專利名稱：：采用棉稈高得率漿廢液生物轉(zhuǎn)化菌種n4修復(fù)硝酸鹽污染土壤的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種采用棉稈高得率漿廢液生物轉(zhuǎn)化菌種N4修復(fù)硝酸鹽污染土壤的方法。技術(shù)背景據(jù)報道，人體攝入的硝酸鹽81.2%來自蔬菜，因此，降低蔬菜硝酸鹽積累技術(shù)的研究已成為當(dāng)前人們越來越關(guān)注的熱點(diǎn)。蔬菜是一種容易富集硝酸鹽的作物，農(nóng)民為了獲得高產(chǎn)而過量施用氮肥，導(dǎo)致硝酸鹽積累、蔬菜品質(zhì)下降。一般土壤的硝酸鹽含量高，則蔬菜的硝酸鹽含量也高，反之亦然，但兩者之間不存在一一對應(yīng)的關(guān)系，因此，控制土壤中硝酸鹽的積累是一個迫切問題。生物修復(fù)技術(shù)是解決環(huán)境污染、恢復(fù)被人類活動破壞的生態(tài)系統(tǒng)、實現(xiàn)人類社會可持續(xù)發(fā)展的重要手段之一。近年來，我國生物修復(fù)技術(shù)研究與應(yīng)用蓬勃發(fā)展，取得了顯著成績。其內(nèi)容主要包括微生物修復(fù)技術(shù)、重金屬污染的植物修復(fù)技術(shù)。與理化修復(fù)方法相比具有投資少、對環(huán)境影響小的優(yōu)點(diǎn)。通過實驗表明，在相同施肥水平下，與無機(jī)微肥或EDTA微肥相比，木質(zhì)素螯合微肥均能降低生菜硝酸鹽含量，其中沙培比土培下降的程度更大。土培沖施木質(zhì)素螯合微肥盆栽生菜后，土壤酸化程度低，土壤鹽分下降，銨態(tài)氮、有效磷、有效鉀及有機(jī)質(zhì)均有一定程度提高，土壤肥力增強(qiáng)，有利于無公害蔬菜生產(chǎn)。作為非木材纖維原料，棉稈在造紙工業(yè)中日益受到青睞，而棉稈廢液的污染治理是制約棉稈制漿造紙的"瓶頸"。棉稈機(jī)械漿廢液富含多糖、果膠、蛋白等多種營養(yǎng)物質(zhì)，是微生物可以直接利用的天然培養(yǎng)基，為其生物轉(zhuǎn)化提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。根據(jù)棉桿機(jī)械漿廢液中含有的污染物種類，探討通過生物轉(zhuǎn)化的途徑，使含有大量的纖維素及其分解產(chǎn)生的低分子量的半纖維素、甲醛、醋酸、乙酸、多糖、果膠、蛋白等多種營養(yǎng)物質(zhì)的廢液作為一種天然的微生物培養(yǎng)基培養(yǎng)有益微生物——異養(yǎng)硝化菌N4，達(dá)到廢液資源化的目的，并將其用于污染土壤的生物修復(fù)，最終實現(xiàn)循環(huán)經(jīng)濟(jì)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種采用棉稈高得率漿廢液生物轉(zhuǎn)化菌種N4修復(fù)硝酸鹽污染土壤的方法，通過本方法所培養(yǎng)出的轉(zhuǎn)化菌種N4可有效用于污染土壤的生物修復(fù)。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的一種采用棉稈高得率漿廢液生物轉(zhuǎn)化菌種N4修復(fù)硝酸鹽污染土壤的方法，修復(fù)方法包括原位修復(fù)法及異位修復(fù)法。而且，所述采用原位修復(fù)法的方法是在硝酸鹽污染的農(nóng)田土壤、河流底泥、果園土壤按照投菌量為3.OX10lfl個/kg投加N4菌，30天再投加一次以保持N4菌含量。而且，所述采用異位修復(fù)法的方法是挖掘硝酸鹽污染的土壤，按照投菌量為3.0Xl(T個/kg投加N4菌，30天再投加一次以保持N4菌含量。而且，所述N4菌的制備方法是(1).原料廢液準(zhǔn)備:原料廢液為棉稈作為造紙原料的APMP制漿后的擠出液，其C0D為43000mg/L，pH值為7-8，色度在30000倍以上；(2).菌種選擇菌種N4是從經(jīng)過取樣馴化、劃線分離、菌種篩選、劃線純化后得到的一種異養(yǎng)硝化菌，該N4菌的菌落特征圓形、白色、邊緣規(guī)則、濕潤、中間有突起；形態(tài)球狀；菌落大小(p=l2mm;(3).原料廢液培養(yǎng)基將原料廢液稀釋5倍，滅菌后調(diào)節(jié)pH值在6.5-7.5;(4).N4菌培養(yǎng)將原料廢液培養(yǎng)基滅菌后調(diào)節(jié)pH為6.5-7.5，接種0D,值為2.0的N4菌母液，置于26-30°C、200r/min的恒溫空氣搖床中振蕩培養(yǎng)，3-4h后用血球板計算菌數(shù)；(5).