專利名稱：一種凝結(jié)芽孢桿菌及高密度培養(yǎng)的芽孢制劑的制備及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一種凝結(jié)芽孢桿菌及高密度培養(yǎng)的芽孢制劑的制備及其應(yīng)用，屬于微生物 技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
我國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，養(yǎng)殖業(yè)在整個(gè)農(nóng)業(yè)中占有相當(dāng)?shù)谋戎兀S著我國(guó)畜 牧、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，肉類和禽類產(chǎn)量躍居世界前列，但是，養(yǎng)殖業(yè)經(jīng) 濟(jì)迅速發(fā)展的同時(shí)卻忽視了畜禽、水產(chǎn)品的食用安全問(wèn)題。近年來(lái)高密度集約 化的人工養(yǎng)殖以重?cái)?shù)量輕質(zhì)量的方式發(fā)展，導(dǎo)致養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境遭到了破環(huán)，養(yǎng) 殖動(dòng)物病害頻繁爆發(fā)；人們長(zhǎng)期大量使用抗生素及化學(xué)合成藥物導(dǎo)致抗藥性、 耐藥性越來(lái)越明顯，養(yǎng)殖動(dòng)物抗病能力不斷下降，并且藥物殘留帶來(lái)二次污染 直接影響人類的免疫和健康，從而使畜禽、水產(chǎn)品的食用安全遭到威脅，嚴(yán)重 影響?zhàn)B殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。近幾年間，全球相繼發(fā)生了包括比利時(shí)二惡英事件、 英國(guó)瘋牛病事件、日本大腸桿菌"0—157"食物中毒事件、法國(guó)李斯特桿菌污染事 件、中國(guó)的"瘦肉精"事件、多寶魚(yú)事件等一系列重大食品安全事件，使食品安全 問(wèn)題迅速引起全球關(guān)注。氯霉素、孔雀石綠、硝基呋喃等藥物殘留問(wèn)題使我國(guó) 的水產(chǎn)品在國(guó)際市場(chǎng)上屢遭"綠色貿(mào)易壁壘"。近期三鹿奶粉三聚氰胺污染事件 再次敲響了食品安全的警鐘，同時(shí)也向人們警示在農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)的源頭上消除食 品安全問(wèn)題是當(dāng)務(wù)之急。因此，在不影響畜禽產(chǎn)品、水產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量的前提 下，如何降低畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)所帶來(lái)的環(huán)境污染，提高畜禽、水產(chǎn)品的食用 安全性已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，同時(shí)也是研究的熱點(diǎn)。水產(chǎn)養(yǎng)殖、畜禽養(yǎng)殖行 業(yè)在向高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效、生態(tài)、安全的現(xiàn)代養(yǎng)殖方式轉(zhuǎn)變和發(fā)展過(guò)程中，都 急需能夠替代或部分替代抗生素和化學(xué)藥物的新型綠色、安全詞料添加劑及水 質(zhì)、環(huán)境調(diào)控技術(shù)。
用微生態(tài)制齊U(Microbial ecological agent)進(jìn)行畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害的防 治，修復(fù)養(yǎng)殖污染環(huán)境，是近年發(fā)展起來(lái)的一種新方法。微生態(tài)制劑是基于微 生態(tài)平衡理論、微生態(tài)營(yíng)養(yǎng)理論及微生態(tài)防治理論而發(fā)展起來(lái)的微生物產(chǎn)品， 它對(duì)動(dòng)物疾病的防治是一種主動(dòng)形式的防治，微生態(tài)制劑有助于扶持體內(nèi)益生 菌生長(zhǎng)，拮抗致病菌繁殖，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，防治并減少疾病的發(fā)生，提高 宿主健康水平，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收，凈化動(dòng)物體內(nèi)外環(huán)境，抑制腐敗細(xì)菌 的生長(zhǎng)，進(jìn)而減少氨、胺等有害物質(zhì)的產(chǎn)生，減少環(huán)境中臭氣的污染；除此之 外，它可直接用于畜禽污染環(huán)境中，依靠微生物對(duì)畜禽糞便中有機(jī)物的降解作用，來(lái)降低畜禽糞便對(duì)環(huán)境的污染；或應(yīng)用于養(yǎng)殖水體中，通過(guò)對(duì)水體有害物 質(zhì)的分解、病原菌的抑制及水體有益菌群的培育，來(lái)改善水質(zhì)，維持水體生態(tài) 平衡，從而保持畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)與環(huán)境保護(hù)的協(xié)調(diào)發(fā)展。