥關(guān)鍵參數(shù)。除效應(yīng)基因之外還可對(duì)某種對(duì)照管家基因進(jìn)行監(jiān)測(cè)以提供評(píng)估細(xì)胞健康的對(duì)照。本發(fā)明在該情況下的使用將為該毒性事件是否殺死細(xì)胞、普遍地影響細(xì)胞健康或者特異性地影響GDA途徑中基因的表達(dá)提供詳細(xì)的信息。
根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案而獲得的結(jié)果將有助于確定所需要的糾正措施，例如對(duì)已經(jīng)存在于系統(tǒng)中的GDA活性所必需的細(xì)菌進(jìn)行復(fù)蘇，或者向系統(tǒng)中補(bǔ)充額外數(shù)量的該細(xì)菌。
實(shí)施例8在連續(xù)流動(dòng)系統(tǒng)中監(jiān)測(cè)GDA在過去，已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了用于對(duì)有益于鑒定在活性污泥中建立并且維持適應(yīng)的草甘膦氧化劑的條件的多種方法。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面而實(shí)施的基于PCR的監(jiān)測(cè)將很大地增加這些方法的效力。
活性污泥方法已經(jīng)在草甘膦處理廢水的生物處理中起到了關(guān)鍵性的作用。相對(duì)于生活活性污泥，在用于處理草甘膦處理廢水的活性污泥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了不同的微生物群。一些工業(yè)分離株已被發(fā)現(xiàn)能夠利用廣泛的有機(jī)物質(zhì)(包括草甘膦)，這暗示了一個(gè)更為多樣的微生物類別。
現(xiàn)場(chǎng)研究中，用于在廢水生物處理系統(tǒng)的活性污泥中建立GDA的方法包括(1)填入來自于工業(yè)生物系統(tǒng)需氧蒸煮器的污泥，(2)填入含有高水平草甘膦的處理廢水流，以及(3)將濃縮的填料調(diào)理劑同提高的HRT(即，低F/M比例)相結(jié)合。這樣的現(xiàn)場(chǎng)研究部分受阻于取樣到測(cè)定之間所必需的延遲，以及在控制過程中作出有效改變(例如，通過調(diào)整MCRT、HRT、MLVSS、微生物群落結(jié)構(gòu)、溫度、pH、溶解氧、鹽濃度(例如磷酸鹽、硫酸鹽或者硝酸鹽)和/或活性污泥中的有機(jī)物濃度)的信息不足。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面而實(shí)施的基于PCR的監(jiān)測(cè)會(huì)顯著地增強(qiáng)所有這些方法的效力，特別是通過根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面而實(shí)施的控制過程的實(shí)現(xiàn)。例如，基于PCR的監(jiān)測(cè)可被用于在觀察流出物中的草甘膦之前評(píng)估對(duì)含草甘膦的廢水流的處理能力。高加載水平的含草甘膦的廢水流對(duì)于COD、BOD或者草甘膦去除所需的微生物活性通常是抑制性的。gox豐度和表達(dá)水平的測(cè)定值可以是處理高加載水平的草甘膦所需的GDA的迫近損失的預(yù)測(cè)。在一些生物處理系統(tǒng)中，gox mRNA轉(zhuǎn)錄水平與存在的gox DNA序列的比值(由gox SBC值所表示)在可以從最終流出物中測(cè)量草甘膦之前便降低。在對(duì)gox SBC值和可能出現(xiàn)在最終流出物中的草甘磷量之間隨時(shí)間的關(guān)系具有準(zhǔn)確了解的情況下，可對(duì)關(guān)鍵性控制參數(shù)進(jìn)行知情和有效的調(diào)整(例如，可通過降低流入水力加載速率而降低草甘膦加載速率，從而增加了水力存留時(shí)間)從而使存在于活性污泥之中的用于進(jìn)行草甘膦降解的微生物具有更長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間。
實(shí)施例9檢測(cè)程序化分批反應(yīng)器中的GDA半連續(xù)廢水處理操作，例如使用程序化分批反應(yīng)器進(jìn)行的處理，為一種時(shí)間導(dǎo)向的過程，該過程可在單個(gè)池中進(jìn)行。在許多情況下，相對(duì)于常規(guī)的活性污泥處理，使用程序化分批反應(yīng)器提供了對(duì)二級(jí)處理設(shè)計(jì)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。例如，提供強(qiáng)選擇壓力的操作策略可更容易地在這樣的系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)；在FILL、REACT、SETTLE、DRAW和IDLE方案中僅僅需要使用單個(gè)池(或者池序列)?；赑CR的監(jiān)測(cè)可極大地增強(qiáng)該方法的效力，特別是通過由基于PCR的方法所實(shí)現(xiàn)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和系統(tǒng)最優(yōu)化。
