專利名稱：耐氯菌株v430及篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種耐氯微生物及其篩選方法。
背景技術(shù)：
高鹽度難降解有機(jī)廢水，如石油開采、化工、制藥等廢水已經(jīng)成為環(huán)保水處理領(lǐng)域的世界性技術(shù)難題。而鹽酸法黃姜皂素生產(chǎn)廢水在高濃度含鹽難降解有機(jī)物廢水中具代表性。一方面，這類廢水成分復(fù)雜，難降解的有機(jī)物多，廢水的可生化性差；另一方面，廢水中的鹽含量高，氯離子濃度大，其混合廢水中氯離子濃度可達(dá)20000mg/L。目前，含鹽有機(jī)廢水采用非生物方法和生物方法，非生物方法由于其處理費(fèi)用高、處理效果不好，企業(yè)無法接受，生化法一直是水處理工藝中的首先方法，主要采用A-B兩段接觸氧化法，傳統(tǒng)活性污泥法，SBR法，生物濾池，厭氧濾池等，但是上述生物法大多只能處理含鹽量為3％以下的廢水，而對高鹽廢水(含鹽量5％，甚至20％)難以處理，因此需要特殊的微生物。近年來，國外已報(bào)道了有關(guān)選育耐鹽(NaCl)菌處理高鹽有機(jī)廢水的報(bào)道，而對皂素廢水這類高濃度有機(jī)物含量、高鹽(CaCl2)、含難降解物質(zhì)(皂素)復(fù)雜的廢水，至今還屬于研究之薄弱領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一株可處理含高濃度氯離子廢水的耐氯菌株V430及其篩選方法。
本發(fā)明所提供的耐氯菌株V430，為腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)V430CCTCC NO.M205145，已于2005年12月9日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號CCTCC NO.M205145。
所述的腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)V430 CCTCC NO.M205145的菌落形態(tài)菌落呈圓形，幼齡乳白色，老齡橘黃色，不透明；菌落突起、邊緣平滑；細(xì)胞球狀，d＝0.6～0.9μm單個(gè)或成對、成堆出現(xiàn)，無鞭毛；不運(yùn)動(dòng)，無內(nèi)生芽孢，革蘭氏陽性，厭氧；最適生長pH值6.0～7.5，生長溫度25-45℃；主要生化特征接觸酶陰性，氧化酶陰性，葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；不水解酪朊、明膠和淀粉；能降解果糖、甘露糖；能還原NO3-。
一株耐氯菌株V430的篩選方法，1)、菌膠團(tuán)的破碎取皂素廢水處理系統(tǒng)中的厭氧活性污泥，按厭氧活性污泥∶無菌水＝2g∶100ml的配比，加入事先滅菌好的裝有無菌水的三角瓶內(nèi)，并加入重量為無菌水0.01％的焦磷酸鈉，搖床振蕩，將菌膠團(tuán)打碎，得泥水混合物，備用；2)、耐氯離子優(yōu)勢菌種的分離利用無菌移液管吸取上述泥水混合物，按泥水混合物∶分離培養(yǎng)基＝0.5ml∶4.5ml的配比，加入分離培養(yǎng)基，25-45℃厭氧恒溫培養(yǎng)5-7天，待試管培養(yǎng)基變混濁，說明細(xì)菌已經(jīng)生長，然后平板稀釋涂布，挑取在菌落特征上有明顯差異的單菌，直至獲得單一菌株，并于斜面培養(yǎng)基上斜面保存；3)、耐氯離子優(yōu)勢菌種的篩選挑取上述分離出的單菌落，分別接種于篩選培養(yǎng)基內(nèi)，25-45℃厭氧恒溫培養(yǎng)5-7天，觀察菌懸液的混濁情況，變混濁的即為篩選出的耐高氯離子的菌株；經(jīng)過篩選，最后得到一株編號為菌株V430的菌株，即耐氯菌株V430。
分離培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；蒸餾水1000ml。
篩選培養(yǎng)基MgSO4·7H2O，0.2g/L，KH2PO40.5g/L，K2HPO41.5g/L，NH4Cl 0.5/L，CaCl2135g/L，1ml微量元素溶液，溶入1L皂素廢水(COD濃度為1000mg/L)，pH＝7.5；微量元素溶液FeCl3·6H2O 2g，CoCl22g，MnCl20.5g，CuCl20.03g，ZnCl20.05g，NiCl2.6H2O 0.05g，EDTA 1g，pH＝7.0。
擴(kuò)大培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；蒸餾水1000ml；CaCl218.0g/L。
SC培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；蒸餾水1000ml；CaCl2加入量為12.6g-140g。
斜面培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；磷酸二氫鉀2g；氯化銨1g；瓊脂20g；蒸餾水1000ml；CaCl218g/L，pH＝7.5。
以上培養(yǎng)基分別于121℃高壓滅菌30min后備用。
