專利名稱：植物性纖維分解劑及使用它的植物性廢棄物的處理法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及植物性纖維分解劑及使用它的植物性廢棄物的處理法。詳細(xì)地說(shuō)，涉及使用從可以產(chǎn)生好氧性細(xì)菌纖維單胞菌屬、厭氧性細(xì)菌梭菌屬及/或植物性纖維分解酶的微生物中獲得的植物性纖維分解酶進(jìn)行的稻草和稻殼等的植物性廢棄物處理法。
背景技術(shù)：
稻子耕種或小麥生產(chǎn)、玉米和甘蔗等谷物生產(chǎn)、和豆類生產(chǎn)中，作為由排出的植物纖維形成的廢棄物的處理方法，有在田地焚燒的方法，在焚燒爐中通過(guò)重油或輕油等燃料焚燒的方法，或者在植物性廢棄物中混合鋸屑或米糠等堆積制成肥料的方法。然而，用焚燒爐處理的方法需要大量的燃料和運(yùn)輸費(fèi)，另外在田地焚燒的方法由于產(chǎn)生的煤煙引起環(huán)境污染(稻草公害)的問(wèn)題，所以正在討論要禁止焚燒處置。對(duì)植物性廢棄物的堆肥化所采取的方法有，通過(guò)植物性廢棄物中混合稻草或鋸屑、米糠等，散布熟石灰堆積在原野中使其自然腐蝕的方法；通過(guò)在切碎植物性廢棄物的破碎物中混合鋸屑、稻殼、雞糞等調(diào)節(jié)水分后，加入發(fā)酵菌或處理過(guò)的堆肥等，在容器中攪拌等進(jìn)行發(fā)酵堆肥化的方法。然而，隨著農(nóng)業(yè)的現(xiàn)代化和機(jī)械化，由于植物性廢棄物的堆肥化處理和達(dá)到熟化的期間長(zhǎng)所以具有不能實(shí)施的傾向。因此，該廢棄物盡管認(rèn)定是有效的資源但仍需要不斷地產(chǎn)業(yè)廢棄化。
作為前述以外的植物廢棄物的處理方法，有通過(guò)微生物的固定化物處理植物性廢棄物的方法。植物性廢棄物其結(jié)構(gòu)上的原因所以難分解，其主要原因是植物性廢棄物中的纖維素及/或半纖維素引起的。因此，為了處理植物性纖維有效地利用，作為第一階段，即使部分地水解這些纖維素及/或半纖維素也是必要的。作為分解這些纖維素和/或半纖維素的方法，已知有使用由多種菌混合物形成的稻桿等的分解劑的處理方法。特開平8-157285號(hào)公報(bào)中記載了將膠質(zhì)、纖維素或半纖維素中的至少一種通過(guò)霉菌類或細(xì)菌類生產(chǎn)的植物性纖維分解酶分解，制成液狀堆肥的植物性廢棄物的液狀堆肥化的方法。然而，該方法為確保處理廠必須設(shè)置處理設(shè)備，需要將植物性廢棄物輸送到該處理廠的勞動(dòng)力。特開平7-2613號(hào)公報(bào)中記載了在田地直接散布的農(nóng)藥用細(xì)菌制劑。但用該制劑的植物性廢棄物的分解從散布在田地到其效果發(fā)現(xiàn)之前，特別是到植物性廢棄物的腐敗熟化，需要很長(zhǎng)時(shí)間。這是因?yàn)橥ㄟ^(guò)增殖的微生物產(chǎn)生的植物性纖維分解酶植物性廢棄物得到分解的緣故，即，是因?yàn)橛迷撝苿┑闹参镄詮U棄物的分解必須要求土壤中該微生物的增殖。
在日本谷倉(cāng)地帶東北、北海道等寒冷地區(qū)中，為了有效地利用已存在的微生物制劑和石灰、氮制劑，該制劑投入田地的作業(yè)1次不充分，必須要2次。另外，在稻子耕種中不能分解的廢棄物通過(guò)植入田地后發(fā)酵產(chǎn)生氣體，阻礙苗的固定和根的生長(zhǎng)。
本發(fā)明的目的在于，解決現(xiàn)有技術(shù)中難于解決的前述處理費(fèi)用的問(wèn)題、能量問(wèn)題、環(huán)境問(wèn)題及處理需要的時(shí)間等問(wèn)題，不依賴于微生物的生存條件，并且不需要輸送含有植物性纖維的廢棄物的植物性廢棄物處理法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過(guò)提供不含有微生物、含有微生物產(chǎn)生的植物性纖維分解酶的植物性纖維分解劑，進(jìn)一步，通過(guò)提供作用于植物性廢棄物的該植物性纖維分解劑形成的植物性廢棄物處理法，解決了前述課題。