實(shí)施例10監(jiān)測(cè)固定化細(xì)胞系統(tǒng)中的GDA固定化細(xì)菌技術(shù)的一個(gè)特別具有吸引力的應(yīng)用是用于從大體積的液體廢水流中將低濃度的特定化學(xué)物質(zhì)“拭凈(polishing)”或者“最終清除”。特別地，固定化于填充床反應(yīng)器中的細(xì)菌已經(jīng)證明對(duì)于在釋放前從廢水中進(jìn)行低水平的活性除草劑的三級(jí)清除具有高效。正如連續(xù)流動(dòng)和利用了程序化分批反應(yīng)器活性污泥處理過程的情況，基于PCR的監(jiān)測(cè)將顯著增強(qiáng)固定化細(xì)菌系統(tǒng)的效力。
在此所引用的所有參考文獻(xiàn)和專利均在此特意全文引入作為參考。
序列表<110>孟山都技術(shù)有限公司D.B.卡森J.F.賴斯<120>廢水生物處理系統(tǒng)中基于PCR的監(jiān)測(cè)<130>49202_5<150>US60/285,846<151>2001-04-23<160>12<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>192<212>DNA<213>人蒼白桿菌LBAA株(OCHROBACTRUM ANTHROPI STRAIN LBAA)<220>PCR產(chǎn)物<223>由細(xì)菌產(chǎn)生<400>1gctcgtgacc ctcttgtttc ggcgttttat cgcgaacggt ggcgaattcg tatctgcgcg60tgtcatcggc tttgagactg aaggtagggc gcttaaaggc attacaacca cgaacggcgt120tctggccgtt gatgcagcgg ttgtcgcagc cggcgcacac tcgaaatcac ttgctaattc180gctaggcgat ga192<210>2<211>142<212>DNA<213>人蒼白桿菌LBAA株<220>PCR產(chǎn)物<223>由細(xì)菌產(chǎn)生<400>2gctcgtgacc ctcttgtttc ggcgttttat cgcgaacggt ggcgaattcg tatctgcgcg60tgtcatcggc tttgagactg aaggtagggc gcttaaaggc attacaacca cgaacggcgt120
tcgctaattc gctaggcgat ga 142<210>3<211>504<212>DNA<213>人蒼白桿菌LBAA株<220>PGR產(chǎn)物<223>由細(xì)菌產(chǎn)生<400>3aagaccaaac aaggtgaagg agcaggcgaa agcactccgc aatctcatca agtccacggt60gcctctgatc aagtcattgg cggaggaggc tgatgcgagc catctgatcc gccatgaagg120tcatctgacc gtatatcgtg gagaagcaga cttcgccaag gaccgcggag gttgggaact180gcggcgtctc aacggtgttc gcacgcagat cctcagcgcc gatgcgttgc gggatttcga240tccgaacttg tcgcatgcgt ttaccaaggg cattcttata gaagagaacg gtcacacgat300taatccgcaa gggctcgtga ccctcttgtt tcggcgtttt atcgcgaacg gtggcgaatt360cgtatctgcg cgtgtcatcg gctttgagac tgaaggtagg gcgcttaaag gcattacaac420cacgaacggc gttctggccg ttgatgcagc ggttgtcgca gccggcgcac actcgaaatc480acttgctaat tcgctaggcg atga 504<210>4<211>454<212>DNA<213>人蒼白桿菌LBAA株<220>PCR產(chǎn)物<223>由細(xì)菌產(chǎn)生<400>4aagaccaaac aaggtgaagg agcaggcgaa agcactccgc aatctcatca agtccacggt60gcctctgatc aagtcattgg cggaggaggc tgatgcgagc catctgatcc gccatgaagg120tcatctgacc gtatatcgtg gagaagcaga cttcgccaag gaccgcggag gttgggaact180gcggcgtctc aacggtgttc gcacgcagat cctcagcgcc gatgcgttgc gggatttcga240