所述的一株腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)V430應(yīng)用于含高濃度氯離子廢水的處理方法為挑取腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)V430單菌落，于擴(kuò)大培養(yǎng)基中培養(yǎng)20-24小時(shí)，按培養(yǎng)后的腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)V430含高濃度氯離子廢水(如混合皂素廢水)的體積比為(1-4)∶50取腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)V430接種于含高濃度氯離子廢水(如混合皂素廢水)中，25-45℃恒溫厭氧培養(yǎng)，pH值為7.0-8.0，反應(yīng)3-5天。
所述的擴(kuò)大培養(yǎng)基為蛋白胨10g；牛肉膏5g；蒸餾水1000ml；CaCl218.0g/L，pH＝7.5。
本發(fā)明從皂素廢水處理系統(tǒng)中的活性污泥中分離、篩選到一株在高濃度氯離子條件下具有一定生長能力的新菌株。并對其耐氯能力進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，在高濃度氯離子條件下，耐氯菌株V430的耐氯能力好，范圍廣，能在[Cl-]為3000-75000mg/L時(shí)具有較好的生長能力。如果將其作為處理高鹽度的有機(jī)廢水的生物系統(tǒng)中的投加誘導(dǎo)菌，可以克服一般活性污泥的微生物受高氯離子的抑制、活性低、處理效率不高的缺點(diǎn)。由于在高氯離子(20000mg/L)環(huán)境中，傳統(tǒng)工藝的微生物受氯離子滲透壓的作用而使質(zhì)膜受損、代謝功能下降從而使處理效果降低，相比之下，如果生化系統(tǒng)中直接投加耐高氯離子并且具有良好降解性能的菌株，就能克服上述傳統(tǒng)工藝處理高濃度氯離子難降解有機(jī)廢水的缺點(diǎn)。
以含高鹽(CaCl2鹽)的難降解的高濃度有機(jī)廢水---皂素廢水為例，本發(fā)明研究了其降解有機(jī)污染物的效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株能有效去除皂素廢水中COD的能力，能在72小時(shí)之內(nèi)去除廢水中的COD約為50-60％。
本發(fā)明獲得的新菌株既可在含高濃度氯離子環(huán)境下生存、又可高效降解高濃度有機(jī)污染物。


圖1-1a是菌株V430菌株電鏡圖片圖1-1b是菌株V430菌株電鏡圖片圖1-1c是菌株V430菌株電鏡圖片圖1-2是菌株V430在液體不同氯離子濃度的SC培養(yǎng)基上生長情況1-3是菌株V430 PCR擴(kuò)增瓊脂糖電泳圖(1核DNA，2擴(kuò)增產(chǎn)物，MMarker)圖1-4a是菌株V430在高氯離子、高COD濃度下的下降解效率1-4b是菌株V430在高氯離子、高COD濃度下的下降解效率1-4c是菌株V430在高氯離子、高COD濃度下的下降解效率1-4d是菌株V430在高氯離子、高COD濃度下的下降解效率圖具體實(shí)施方式
一、一株耐氯菌株V430的篩選方法(一)、材料準(zhǔn)備1、菌源和實(shí)驗(yàn)廢水(1)菌源處理皂素廢水的生化系統(tǒng)中的活性污泥；(2)實(shí)驗(yàn)廢水(即混合皂素廢水)本實(shí)驗(yàn)廢水取自湖北省十堰市方坤置業(yè)有限公司皂素生產(chǎn)廢水；經(jīng)內(nèi)電解和CaO調(diào)配后，具體指標(biāo)為pH＝7.5-8.2，COD＝4000-17000mg/L，Cl-＝8000-30000mg/L，NH4-N 140-300mg/L。
2、培養(yǎng)基分離(完全)培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；蒸餾水1000ml。
篩選培養(yǎng)基MgSO4·7H2O，0.2g/L，KH2PO40.5g/L，K2HPO41.5g/L，NH4Cl 0.5/L，CaCl2135g/L，1ml微量元素溶液，溶入1L皂素廢水(COD濃度為1000mg/L)，pH＝7.5；微量元素溶液FeCl3·6H2O 2g，CoCl22g，MnCl20.5g，CuCl20.03g，ZnCl20.05g，NiCl2.6H2O 0.05g，EDTA 1g，pH＝7.0。
擴(kuò)大培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；蒸餾水1000ml；CaCl218.0g/L。
SC培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；蒸餾水1000ml；CaCl2加入量為12.6g-140g；當(dāng)CaCl2加入量為12.6g時(shí)，SC培養(yǎng)基內(nèi)[Cl-]＝10000mg/L。
斜面培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；磷酸二氫鉀2g；氯化銨1g；瓊脂20g；蒸餾水1000ml；CaCl218g/L，pH＝7.5。
以上培養(yǎng)基分別于121℃高壓滅菌30min后備用。
3、實(shí)驗(yàn)儀器和設(shè)備國華SHA-B恒溫振蕩器，SHH150G光照生物培養(yǎng)箱，臥式壓力蒸汽滅菌器，
