專利名稱：一株硝基苯類污染物高效降解菌及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于污染物生物處理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一株高效降解硝基苯的細菌菌株(Pseudomonas sp.NJU001)，還涉及該菌株降解硝基苯類污染物的使用方法。
背景技術(shù)：
硝基苯是一種重要的化工原料，被廣泛應(yīng)用于制造苯胺、炸藥、潤滑劑、農(nóng)藥、及香料等的工業(yè)生產(chǎn)中。隨著人類工業(yè)生產(chǎn)的迅猛發(fā)展，大量的硝基苯進入到自然環(huán)境中 。據(jù)估計，每年全世界大概有一萬噸以上的硝基苯被排入環(huán)境。硝基苯是高毒性物質(zhì)，被人類皮膚吸收或從呼吸道吸入其蒸汽后，會引起中毒甚至致死，所以它被列于世界《環(huán)境優(yōu)先控制有毒有機污染物》的名單，世界各國對它在工業(yè)廢水中的合理排放有極其嚴(yán)格的限制。在我國，《工業(yè)污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定硝基苯的一級排放標(biāo)準(zhǔn)為2ppm，但是在生產(chǎn)過程中經(jīng)氣提裝置初步回收后的硝基苯廢水的濃度仍然高達100ppm，因此，研究行之有效的硝基苯廢水治理方法具有及其重要的現(xiàn)實意義。目前，在治理硝基苯廢水的方法中，氣提、萃取、吸附和氧化還原等方法均有處理效果差或效果雖好但成本太高的缺點。相比之下，生物降解是處理硝基苯廢水的較為經(jīng)濟而有效的方法，但對于高濃度的硝基苯廢水，則需要先進行稀釋然后才能用生物法處理。如果能培育出耐受高濃度硝基苯的降解菌，直接將它加入到降解體系中，使整個微生物體系對硝基苯的耐受力增強，無疑將大大降低處理費用。從硝基苯的分子結(jié)構(gòu)來看，苯環(huán)結(jié)構(gòu)的對稱性和穩(wěn)定性使它不易發(fā)生反應(yīng)，另外，硝基是強吸電子基團，它的存在使化合物的生物降解性更差。直到近20年來，國內(nèi)外才逐漸有關(guān)于降解硝基苯的純菌株的文獻報道。這些菌株分別屬于克雷伯氏菌屬(Klebsiella sp.)1、假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)1，2，3，4、芽胞桿菌屬(Bacillus sp.)1，3、微球菌屬(Micrococcussp.)3、葡萄球菌屬(Staphylococcus sp.)5、棒狀菌屬(Corynebacterium sp.)5、鏈球菌屬(Streptococcus sp.)5、叢毛單胞菌屬(Comamonas sp.)6、短桿菌屬(Brevibacterium sp.)7等(注1韋朝海等，硝基苯好氧降解的共基質(zhì)及生物協(xié)同作用，中國環(huán)境科學(xué)，2000，20(3)，241-244頁；2Nishino SF et al. Degradationof nitrobenzene by a Pseudomonas pseudoalcaligenes.Appl Environ Microbiol.1993，592520-2525；3馬汐平等，硝基苯好氧降解菌的馴化和篩選，遼寧大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，1998，25(4)384-388；4王競等，假單胞菌JX165及其完整細胞對硝基苯的好氧降解，中國環(huán)境科學(xué)，2001，21(2)144-147；5劉紅果等，硝基苯降解菌的分離、鑒定及其對硝基苯的降解，環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，1991，116-17；6Nishino SF et al.Oxidative pathway for the biodegradation of nitrobenzene byComamonas sp.strain JS765.Appl Environ Microbiol.1995，612308-2313；7周大石等，細菌降解硝基苯的研究，衛(wèi)生研究，1994，23(3)143-146)。在關(guān)于這些菌株的文獻報道中，硝基苯的初始濃度一般只有100～300ppm，而且它被細菌完全降解所需的時間偏長。