在原料廢液培養(yǎng)基中接種5%的附菌，進(jìn)行搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度在2535。C,初始pH為6.57.5，每隔4h用血球板做菌的計數(shù)，即可獲得棉稈高得率漿廢液生物轉(zhuǎn)化菌種N4。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是1.本發(fā)明采用棉稈高得率槳廢液生物轉(zhuǎn)化菌種N4對硝酸鹽土壤進(jìn)行修復(fù)，該N4菌能在土壤環(huán)境中發(fā)生反硝化反應(yīng)去除硝態(tài)氮，廢液和普通培養(yǎng)基這兩種培養(yǎng)方式對N4菌降解硝態(tài)氮沒有影響。投菌30d后土壤中的硝態(tài)氮含量就低于或接近正常值，這對于降低種植地土壤中硝態(tài)氮的本底值，進(jìn)而降低蔬菜中硝酸鹽殘留有重要的意義；且N4菌能夠使土壤中硝態(tài)氮降解的同時銨態(tài)氮含量略有提高，對促進(jìn)植物的生長起到一定的積極作用。2.本發(fā)明對造紙廢液進(jìn)行資源化利用的研究，將使棉花種植中的棉稈處置提高到農(nóng)業(yè)資源的綜合利用水平，并以生物技術(shù)對目前我國農(nóng)業(yè)普遍存在的土壤肥力和農(nóng)作物品質(zhì)下降、環(huán)境污染加劇等問題提出一種新的解決途徑。特別是在我國經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展、人口急劇膨脹和城市化進(jìn)程加快等因素造成的環(huán)境保護(hù)壓力加大和土地資源減少的形勢下，廢棄物資源化和污染土壤的修復(fù)就顯得尤為迫切，對造紙廢液進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)化物應(yīng)用于農(nóng)田的生物修復(fù)在解決我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的實際問題方面具有較大的科學(xué)價值和應(yīng)用潛力。3.本發(fā)明通過生物轉(zhuǎn)化方法，使含有大量的纖維素及其分解產(chǎn)生的低分子量的半纖維素、甲醛、醋酸、乙酸、多糖、果膠、蛋白等多種營養(yǎng)物質(zhì)的廢液作為一種天然的微生物培養(yǎng)基培養(yǎng)有益微生物——異養(yǎng)硝化菌N4，達(dá)到廢液資源化的目的，并將其用于污染土壤的生物修復(fù)，最終實現(xiàn)循環(huán)經(jīng)濟(jì)。研究結(jié)果表明，棉桿機(jī)械漿廢液具有較高的可利用價值，用廢液培養(yǎng)的N4菌液可明顯降低土壤中的硝態(tài)氮，對于控制蔬菜種植地的硝酸鹽污染有非常重要的意義，其生物轉(zhuǎn)化物用于農(nóng)田生物修復(fù)是一條循環(huán)經(jīng)濟(jì)發(fā)展路子，具有很大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益前景。圖l為本發(fā)明在不同處理方式下土壤中硝態(tài)氮的降解情況曲線圖；圖2為本發(fā)明在不同處理方式中銨態(tài)氮含量的變化曲線圖；圖3為本發(fā)明不同投菌量對硝態(tài)氮去除率的影響曲線圖。具體實施方式下面結(jié)合附圖并通過具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。一種采用棉稈高得率漿廢液生物轉(zhuǎn)化菌種N4修復(fù)硝酸鹽污染土壤的方法，包括原位修復(fù)法及異位修復(fù)法。其中采用原位修復(fù)法的方法是:在硝酸鹽污染的農(nóng)田土壤、河流底泥、果園土壤按照投菌量為3.OX10lfl個/kg投加N4菌，30天再投加一次以保持N4菌含量。采用異位修復(fù)法的方法是挖掘硝酸鹽污染的土壤，按照投菌量為3.0X10'°個/kg投加N4菌，30天再投加一次以保持N4菌含量。本發(fā)明所使用的棉稈高得率漿廢液生物轉(zhuǎn)化菌種N4的制備方法為(1).原料廢液準(zhǔn)備為棉稈作為造紙原料的APMP制漿后的擠出液，其COD為43000mg/L，pH值約為8，色度在30000倍以上。(2).