WMX-1型微波密封消解COD速測儀，722S分光光度計(jì)，光學(xué)顯微鏡，pH計(jì)，超凈工作臺(tái)，鼓風(fēng)干燥箱，超薄切片機(jī)，日立H-7000FA投射顯微鏡，PTC200型PCR儀，電泳儀及電泳槽，凝膠紫外觀測儀等。
(二)、菌株的分離與篩選1、菌膠團(tuán)的破碎取2g皂素廢水處理系統(tǒng)中的厭氧活性污泥，加入事先滅菌好的裝有100ml無菌水的250ml的三角瓶內(nèi)，并加入重量為無菌水0.01％的焦磷酸鈉，搖床振蕩，將菌膠團(tuán)打碎，得泥水混合物，備用。
2、耐氯離子優(yōu)勢菌種的分離利用無菌移液管吸取0.5ml上述泥水混合物，加入分離培養(yǎng)基4.5ml，35℃厭氧恒溫培養(yǎng)5-7天，待試管培養(yǎng)基變混濁，說明細(xì)菌已經(jīng)生長，然后平板稀釋涂布，挑取在菌落特征上有明顯差異的單菌，直至獲得單一菌株，并于斜面培養(yǎng)基上斜面保存。
3、耐氯離子優(yōu)勢菌種的篩選挑取上述分離出的單菌落，分別接種于篩選培養(yǎng)基內(nèi)，35℃厭氧恒溫培養(yǎng)5天，觀察菌懸液的混濁情況，變混濁的即為篩選出的耐高氯離子的菌株。經(jīng)過篩選，最后得到一株編號為菌株V430的菌株，即耐氯菌株V430。耐氯菌株V430在加入不同濃度氯離子的液體SC培養(yǎng)基上生長情況如圖1-2所示(同時(shí)輔以[Cl-]＝3000mg/L時(shí)的OD600nm為對照值)。
二、耐氯微生物菌株鑒定1、對耐氯性能較強(qiáng)的菌株V430的鑒定對耐氯性能較強(qiáng)的菌株V430進(jìn)行了生理生化的鑒定以及16S rDNA分子的鑒定，從分子水平確定耐氯菌株的種屬。
16S rDNA序列分析主要按照以下步驟①細(xì)菌核DNA的提取，1)用高壓滅菌的牙簽挑單菌落接種于LB液管內(nèi)培養(yǎng)過夜，取1.5ml菌液于Eppendorf管內(nèi)，8,000rpm室溫離心5min，徹底除去上清。
2)加STE溶液1.5ml洗滌一次，離心棄上清，再加入0.6mlTE溶液，重懸細(xì)菌。
3)加30ul10mg/ml的溶菌酶，37℃水浴45min，4)加65μl 10％的SDS，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃水浴2小時(shí)，至溶液變清。
5)加入等積體酚氯仿抽提三次，直至看不到蛋白層為止。
6)在上清液中加入1/10體積的3M的NaAc(pH5.2)。
7)加入等體積的異丙醇，沉淀DNA。用玻璃棒纏繞挑出DNA細(xì)絲，在用70％的乙醇洗滌一次，自然涼干，并將DNA溶于100μl TE溶液中。
8)加入終濃度為50μg/ml的RNase，37℃，30min，去除RNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> ②16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增P1正向引物5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’P2反向引物5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’在50μL反應(yīng)體積中，加入1μL模板DNA(0.1μg)，0.5μLP1和P2(終濃度為0.5μM)，1μLdNTP(每種NTP0.2mM)，0.5μLTaq聚合酶(2U)和5μL 10×PCR緩沖液。PCR擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5min；在94℃變性30s，61-65℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)30次；最后72℃終延伸10min。
③PCR產(chǎn)物的回收將PCR產(chǎn)物以1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后，在紫外燈下切取含欲回收片段的凝膠，放入1.5ml離心管中加2倍體積TE，65℃水浴10分鐘后加等體積水飽和酚抽提一次離心后取上層水相再用酚-氯仿-異戊醇抽提一次，收集上清加0.1倍體積的10mol/L乙酸銨和2倍體積無水乙醇沉淀，離心，用70％乙醇洗沉淀一次，風(fēng)干后溶于適量滅菌雙蒸水。
④16S rDNA的全序列測定和分析P-fCACGACGTTGTAAAACGACAGTTTGATCCTGGCTC；P-rGGATAACAATTTCACACAGGAAGGAGGTGATCCAGCC。
加入1μL模板DNA(＜0.1μg)，PCR擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)(94℃ 1min，55℃ 30s，72℃2min)。采用ABI PRISM測序試劑盒中染料終止劑終止反應(yīng)。然后，在Applied Biosystem 373A DNA測序儀上測序。測得的16S rDNA序列采用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫比較分析，最終從分子水平上確定該菌的種屬。