對硝基苯的耐受濃度最高的菌株是文獻5中的三株菌，都能耐受1000ppm的硝基苯溶液，其中降解率最高的是葡萄球菌屬，它能將1000ppm的硝基苯在72h內(nèi)降解44％，但因為文獻未報道具體的接菌濃度，所以不能認(rèn)為這株菌對硝基苯的降解能力就一定是最強的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種降解硝基苯能力強、降解效率高、速率快、易于培養(yǎng)繁殖的細菌及使用方法。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明敘述如下本發(fā)明所提供的細菌是假單胞菌屬的一株，命名為NJU001菌株。通過構(gòu)建該菌株的基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹，發(fā)現(xiàn)它與Pseudomonas marginalis聚成一群，相似性為73％。雖然菌株NJU001與Pseudomonas marginalis聚為一群，但他們的相似度只有73％，說明這株菌具有獨特的遺傳特性。
所述菌株取自化工廠下水道底泥和廢水處理系統(tǒng)曝氣池的活性污泥，經(jīng)人工富集培養(yǎng)、分離純化得到。該菌種的形態(tài)特征為菌落形態(tài)表現(xiàn)為圓形、白色、隆起、表面濕潤光滑、邊緣整齊。菌苔濃稠。細菌呈細小的桿狀，菌體大小為(1.4μm～4.1μm)×(0.6μm～1.1μm)。其生理生化特征為革蘭氏染色陰性，不具運動性，葡萄糖氧化產(chǎn)酸，氧化酶陰性；接觸酶陽性；肉湯生長菌膜混濁。它的適宜生長條件為PH＝6.0-7.5；溫度為25-35℃；振蕩速率大于120r/min。它能以硝基苯為唯一碳源、氮源生長，將其徹底礦化成氨，二氧化碳，水和簡單的無機化合物。它能將400ppm的硝基苯在24h內(nèi)完全降解，對于796.5ppm的硝基苯在100h內(nèi)也能降解98％。該菌還能以2-氨基苯酚、鄰苯二酚、N-苯基羥胺、苯、對硝基甲苯、間二硝基苯、苯胺和苯酚為唯一碳源生長。將該菌株降解硝基苯的培養(yǎng)液直接乙?；幚?，通過GC-MS分析，確定出降解的主要中間產(chǎn)物是2-氨基苯酚，這說明該菌株對硝基苯的降解采用了文獻2中報導(dǎo)的還原途徑。
使用方法將保存在營養(yǎng)瓊脂斜面上的菌種移接到含0.5-2.5g/L蛋白胨的無機鹽培養(yǎng)基中，無機鹽培養(yǎng)基配方Na2HPO4·12H2O 3.5-4.0g/L，KH2PO40.5-1.5g/L，NaCl 2.5-3.5g/L，MgSO40.1-0.4g/L；pH6.0-8.0；溫度30℃；150r/min搖床培養(yǎng)1～2天，待觀察到明顯的混濁后，將此培養(yǎng)液按2％v/v轉(zhuǎn)接至100ppm硝基苯無機鹽培養(yǎng)基中，同法培養(yǎng)后，再次轉(zhuǎn)接至更高濃度的硝基苯無機鹽培養(yǎng)基中，重復(fù)這個活化菌種降解能力的過程至它能在24h內(nèi)將400ppm硝基苯降解完全為止，即可離心收集生長至穩(wěn)定期的菌體，用無菌無機鹽洗兩次，制成菌懸液備用。
四

圖1為NJU001菌株對不同初始濃度的硝基苯的降解曲線圖。
圖1中各條曲線代表不同的硝基苯初始濃度-■-236.3mg/l；-●-334.1mg/l；-▲-433.1mg/l；--510.9mg/l；-◆-605.4mg/l； --682.5mg/l；--796.5mg/l。
圖2為各降解參數(shù)在819.2ppm硝基苯的生物降解過程中的變化曲線圖。
各條曲線代表的意義為-■-硝基苯；-□-氨氮；-○-2-氨基苯酚；-●-濁度圖3為NJU001菌株對土壤中2-硝基聯(lián)苯的共代謝降解曲線圖。
圖4為NJU001菌株對硝基苯和對硝基苯酚的混合體系共代謝降解曲線圖。
圖4中實線為硝基苯，虛線為對硝基苯酚。
五、具體實施例具體實施例1將OD580nm＝0.367的假單胞菌菌懸液按2％(v/v)接種至不同初始濃度的硝基苯無機鹽溶液中，在150r/min，30℃搖床中振蕩培養(yǎng)，不同時間取樣，在高效液相色譜上測定培養(yǎng)液中硝基苯的殘留濃度，計算殘留百分率。實驗數(shù)據(jù)見圖1，它能將初始濃度為236.3，334.1，433.1，510.9，605.4，682.5ppm的硝基苯分別在12，16，24，28，42，55小時內(nèi)完全降解，對于796.5ppm的硝基苯在100h內(nèi)也能降解98％。說明該菌株能耐受高濃度的硝基苯，而且降解能力很強。