本發(fā)明的植物性纖維分解劑可以基于以下說(shuō)明的本發(fā)明的實(shí)施方式得到，另外，本發(fā)明的植物性廢棄物處理法也是可以基于以下本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行實(shí)施。以下，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地說(shuō)明。
具體實(shí)施例方式
所謂的本說(shuō)明書中的植物性纖維分解酶是，具有在土壤中分解植物性纖維作用的微生物產(chǎn)生的酶類，例如，可以舉出纖維素酶、キシラ一ゼ、果膠酶、木聚糖酶、支鏈淀粉酶、葡糖苷酶等。本說(shuō)明書中的微生物只要是產(chǎn)生植物性纖維分解酶的就不作特別的限制，優(yōu)選至少產(chǎn)生纖維素酶及/或木聚糖酶的微生物。例如，屬于纖維單胞菌屬(Cellulomonas)、桿狀菌屬(Bacillus)、纖維弧菌屬(Cellvibrio)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、生孢噬纖維菌(Sporocytophaga)、醋弧菌屬(Acetivibrio)、梭菌(Clostridium)、Bacteriodes、丁酸弧菌屬(Butyrivibrio)、密螺旋體(Treponema)、瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、鏈霉菌屬(Streptomyces)、高溫放線菌屬(Thermoactinomyces)、Thermonospola屬、毛殼菌屬(Chaetomium)、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、Myceliophthola、孢子絲菌屬(Spototrichium)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)、熱子囊菌屬(Thermoascus)、草根霉屬(Thielavia)、支頂孢屬(Acremonium)、Agricus屬、鏈格孢屬(Alternaria)、曲霉屬(Aspergillus)、球二孢屬(Botryodiplodia)、鐮孢屬(Fusarium)、耙菌屬(Irpex)、漆斑菌屬(Myrothecium)、鏈孢霉屬(Neurospora)、薄膜革菌屬(Pellicularia)、青霉屬(Penicillium)、Pestalotiopsis屬、灰側(cè)耳菌屬(Pleurotus)、多孔菌屬(Polyporus)、臥孔菌屬(Poria)、密孔菌屬(pycnoporus)、Pyricularia屬、根霉屬(Rhizopus)、裂褶菌屬(Schizophyllum)、小核菌屬(Sclerotium)、Scytalidium屬、Termitomyces屬、栓菌屬(Trametes)、木霉屬(Trichoderma)等的微生物，可以舉出產(chǎn)生植物性纖維分解酶的微生物。這些微生物中，優(yōu)選屬于纖維單胞菌屬或梭菌屬的微生物產(chǎn)生的植物性纖維分解酶，進(jìn)一步優(yōu)選纖維單胞菌屬產(chǎn)生的植物性纖維分解酶。作為具體的優(yōu)選種，可舉纖維單胞菌sp.K32A(通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所中的委托號(hào)FERM BP-6766，保藏日期1999年6月25日，分類命名Cellulomonas sp.K32A)菌株及噬纖維梭菌(Clostridiumcellulovorans)ATCC 35296菌株。從在田地具有植物性纖維分解酶功能來(lái)看，植物性纖維分解酶優(yōu)選中溫菌產(chǎn)生的。這里的中溫菌是指在高溫區(qū)域(55℃以上)和在低溫區(qū)域(0℃以下)均不能增殖的微生物。另外，因?yàn)榭梢酝ㄟ^(guò)纖維素酶或木聚糖酶活性法測(cè)定(Walfgang，H.，Analitical Biochem.，第164卷，72～77頁(yè)，1987年；Wood，T.M.等，Methods of Enzymology，第160卷，87～112頁(yè)，1988年)，所以本領(lǐng)技術(shù)人員可以適宜選擇產(chǎn)生植物性纖維分解酶的適當(dāng)?shù)奈⑸?。進(jìn)一步，作為本說(shuō)明書中的植物性纖維分解酶也包括，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)制作含有微生物產(chǎn)生的植物性纖維分解酶基因的微生物或培養(yǎng)細(xì)胞等的轉(zhuǎn)化體，培養(yǎng)該轉(zhuǎn)化體得到的酶。