2、16S rDNA序列測定本發(fā)明采用對16S rDNA序列測定和分析的方法對細(xì)菌進(jìn)行分子水平的鑒定。以細(xì)菌的核DNA為模板，以16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增的通用引物為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，(用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測)，如圖1-3所示。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后，測定其全序列。
<110>中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)<120>耐氯菌株V430的基因<160>1423<210>1<211>1423bp<212>DNA<213>腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)
<220>
<221>misc_feature<222>
<400>1GTACGATGCGGACAGCATATGGTGCGTCTCGTTCCTTTGCCGTCAGGGGCGGACGGCGCG60GTTCCATGTGGGTAACCTACCTATAAGACTGTTCTAACTCCGGGATACCGGGGCTAATGC120CGGATGGCATTAGAACCGGTTGCCCGGAGTGTGAAAGATGGTTTTGCTATCTCTTATACG180TGGACCCGCGCCGTATGAGGTAGTTGGTAAGGTAATGGCTTACCAAGGCAACGATACGTA240GCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAACTCTCTACGGG300AGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAG360TGATGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTATTAGGGAAGAACAAACGTGTAAGTAAC420TGTGCACGTCTTGACGGTACCTAATCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGC480GGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGCGG540TTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGA600GACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGAGATA660TGGAGGAACACCAGTGGCGAAAGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACGCTGATGTGCGAAA720GCGTGGGGATCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTA780AGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGG840GAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGAG900CATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAAATCTTGACATCCTTTGACCA960CTCTAGAGATAGAGTTTTCCCCTTCGGGGGACAAAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGT1020CAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTAAACTTAGT1080TGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGGTTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGG1140GATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGATTTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAA1200TACAAAGGGCAGCTAAACCGCGAGGTCATGCAAATCCCATAAAGTTGTTCTCAGTTCGGA1260TTGTAGTCTGCAACTCGACTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGTAGATCAGCATGC1320TACGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAA1380CACCCGAAGCCGGTGGAGTAACCATTAATGGAGCTAGCCGTCG 1423三、耐氯菌株V430的菌落形態(tài)、生理和生化特征見表1。細(xì)胞形態(tài)見圖1-1a、圖1-1b、圖1-1c。
表1菌株V430的菌落形態(tài)特征以及主要的生理特征