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<213>人蒼白桿菌LBAA株<220>引物<223>由細(xì)菌產(chǎn)生<400>8gctcgtgacc ctcttgtttc 20<210>9<211>6<212>DNA<213>人蒼白桿菌LBAA株<220>引物<223>由細(xì)菌產(chǎn)生<400>9tcatcg6<210>10<211>19<212>DNA<213>未知<220>
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<213>未知<220>
<223>由細(xì)菌產(chǎn)生<400>12caggaaacag ctatgac1權(quán)利要求
1.一種優(yōu)化廢水處理系統(tǒng)的方法，該方法包括a.從一種廢水處理系統(tǒng)中進(jìn)行廢水取樣；b.從所述的樣品中收集固體；c.從所述的固體中分離DNA；d.從所述的固體中分離RNA；e.對(duì)所述的DNA實(shí)施定量PCR(qPCR)以測(cè)定指示基因豐度；f.對(duì)所述的RNA實(shí)施定量RT-PCR(qRT-PCR)以測(cè)定效應(yīng)基因的表達(dá)；其中該指示基因豐度相關(guān)于所述樣品的活性微生物含量(AMC)，其中該效應(yīng)基因的表達(dá)相關(guān)于所述樣品的活性生物除污物含量(ABC)，并且其中對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行擾動(dòng)，并且重復(fù)步驟a)至f)直至該AMC和ABC處于根據(jù)經(jīng)驗(yàn)所確定的最優(yōu)操作范圍內(nèi)。
2.一種優(yōu)化廢水處理系統(tǒng)的方法，該方法包括a.從一種廢水處理系統(tǒng)中進(jìn)行廢水取樣；b.從所述的樣品中收集固體；c.從所述的固體中分離DNA；d.從所述的固體中分離RNA；e.對(duì)所述的DNA實(shí)施競(jìng)爭(zhēng)性qPCR以測(cè)定指示基因豐度；f.對(duì)所述的RNA實(shí)施競(jìng)爭(zhēng)性RT-PCR以測(cè)定效應(yīng)基因的表達(dá)；其中該指示基因豐度相關(guān)于所述樣品的活性微生物含量(AMC)，其中該效應(yīng)基因的表達(dá)相關(guān)于所述樣品的活性生物除污物含量(ABC)，并且其中對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行擾動(dòng)，并且重復(fù)步驟a)至f)直至該AMC和ABC處于根據(jù)經(jīng)驗(yàn)所確定的最優(yōu)操作范圍內(nèi)。
3.一種優(yōu)化廢水處理系統(tǒng)的方法，該方法包括a.從一種廢水處理系統(tǒng)中進(jìn)行廢水取樣；b.從所述的樣品中收集固體；c.從所述的固體中分離DNA；d.從所述的固體中分離RNA；e.對(duì)所述的DNA實(shí)施競(jìng)爭(zhēng)性qPCR以測(cè)定gox基因豐度；f.對(duì)所述的RNA實(shí)施競(jìng)爭(zhēng)性qRT-PCR以測(cè)定gox基因的表達(dá)；其中該gox基因豐度相關(guān)于所述樣品的活性微生物含量(AMC)，其中該gox基因的表達(dá)相關(guān)于所述樣品的活性生物除污物含量(ABC)，并且其中對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)行擾動(dòng)，并且重復(fù)步驟a)至f)直至該AMC和ABC處于根據(jù)經(jīng)驗(yàn)所確定的最優(yōu)操作范圍內(nèi)。
4.一種用于在生物處理系統(tǒng)內(nèi)測(cè)定一種指示/效應(yīng)基因組合的豐度和表達(dá)水平的方法，該方法包括a.從生物處理系統(tǒng)的含微生物水流中收集微生物；b.從所述的微生物中分離DNA和mRNA；c.通過對(duì)所述的DNA進(jìn)行的qPCR分析而測(cè)定指示基因豐度的水平；d.通過對(duì)所述的mRNA進(jìn)行的qRT-PCR分析而測(cè)定效應(yīng)基因表達(dá)的水平；其中所述的指示基因與效應(yīng)基因相同，或者其中所述的指示基因不同于所述的效應(yīng)基因。
5.一種用于控制生物處理系統(tǒng)的方法，該方法包括a.對(duì)所述的生物處理系統(tǒng)的含微生物水流進(jìn)行取樣；b.從所述的樣品中收集微生物；c.從所述的微生物中分離DNA；d.從所述的微生物中分離RNA；e.通過對(duì)所述的DNA進(jìn)行的qPCR分析而測(cè)定所述樣品的活性微生物含量(AMC)值；f.通過對(duì)所述的RNA進(jìn)行的qRT-PCR分析而測(cè)定所述樣品的活性生物除污物含量(ABC)值；g.為所述的樣品設(shè)置一個(gè)目標(biāo)AMC值；h.為所述的樣品設(shè)置一個(gè)目標(biāo)ABC值；i.將所述的測(cè)定AMC值同所述的目標(biāo)AMC值進(jìn)行比較；j.將所述的測(cè)定ABC值同所述的目標(biāo)ABC值進(jìn)行比較；并且k.對(duì)控制過程進(jìn)行調(diào)整以使所述的測(cè)定AMC和ABC值更為接近于所述的目標(biāo)AMC和ABC值，同時(shí)重復(fù)步驟a)至步驟e)、i)和j)。