菌種選擇菌種N4是從北京懷柔西洋參種植基地土壤中經(jīng)過取樣馴化、劃線分離、菌種篩選、劃線純化后得到的一種異養(yǎng)硝化菌，該N4菌的形態(tài)特征如表1所述。表i<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(3).原料廢液培養(yǎng)基將原料廢液稀釋5倍，滅菌后調(diào)節(jié)pH值在7.0左右。(4).N4菌培養(yǎng)將原料廢液培養(yǎng)基lOOmL裝入500mL三角燒瓶中，滅菌后調(diào)節(jié)pH約為7.0，接種0D腳值為2.0的N4菌母液，置于28'C、200r/min的恒溫空氣搖床中振蕩培養(yǎng)，4h后分別用血球板計算菌數(shù)。(5).分別在上述兩種培養(yǎng)基中接種5%的N4菌，進(jìn)行搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度在2535t:范圍內(nèi)，初始pH為6.57.5，每隔4h用血球板做菌的計數(shù)。下面通過實驗來驗證本發(fā)明的先進(jìn)性l.土壤中硝態(tài)氮的降解情況，對比普通細(xì)菌培養(yǎng)基培養(yǎng)的N4菌，如圖l所示。由于普通細(xì)菌培養(yǎng)基中含有銨鹽，在好氧培養(yǎng)過程中一部分銨態(tài)氮被合成為細(xì)菌自身細(xì)胞物質(zhì)，一部分好氧硝化為硝態(tài)氮，大部分硝態(tài)氮被N4菌同步反硝化為氮?dú)饷摮?，而有一部分殘留于培養(yǎng)基中。故施加普通培養(yǎng)基培養(yǎng)的N4菌的土壤中的硝態(tài)氮，本底值高于其它兩種處理方法。總體來看三個土樣中硝態(tài)氮初始值均高于正常值(O.5-50mg/kg)。經(jīng)過處理后，土壤中的硝態(tài)氮均有明顯的降低，前20d去除速率較快而后變緩。實驗開始的20d內(nèi)，處理方法1中硝態(tài)氮的去除速率較處理方法2、3的去除速率低，是因為培養(yǎng)基中有未被N4菌代謝完的銨鹽存在，使得處理l的土樣在幵始時銨態(tài)氮含量就高于其他兩個土樣，阻礙了反硝化反應(yīng)的正向進(jìn)行。而后由于N4菌的衰亡，處理l中的菌數(shù)優(yōu)勢體現(xiàn)了出來，最終硝態(tài)氮的去除率達(dá)到79.3%，略高于其他兩個處理。三個土樣硝態(tài)氮的最終含量均低于或接近正常值，說明N4菌能明顯降低土壤中的硝態(tài)氮，兩種培養(yǎng)方式對其作用效果沒有影響。三個處理中，不同菌量對硝態(tài)氮去除的影響也不明顯，說明還未達(dá)到最低投菌量。土壤是一個缺氧而非嚴(yán)格厭氧的環(huán)境，所以可以斷定N4菌在土壤中發(fā)生的是好氧反硝化反應(yīng)，這與異氧硝化菌一般都是好氧反硝化菌的報道相符合。N4菌利用好氧反硝化酶的作用，在有氧條件下進(jìn)行反硝化作用去除硝態(tài)氮。而且據(jù)報道好氧反硝化菌要求的溶解氧濃度較低，在一定范圍內(nèi)反硝化率不受DO值的影響。所以N4菌能在土壤這個有氧環(huán)境中很好的去除硝態(tài)氮。2.土壤中銨態(tài)氮的變化情況，三個土樣中銨態(tài)氮的變化如圖2所示。水處理方面的試驗表明，N4菌能在完全好氧的條件下同步去除污水中的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮。在土壤中N4菌主要發(fā)生的是反硝化反應(yīng)，硝態(tài)氮被還原為氮?dú)饷摮鱿到y(tǒng)。由圖2可見，三個處理中銨態(tài)氮含量均有所升高，銨態(tài)氮是能被植物直接吸收利用的存在形式[16]，被吸收到植物體內(nèi)的銨態(tài)氮，可直接與光合作用產(chǎn)物有機(jī)酸結(jié)合，形成氨基酸，進(jìn)而形成其它含氮有機(jī)物。所以N4菌能夠使土壤中的硝態(tài)氮降解的同時，銨態(tài)氮的含量略有增加，這會對植物的生長起到一定的促進(jìn)作用。3最佳投菌量的測定為便于大規(guī)模田間應(yīng)用，本試驗設(shè)計了五個不同投菌量的處理，測定了處理10d后土壤中的硝態(tài)氮含量及20d后低投菌量中硝態(tài)氮的變化，如圖3所示。隨著投菌量的減少硝態(tài)氮去除率降低，投菌量低于2mL去除率降低明顯。20d后測定后三個低投菌量的處理，土樣中硝態(tài)氮的變化如表l所示。