在植物性纖維分解酶中存在從植物性纖維末端分解的外源酶和從纖維內(nèi)部分解的內(nèi)源酶。本發(fā)明中這兩種植物性纖維分解酶都優(yōu)選。作為本發(fā)明中的植物性纖維分解酶優(yōu)選在10℃～60℃，更優(yōu)選在15℃～55℃具有酶活性的酶。酶活性可以用本領(lǐng)域技術(shù)人員周知的方法測(cè)定。例如纖維素酶、キシラ一ゼ、內(nèi)源葡聚糖酶活性及木聚糖酶活性等的植物性纖維分解酶也可以用前述的現(xiàn)有方法(Walfgang，H.，1987年Analitical Biochem.，第164卷，72頁(yè)～77頁(yè)；Wood，T.M.等Methods of Enzymology，第160卷，87～112頁(yè)，1988年)測(cè)定。
本說(shuō)明書中的植物性纖維分解劑是指含有前述植物性纖維分解酶的植物性纖維分解劑，特別優(yōu)選含有纖維素酶及/或木聚糖酶中的至少一種。該分解劑的形狀不作特別的限定，例如可以是液狀、粉末狀或顆粒狀等。另外，該分解劑優(yōu)選含有前述的內(nèi)源型和外源型這二者的酶。植物性纖維分解劑通過(guò)培養(yǎng)可產(chǎn)生前述植物性纖維分解酶的微生物得到。該微生物的培養(yǎng)在使用適合各自的微生物的培養(yǎng)基，適合的條件下實(shí)施。它們的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員適宜選擇及設(shè)定。例如，作為培養(yǎng)基的碳源，可以使用濾紙、纖維素粉末等各種纖維質(zhì)原料，作為氮源，可以使用硫酸銨、硝酸銨、醋酸銨等胺鹽，硝酸鹽及蛋白胨、肉提取物、玉米浸液、玉米麩質(zhì)粗粉、棉籽油、脫脂大豆等有機(jī)物。也可以添加其他的微量的無(wú)機(jī)金屬類、維生素類、生長(zhǎng)促進(jìn)因子，例如添加含有硫銨、生物素的酵母提取物等。這些培養(yǎng)基成分只要在不阻礙微生物發(fā)育的濃度內(nèi)就可以，碳源通常使用0.025～0.5重量％較合適。氮源通常使用0.05～1重量％較合適。培養(yǎng)基通常調(diào)整在pH6.5～8.5，滅菌后使用。培養(yǎng)溫度的范圍只要是微生物能發(fā)育的溫度就可以，可以通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員適宜設(shè)定。液體培養(yǎng)，例如培養(yǎng)好氧性微生物時(shí)，可以使用前述培養(yǎng)基在通常的振搖培養(yǎng)或通氣攪拌培養(yǎng)下進(jìn)行。培養(yǎng)厭氧性微生物時(shí)，液體培養(yǎng)也是用通常的方法，例如通過(guò)在前述培養(yǎng)基上添加適當(dāng)濃度的還原劑保持在低的氧化還原電位，在20～40℃振搖培養(yǎng)24小時(shí)～1周來(lái)進(jìn)行。作為還原劑，可以使用0.03～0.05％L-半胱氨酸鹽酸、0.01～0.2％巰基乙酸鈉、0.001％甲醛次硫酸鈉或0.1％抗壞血酸。為了得到酶，培養(yǎng)到作為培養(yǎng)基的碳源的所使用物例如破碎的濾紙消失為止。
培養(yǎng)結(jié)束后，由培養(yǎng)上清或者通過(guò)離心分離或過(guò)濾培養(yǎng)上清得到粗酶液，可以使用這些培養(yǎng)上清或粗酶液作為本發(fā)明的植物性纖維分解劑?；蛘?，可以是通過(guò)超濾法對(duì)培養(yǎng)上清濃縮的濃縮物，也可以是通過(guò)適當(dāng)采用硫銨鹽析法、溶劑沉淀法、透析法或冷凍干燥法等常法的粗酶粉末。另外，也可以將通過(guò)在粗酶液中加入アビセル等纖維素使纖維素酶活性成分等吸附后溶出吸附的成分得到的精制酶液作為植物性分解劑使用。