6.一種用于控制生物處理系統(tǒng)的方法，該方法包括a.對(duì)一種生物處理系統(tǒng)的含微生物水流進(jìn)行取樣；b.從所述的樣品中收集微生物；c.從所述的微生物中分離DNA；d.從所述的微生物中分離RNA；e.通過對(duì)所述的DNA進(jìn)行的qPCR分析和對(duì)所述的RNA進(jìn)行的qRT-PCR分析而測(cè)定比生物除污物含量(SBC)值；f.為所述的樣品設(shè)置一個(gè)目標(biāo)SBC值；g.將所述的測(cè)定SBC值同所述的目標(biāo)SBC值進(jìn)行比較；h.對(duì)控制過程進(jìn)行調(diào)整以使所述的測(cè)定SBC值更為接近于所述的目標(biāo)SBC值，同時(shí)重復(fù)步驟a)-e)和g)。
7.權(quán)利要求1-6的方法，其中所述的效應(yīng)基因選自gox、nahAc、pox、ditA1、merP、merT、amoA和mntA。
8.權(quán)利要求1-6的方法，其中所述的效應(yīng)基因?yàn)間ox。
9.權(quán)利要求5-6的方法，其中所述的調(diào)整控制過程選自調(diào)整平均細(xì)胞存留時(shí)間(MCRT)、水力存留時(shí)間(HRT)、混合液中的揮發(fā)性懸浮固體(MLVSS)、微生物群落結(jié)構(gòu)、溫度、pH、溶解氧濃度、鹽濃度、大量營(yíng)養(yǎng)物水平、微量營(yíng)養(yǎng)物水平以及有機(jī)化合物流入速率。
10.權(quán)利要求1-3的方法，其中所述的系統(tǒng)擾動(dòng)選自調(diào)整平均細(xì)胞存留時(shí)間(MCRT)、水力存留時(shí)間(HRT)、混合液中的揮發(fā)性懸浮固體(MLVSS)、微生物群落結(jié)構(gòu)、溫度、pH、溶解氧濃度、鹽濃度、大量營(yíng)養(yǎng)物水平、微量營(yíng)養(yǎng)物水平以及有機(jī)化合物流入速率。
11.權(quán)利要求1-3的方法，其中所述的廢水處理系統(tǒng)選自連續(xù)流動(dòng)活性污泥系統(tǒng)、程序化分批反應(yīng)器系統(tǒng)、填充床反應(yīng)器系統(tǒng)、固定化細(xì)菌系統(tǒng)、流化床反應(yīng)器系統(tǒng)、滴濾系統(tǒng)以及旋轉(zhuǎn)生物接觸器系統(tǒng)。
12.權(quán)利要求4-6的方法，其中所述的生物處理系統(tǒng)選自連續(xù)流動(dòng)活性污泥系統(tǒng)、程序化分批反應(yīng)器系統(tǒng)、填充床反應(yīng)器系統(tǒng)、固定化細(xì)菌系統(tǒng)、流化床反應(yīng)器系統(tǒng)、滴濾系統(tǒng)以及旋轉(zhuǎn)生物接觸器系統(tǒng)。
13.權(quán)利要求1、4、5或者6的方法，其中所述的qPCR為競(jìng)爭(zhēng)性的、非競(jìng)爭(zhēng)性的、動(dòng)力學(xué)qPCR或其組合，并且其中所述的qRT-PCR為競(jìng)爭(zhēng)性的、非競(jìng)爭(zhēng)性的、動(dòng)力學(xué)qRT-PCR或其組合。
全文摘要
用于廢水生物處理的系統(tǒng)中的基于PCR的微生物監(jiān)測(cè)。具體地，測(cè)定了指示/效應(yīng)基因或者基因組合的豐度和表達(dá)這兩者，其中“效應(yīng)”基因的表達(dá)相關(guān)于一種特定的微生物樣品的降解活性，而“指示”基因的豐度相關(guān)于微生物的豐度。效應(yīng)基因的表達(dá)通過競(jìng)爭(zhēng)性定量RT－PCR而進(jìn)行測(cè)量，指示基因的豐度通過競(jìng)爭(zhēng)性定量PCR而進(jìn)行測(cè)量。該指示基因和效應(yīng)基因可為相同或者不同的基因。在一個(gè)實(shí)施方案中，該指示基因和效應(yīng)基因?yàn)閬碜圆莞熟⒀趸€原酶(gox)基因的序列，并且該定量技術(shù)使用了競(jìng)爭(zhēng)性定量PCR和競(jìng)爭(zhēng)性定量RT－PCR。
文檔編號(hào)C02F3/00GK1531601SQ02812586
公開日2004年9月22日 申請(qǐng)日期2002年4月23日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月23日
發(fā)明者D·B·卡森, J·F·賴斯, D B 卡森, 賴斯 申請(qǐng)人:孟山都技術(shù)有限公司