表中符號說明“+”90％以上的菌株為陽性，“-”90％以上的菌株為陰性四、菌株V430為新的菌株將菌株V430的16S rDNA基因序列與國際GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行網(wǎng)上同源性比較發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌V430與腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)多個(gè)菌株的同源性高達(dá)98-99％以上。綜合菌株V430的生理生化以及分子鑒定結(jié)果，可確定細(xì)菌V430為腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)，菌株V430命名為腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)V430(即耐氯菌株V430)，查閱有關(guān)資料，尚無腐生葡萄球菌屬有關(guān)高濃度氯離子條件下難降解有機(jī)廢水以及對其耐氯能力研究的報(bào)道。腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)V430為新的菌株，已于2005年12月9日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱CCTCC)，保藏號CCTCC NO.M205145。
本發(fā)明分離、篩選出的菌株V430，具有較好降解高濃度氯離子難降解皂素廢水的功能。這就拓寬了人們對腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)在其功能方面的應(yīng)用研究思路，并為降解含高濃度氯離子皂素廢水提供了有用的菌源和技術(shù)，具有較強(qiáng)的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
五、耐氯菌株V430的應(yīng)用1.取皂素生產(chǎn)混合廢水，稀釋3-5倍數(shù)，使其COD為5000mg/L，用CaCl2調(diào)節(jié)[Cl-]為2萬mg/L，取廢水50ml分別加入250ml的錐形瓶中，加入菌株V430的菌懸液1ml，25-45℃恒溫厭氧培養(yǎng)，pH值為7.5，反應(yīng)3-5天。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株能有效去除皂素廢水中COD的能力，能在5d之內(nèi)去除廢水中的COD約為50-60％。因素試驗(yàn)詳見圖1-4a、圖1-4b、圖1-4c、圖1-4d。
所述的擴(kuò)大培養(yǎng)基為蛋白胨10g；牛肉膏5g；蒸餾水1000ml；CaCl218.0g/L，pH＝7.5。
2.腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)V430降解皂素廢水的因素試驗(yàn)1)為了考察菌株V430在不同氯離子濃度下，對COD的去除效果，在廢水中加CaCl2調(diào)節(jié)氯離子濃度分別為9864.2、14980、21061、24780、30080mg/L。耐氯菌株V430去除效果結(jié)果如圖1-4a。
從圖1-4a可以看出，當(dāng)[Cl-]＝9864.2mg/L時(shí)，反應(yīng)時(shí)間為3d，菌株V430對COD的去除率僅為39.31％，但是隨著廢水中氯離子濃度的升高，菌株V430對COD的去除率增加，當(dāng)廢水中氯離子濃度達(dá)到2.5萬mg/L時(shí)，菌株V430對COD的去除率可達(dá)64.38％，并且菌株V430對COD的去除率隨著廢水中氯離子濃度的繼續(xù)增加而變化不大，當(dāng)廢水中氯離子濃度高達(dá)3萬mg/L時(shí)，菌株V430對COD的去除率仍保持在60％。
2)為了考察菌株在不同COD濃度下(6610.4、7906.4、11209.6、13420.0、16196.2mg/L)，對COD的去除效果，在廢水中加CaCl2調(diào)節(jié)氯離子濃度分別為20000mg/L。耐氯菌株V430去除效果結(jié)果如圖1-4b。通過實(shí)驗(yàn)可知當(dāng)廢水中[Cl-]＝20000mg/L、COD濃度達(dá)到1萬mg/L時(shí)，菌株V430對COD的去除率較好，可達(dá)62.37％。
3)從圖1-4c和1-4d可以看出，菌株V430對COD的去除率隨pH的增加先增加后下降，其最高去除率在pH為7.5-8時(shí)，達(dá)到62％。離心處理后的廢水，發(fā)現(xiàn)pH為7-8時(shí)，濕菌體量明顯高于pH為9、10、11時(shí)，可見在pH在中性時(shí)，有利于菌株的生長；當(dāng)接種量在1-4ml之間變化時(shí)，菌株V430對COD的去除率無明顯變化，基本為60％，當(dāng)接種量為1ml時(shí)，其去除率最好。這是因?yàn)榫甑纳L需要一定的營養(yǎng)物質(zhì)，當(dāng)菌懸液為1ml時(shí)，其需要的物質(zhì)容易得到滿足。
<110>中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)<120>耐氯菌株V430及篩選方法<160>1423<210>1<211>1423bp<212>DNA<213>腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)<220>