具體實施例2將OD580nm＝1.324的假單胞菌菌懸液按2％(v/v)接種至初始濃度為819.2ppm的硝基苯無機鹽溶液中，在150r/min，30℃搖床中振蕩培養(yǎng)。分別在0h、20h、45h、68h和91h取樣，測定底物硝基苯及中間產(chǎn)物2-氨基苯酚的濃度(以高效液相色譜法測)，氨氮含量(以納氏試劑光度法測)及OD580nm值。如圖2所示，91h時819.2ppm的硝基苯能被完全降解，與實施例1相比，降解速率更快，這是因為本例中接菌濃度增大的緣故。隨著硝基苯濃度的降低，細菌的濁度逐漸增長，說明硝基苯能給細菌的生長提供碳源，氮源和能源。降解中間產(chǎn)物2-氨基苯酚的濃度從起始的零逐漸增長至68h最高，之后又漸漸降低到不再被檢測到，說明它能被NJU001菌繼續(xù)生物轉(zhuǎn)化為其它物質(zhì)。91h時有69％的硝基苯被礦化為無機氨，另外31％的硝基苯被轉(zhuǎn)化成2-氨基苯酚之后的帶氨基的破環(huán)產(chǎn)物。
具體實施例3經(jīng)人工污染的東北黑土(有機質(zhì)含量3.35％)每克含2-硝基聯(lián)苯0.934mg，將它加入到含100ppm的硝基苯無機鹽溶液中(土水質(zhì)量比＝1∶10)，按2％(v/v)接種OD580nm＝1.746的菌懸液，在150r/mmin，30℃搖床中振蕩培養(yǎng)。不同時間取樣，用甲醇提取水-土兩相中的2-硝基聯(lián)苯，通過高效液相色譜測定提取液中2-硝基聯(lián)苯的濃度，計算其殘留百分率。如圖3所示，100ppm的硝基苯在2天內(nèi)被降解掉98.8％，22天后，2-硝基聯(lián)苯因為揮發(fā)等非生物因素?fù)p失了12.6％，接菌系列中它的濃度下降了43.4％，說明NJU001菌能在硝基苯存在下共代謝土壤中的2-硝基聯(lián)苯。
具體實施例4硝基苯和對硝基苯酚的混合體系中含硝基苯400mg/L、對硝基苯酚25mg/L至100mg/L不等，加入無機鹽溶液，按2％(v/v)接種OD580nm＝1.514的菌懸液，在150r/min，30℃搖床中振蕩培養(yǎng)。不同時間取樣，通過高效液相色譜測定提取液中硝基苯和對硝基苯酚的濃度，計算其殘留百分率。如圖4所示，含對硝基苯酚25mg/L的混合體系中硝基苯和對硝基苯酚在3天內(nèi)完全降解，含對硝基苯酚50mg/L和100mg/L的混合體系中，硝基苯完全降解，對硝基苯酚降解率也分別達到41.2％和23.9％，說明NJU001菌能在硝基苯存在下共代謝混合體系中的對硝基苯酚。
權(quán)利要求
1.一種高效降解硝基苯的細菌菌株的應(yīng)用方法，其特征在于將保存在營養(yǎng)瓊脂斜面上的菌種移接到含0.5-2.5g/L蛋白胨的無機鹽培養(yǎng)基中，無機鹽培養(yǎng)基配方Na2HPO4·12H2O 3.5-4.0g/L，KH2PO40.5-1.5g/L，NaCl 2.5-3.5g/L，MgSO40.1-0.4g/L；pH6.0-8.0；溫度30℃；150r/min搖床培養(yǎng)1～2天，待觀察到明顯的混濁后，將此培養(yǎng)液按2％v/v轉(zhuǎn)接至100ppm硝基苯無機鹽培養(yǎng)基中，同法培養(yǎng)后，再次轉(zhuǎn)接至更高濃度的硝基苯無機鹽培養(yǎng)基中，重復(fù)這個活化菌種降解能力的過程至它能在24h內(nèi)將400ppm硝基苯降解完全為止，即可離心收集生長至穩(wěn)定期的菌體，用無菌無機鹽洗兩次，制成菌懸液備用。
2.一種高效降解硝基苯的細菌菌株的應(yīng)用，其特征在于菌株的使用范圍包括含硝基苯類化合物廢水的處理和硝基苯類化合物污染土壤的處理；硝基苯類污染物是硝基苯、硝基聯(lián)苯、硝基苯酚。
全文摘要
本發(fā)明屬于污染物生物處理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種高效降解硝基苯類污染物的細菌及其使用方法。所用菌株為革蘭氏陰性菌，經(jīng)鑒定屬于假單胞菌屬。該菌株的主要形態(tài)特征為菌體呈細小的桿狀，大小為(1.4μm～4.1μm)×(0.6μm～1.1μm)。它能以硝基苯為唯一碳源、氮源和能源，能將433.1ppm的硝基苯在24h內(nèi)完全降解，對于796.5ppm的硝基苯在100h內(nèi)也能降解98％。該菌株的使用范圍包括含硝基苯類化合物廢水的處理和硝基苯類化合物污染土壤的處理。
文檔編號C02F3/32GK1570079SQ20031010641
公開日2005年1月26日 申請日期2003年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月25日
發(fā)明者高士祥, 邵云, 王燦, 蔡邦成 申請人:南京大學(xué)