表l低投菌量20d后硝態(tài)氮的變化<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由表2可見，硝態(tài)氮降解量均低5mg/kg，說明2mL是N4菌在土壤中的最低投菌量，即3.0xl(T個/kg。4.土壤中N4菌的生長情況投菌后用普通細(xì)菌培養(yǎng)基，采用稀釋平皿法10-4~10—63個稀釋度測土壤中的N4菌數(shù)，如表2所示。表2N4菌在土壤中的數(shù)量變化情況<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>由表3可見，N4菌在投菌30d后數(shù)量明顯減少，說明在土壤這個復(fù)雜的微生物環(huán)境中，菌群之間相互競爭，N4菌由于生長周期較長，不能一直保持?jǐn)?shù)量上的優(yōu)勢，在一段時間后出現(xiàn)衰亡。若持續(xù)降低硝態(tài)氮的含量，應(yīng)每隔30d投加N4菌以保持其優(yōu)勢，因此，最佳投菌量為3.0xl()W個/kg。權(quán)利要求1.一種采用棉稈高得率漿廢液生物轉(zhuǎn)化菌種N4修復(fù)硝酸鹽污染土壤的方法，其特征在于修復(fù)方法包括原位修復(fù)法及異位修復(fù)法。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用棉稈高得率漿廢液生物轉(zhuǎn)化菌種N4修復(fù)硝酸鹽污染土壤的方法，其特征在于所述采用原位修復(fù)法的方法是在硝酸鹽污染的農(nóng)田土壤、河流底泥、果園土壤按照投菌量為3.0X101。個/kg投加N4菌，30天再投加一次以保持N4菌含量。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用棉稈高得率漿廢液生物轉(zhuǎn)化菌種N4修復(fù)硝酸鹽污染土壤的方法，其特征在于所述采用異位修復(fù)法的方法是挖掘硝酸鹽污染的土壤，按照投菌量為3.0Xl(T個/kg投加N4菌，30天再投加一次以保持N4菌含量。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2或3所述的采用棉稈高得率漿廢液生物轉(zhuǎn)化菌種N4修復(fù)硝酸鹽污染土壤的方法，其特征在于所述N4菌的制備方法是(1).原料廢液準(zhǔn)備原料廢液為棉稈作為造紙原料的APMP制漿后的擠出液，其COD為43000mg/L，pH值為7-8，色度在30000倍以上；(2).菌種選擇菌種N4是從經(jīng)過取樣馴化、劃線分離、菌種篩選、劃線純化后得到的一種異養(yǎng)硝化菌，該N4菌的菌落特征圓形、白色、邊緣規(guī)則、濕潤、中間有突起；形態(tài)球狀；菌落大小cp=l~2mm;(3).原料廢液培養(yǎng)基將原料廢液稀釋5倍，滅菌后調(diào)節(jié)pH值在6.5-7.5;(4).N4菌培養(yǎng)將原料廢液培養(yǎng)基滅菌后調(diào)節(jié)pH為6.5-7.5，接種0De6。值為2.0的N4菌母液，置于26-30°C、200r/min的恒溫空氣搖床中振蕩培養(yǎng)，3-4h后用血球板計算菌數(shù)；(5).在原料廢液培養(yǎng)基中接種5%的N4菌，進(jìn)行搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度在25~35。C，初始pH為6.57.5，每隔4h用血球板做菌的計數(shù)，即可獲得棉稈高得率漿廢液生物轉(zhuǎn)化菌種N4。全文摘要本發(fā)明涉及一種采用棉稈高得率漿廢液生物轉(zhuǎn)化菌種N4修復(fù)硝酸鹽污染土壤的方法，采用原位修復(fù)法及異位修復(fù)法進(jìn)行修復(fù)，是在硝酸鹽污染的農(nóng)田土壤、河流底泥、果園土壤按照投菌量為3.0×10¹⁰個/kg投加N4菌，30天再投加一次以保持N4菌含量。用廢液培養(yǎng)的N4菌液可明顯降低土壤中的硝態(tài)氮，對于控制蔬菜種植地的硝酸鹽污染有非常重要的意義，其生物轉(zhuǎn)化物用于農(nóng)田生物修復(fù)是一條循環(huán)經(jīng)濟(jì)發(fā)展路子，具有很大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益前景。文檔編號B09C1/10GK101269382SQ20081005304公開日2008年9月24日申請日期2008年5月9日優(yōu)先權(quán)日2008年5月9日發(fā)明者龐金釗,楊宗政申請人:天津科技大學(xué)