本說(shuō)明書中的植物性廢棄物是，稻子耕種或小麥生產(chǎn)、玉米、甘蔗等谷物、豆類或薯類等生產(chǎn)中排出的含有植物性纖維的廢棄物。具體來(lái)說(shuō)，作為植物性廢棄物，例如有稻草、稻殼、麥桿、甘蔗渣(甘蔗榨完的粕、玉米芯)及薯類的蔓等，進(jìn)一步有落葉和木片等。
本說(shuō)明書中的植物性廢棄物處理法，除了使用前述植物纖維分解劑以外，不作特別的限制，例如，可以對(duì)農(nóng)作物收獲后殘留在田地的植物性廢棄物通過(guò)直接散布植物性纖維分解劑在野外實(shí)施。從使植物性纖維分解劑高效率起作用的觀點(diǎn)看，在該分解劑發(fā)生作用前預(yù)先破碎植物性廢棄物較好。作為植物性廢棄物的破碎法，可舉例如通過(guò)コンバ亻ン收獲的同時(shí)切斷稻稈等的方法，使用鎖鋸等切斷樹木的方法，使用對(duì)樹木薄片化的破碎裝置的破碎方法，或者通過(guò)設(shè)置了粉碎器具或切斷用刃的處理裝置裁斷和粉碎的方法。另外，植物性廢棄物處理優(yōu)選在20℃～50℃的溫度條件下實(shí)施。在利用大棚栽培等溫室下使用本發(fā)明的植物性纖維分解劑時(shí)，優(yōu)選室內(nèi)加溫到40℃～50℃。在野外的一般田地中，也可與市售的微生物制劑、石灰氮制劑等犁入劑，有機(jī)質(zhì)肥料，化學(xué)肥料，堆肥和/或土壤改良劑并用。
實(shí)施例以下，舉實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行說(shuō)明，本發(fā)明并不限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1在纖維單胞菌sp.K32A的前培養(yǎng)中使用50mL的L-Broth(酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化納5g/L)。在該前培養(yǎng)基中接種該K32A的單菌落，用旋轉(zhuǎn)振蕩機(jī)(商品名G10 Gyrotory shaker，New Brunswick scientific制)在37℃振蕩培養(yǎng)(250rpm，振幅10mm)一夜，進(jìn)行前培養(yǎng)，得到前培養(yǎng)液。然后，使用添加了0.05％アビセル(商品名)的1/5PYT培養(yǎng)基(酵母提取物1g/L，胰化蛋白胨1g/L，蛋白胨1g/L)250mL作為本培養(yǎng)的培養(yǎng)基，在該本培養(yǎng)培養(yǎng)基中接種1％前培養(yǎng)液，37下振蕩培養(yǎng)(250rpm，振幅10mm)，進(jìn)行本培養(yǎng)(約72小時(shí))，直到基質(zhì)アビセル消失。培養(yǎng)結(jié)束后，離心分離(6000rpm，10分鐘)，得到培養(yǎng)上清。過(guò)濾滅菌培養(yǎng)上清，加入硫酸銨(80％)直到飽和為止，沉淀上清中的蛋白質(zhì)。將沉淀的蛋白質(zhì)溶解在50mM嗎啉丙烷磺酸(以下，簡(jiǎn)稱為MOPS)、10mM CaCl2和1mM NaN3的緩沖液，透析，將其作為粗酶液。調(diào)制的粗酶液中的蛋白質(zhì)濃度為2mg/mL。
在該粗酶液5mL中加入作為基質(zhì)的1g稻草或稻殼，在表1和表2記載的溫度下分別反應(yīng)72小時(shí)或1周。反應(yīng)結(jié)束后離心(3500rpm，2000×g下15分鐘)，在得到的沉淀物中加入滅菌水，用離心機(jī)(商品名KN-70，クボタ制)離心(3500rpm，15分鐘)，洗滌3次，冷凍干燥后用天平測(cè)定沉淀物的重量。將從初期重量中減去反應(yīng)后重量的重量占初期重量的百分率作為除去率。結(jié)果示于表1和表2。
表1

表2