<221>misc_feature<222>
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1.一株耐氯菌株V430，其特征在于所述的菌株為腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)V430CCTCC NO.M205145。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株耐氯菌株V430，其特征在于所述的腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)V430 CCTCC NO.M205145的菌落形態(tài)菌落呈圓形，幼齡乳白色，老齡橘黃色，不透明；菌落突起、邊緣平滑；細(xì)胞球狀，d＝0.6～0.9μm單個(gè)或成對、成堆出現(xiàn)，無鞭毛；不運(yùn)動(dòng)，無內(nèi)生芽孢，革蘭氏陽性，厭氧；最適生長pH值6.0～7.5，生長溫度25-45℃；主要生化特征接觸酶陰性，氧化酶陰性，葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；不水解酪朊、明膠和淀粉；能降解果糖、甘露糖；能還原NO3-。
3.如權(quán)利要求1所述的一株耐氯菌株V430的篩選方法，其特征在于1)、菌膠團(tuán)的破碎取皂素廢水處理系統(tǒng)中的厭氧活性污泥，按厭氧活性污泥∶無菌水＝2g∶100ml的配比，加入事先滅菌好的裝有無菌水的三角瓶內(nèi)，并加入重量為無菌水0.01％的焦磷酸鈉，搖床振蕩，將菌膠團(tuán)打碎，得泥水混合物，備用；2)、耐氯離子優(yōu)勢菌種的分離利用無菌移液管吸取上述泥水混合物，按泥水混合物∶分離培養(yǎng)基＝0.5ml∶4.5ml的配比，加入分離培養(yǎng)基，25-45℃厭氧恒溫培養(yǎng)5-7天，待試管培養(yǎng)基變混濁，然后平板稀釋涂布，挑取在菌落特征上有明顯差異的單菌，直至獲得單一菌株，并于斜面培養(yǎng)基上斜面保存；3)、耐氯離子優(yōu)勢菌種的篩選挑取上述分離出的單菌落，分別接種于篩選培養(yǎng)基內(nèi)，25-45℃厭氧恒溫培養(yǎng)5-7天，觀察菌懸液的混濁情況，變混濁的即為篩選出的耐高氯離子的菌株；經(jīng)過篩選，最后得到一株編號為菌株V430的菌株，即耐氯菌株V430。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一株耐氯菌株V430的篩選方法，其特征在于分離培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；蒸餾水1000ml。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一株耐氯菌株V430的篩選方法，其特征在于篩選培養(yǎng)基MgSO4·7H2O，0.2g/L，KH2PO40.5g/L，K2HPO41.5g/L，NH4Cl 0.5/L，CaCl2135g/L，1ml微量元素溶液，溶入1L皂素廢水，皂素廢水的COD濃度為1000mg/L，pH＝7.5；微量元素溶液FeCl3·6H2O 2g，CoCl22g，MnCl20.5g，CuCl20.03g，ZnCl20.05g，NiCl2·6H2O 0.05g，EDTA 1g，pH＝7.0。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一株耐氯菌株V430的篩選方法，其特征在于斜面培養(yǎng)基蛋白胨10g；牛肉膏5g；氯化鈉；5g；磷酸二氫鉀2g；氯化銨1g；瓊脂20g；蒸餾水1000ml；CaCl218g/L，pH＝7.5。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種耐氯微生物及其篩選方法。一株耐氯菌株V430，其特征在于所述的菌株為腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)V430 CCTCC NO.M205145，已于2005年12月9日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號CCTCC NO.M205145。所述的腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)V430 CCTCC NO.M205145的菌落形態(tài)菌落呈圓形，幼齡乳白色，老齡橘黃色，不透明；菌落突起、邊緣平滑；細(xì)胞球狀，d＝0.6～0.9μm單個(gè)或成對、成堆出現(xiàn)，無鞭毛；不運(yùn)動(dòng)，無內(nèi)生芽孢，革蘭氏陽性，厭氧；最適生長pH值6.0～7.5，生長溫度25－45℃。它既可在含高濃度氯離子環(huán)境下生存、又可高效降解高濃度有機(jī)污染物。
文檔編號C02F3/34GK1900272SQ20061001813
公開日2007年1月24日 申請日期2006年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2006年1月10日
發(fā)明者信欣, 王焰新, 鮑建國, 劉慧 , 楊雪芬, 李平 申請人:中國地質(zhì)大學(xué)(武漢)