實(shí)施例2在含有10mM CaCl2和1mM NaN3的50mM MOPS緩沖液(pH7.0)中加入作為基質(zhì)的1％稻殼50mL中，作為蛋白質(zhì)質(zhì)量，加入實(shí)施例1得到的K32A的粗酶液1mg，在50℃下保溫24小時(shí)。保溫后，離心分離，冷凍干燥沉淀成分，將干燥重量與對(duì)照組(沒(méi)有加粗酶液)進(jìn)行比較。其結(jié)果，加入粗酶液的重量與對(duì)照組比較減少了30～32％。通過(guò)目視觀察離心分離前的溶液時(shí)，觀察到稻殼一部分溶解。
實(shí)施例3在添加0.1％磷酸處理過(guò)的アビセル?yún)捬跽{(diào)制的1/5PTY培養(yǎng)基250mL中接種噬纖維梭菌(ATCC 35296)的單菌落，在37℃下振蕩培養(yǎng)(250rpm，振幅10mm)，培養(yǎng)約72小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后，離心分離(6000rpm，10分鐘)，得到培養(yǎng)上清。然后，過(guò)濾滅菌培養(yǎng)上清，加入硫酸銨(80％)直到飽和為止，沉淀上清中的蛋白質(zhì)。將沉淀的蛋白質(zhì)溶解在50mM磷酸-12mM檸檬酸緩沖液中，透析，將其作為粗酶液。調(diào)制的粗酶液中的蛋白質(zhì)濃度為2mg/mL。
在該粗酶液5mL中加入基質(zhì)1g稻草或稻殼，在表3和表4記載的溫度下分別反應(yīng)72小時(shí)或1周。反應(yīng)結(jié)束后離心(3500rpm，2000×g下15分鐘)，在得到的沉淀物中加入滅菌水，用離心機(jī)(商品名KN-70，クボタ制)離心(3500rpm，15分鐘)，洗滌3次，冷凍干燥后用天平測(cè)定沉淀物的重量。將從初期重量中減去反應(yīng)后重量的重量占初期重量的百分率作為除去率。結(jié)果示于表3和表4。
表3

表4

本發(fā)明提供一種用比現(xiàn)有技術(shù)少的勞動(dòng)力處理植物性廢棄物的有效的植物性廢棄物處理法。采用本發(fā)明，可以在田地等野外處理植物性廢棄物，可以解決現(xiàn)有技術(shù)中難于解決的前述處理費(fèi)用的問(wèn)題、能量問(wèn)題、環(huán)境問(wèn)題及處理需要的時(shí)間等問(wèn)題，不依賴于微生物的生存條件處理植物性纖維廢棄物。
權(quán)利要求
1.在田地中使用的植物性纖維分解劑，所述植物性纖維分解劑中不含有微生物、含有微生物產(chǎn)生的植物性纖維分解酶，前述微生物是纖維單胞菌屬(Cellulomonas)sp.K32A菌株，保藏編號(hào)為FERM BP-6766，或是噬纖維梭菌(Clostridiumcellulovorans)ATCC 35296菌株。
2.植物性廢棄物處理法，其特征在于，所述方法包括將含有微生物產(chǎn)生的植物性纖維分解酶的權(quán)利要求1所述的植物性纖維分解劑在田地中作用于植物性廢棄物。
3.權(quán)利要求2所述的處理法，其中，植物性廢棄物選自稻草、稻殼、麥桿、甘蔗渣、薯類的蔓、落葉或木片。
4.權(quán)利要求2所述的處理法，其包括在前述植物性纖維分解劑作用前破碎植物性廢棄物的工序。
5.權(quán)利要求2所述的處理法，其在20℃～50℃的溫度條件下實(shí)施。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物性纖維分解劑及使用它的植物性廢棄物的處理法。本發(fā)明提供一種不含有微生物、而含有微生物產(chǎn)生的植物性纖維分解酶，及簡(jiǎn)便處理該廢棄物的方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中難于解決的前述處理費(fèi)用的問(wèn)題、能量問(wèn)題、環(huán)境問(wèn)題及處理需要的時(shí)間等問(wèn)題。
文檔編號(hào)B09B3/00GK101029305SQ200610071920
公開日2007年9月5日 申請(qǐng)日期2001年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月10日
發(fā)明者亦野浩 申請(qǐng)人:株式會(huì)社美你康