微生態(tài)制劑具有 無(wú)毒害、無(wú)副作用、無(wú)殘留、無(wú)污染、無(wú)耐藥性，能提高動(dòng)物生產(chǎn)性能，提高 飼料轉(zhuǎn)化率等諸多的優(yōu)點(diǎn)，因此正日益受到人們的重視，其廣闊前景是毋庸置 疑的。
目前，微生態(tài)制劑已經(jīng)廣泛應(yīng)用于畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，對(duì)微生態(tài)制劑的 開(kāi)發(fā)和研究，國(guó)內(nèi)外己進(jìn)入高潮，并且已形成強(qiáng)大的產(chǎn)業(yè)，每年的收入相當(dāng)可 觀。有學(xué)者指出"抗生素之后的時(shí)代，將是微生態(tài)制劑的時(shí)代"。作為飼用微生物 添加劑，乳酸菌類益生菌是目前我國(guó)農(nóng)業(yè)部、美國(guó)食品及藥物管理局等國(guó)內(nèi)外 政府批準(zhǔn)使用的數(shù)量最多、效果較好的一類安全微生物菌種，具有良好的生物 學(xué)功能，它具有提高飼料轉(zhuǎn)化率、提高增重，補(bǔ)充、調(diào)節(jié)、維持動(dòng)物腸道內(nèi)微 生物平衡，抑制病原菌，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，防止疾病發(fā)生、治療己發(fā)疾病、降 低死亡率，促進(jìn)消化等作用，還可提高畜禽漁類成品質(zhì)量，避免大量使用化學(xué) 藥物和抗生素造成的藥物殘留和污染，因此，它具有無(wú)毒、無(wú)抗藥性、無(wú)殘留、 無(wú)副作用等特點(diǎn)。此外，乳酸菌能利用有機(jī)物進(jìn)行生長(zhǎng)，降低污染水體的生物 耗氧量和化學(xué)耗氧量，是一類重要的污水處理微生物，可修復(fù)養(yǎng)殖水體環(huán)境。
由于菌株自身的生物學(xué)特性是影響乳酸菌類詞用微生物添加劑應(yīng)用效果的 關(guān)鍵因素，大多數(shù)乳酸菌不產(chǎn)芽孢，營(yíng)養(yǎng)菌體對(duì)環(huán)境抗逆性差，不耐氧，不耐 熱，不利于飼料加工和保存，嚴(yán)重影響其質(zhì)量及應(yīng)用效果，在水產(chǎn)養(yǎng)殖和飼料 工業(yè)中的應(yīng)用受到很大的限制。由此，基于上述背景，如果可以開(kāi)發(fā)出兼有直 接參與養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)微生態(tài)平衡的調(diào)整、促進(jìn)生長(zhǎng)，防治疾病，同時(shí)又能改善 養(yǎng)殖環(huán)境的微生態(tài)制劑，則對(duì)減少抗生素和化學(xué)藥物的使用，生產(chǎn)無(wú)污染的綠色 畜禽、水產(chǎn)品，提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益具有重要意義。
乳酸是廣泛存在于人、動(dòng)物、植物和微生物等生物體中的有機(jī)酸。其分子 結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)不對(duì)稱碳原子，因此具有旋光性，按其構(gòu)型可分D(-)-乳酸、L(+)-乳酸和DL-乳酸三種。人體只含有L-乳酸脫氫酶，因此只能代謝利用L-乳酸，過(guò) 多食用D-乳酸或DL-乳酸都會(huì)導(dǎo)致人體代謝功能的紊亂，危害人體健康，而對(duì)L-乳酸則不加限制。因此，人類服用能夠在體內(nèi)產(chǎn)L-乳酸的益生菌就成為一種十 分綠色健康的食用選擇，它能降低消化道pH，使腸道處于酸性環(huán)境，抑制病原 菌生長(zhǎng)，對(duì)人體腸道健康起到積極的作用。哺乳動(dòng)物與人類一樣，都只能代謝 利用L-乳酸，因此在飼料中添加在動(dòng)物體內(nèi)能夠產(chǎn)L-乳酸的乳酸菌就具有十分廣 闊的市場(chǎng)前景，而且也將成為發(fā)展無(wú)公害產(chǎn)品的有效途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種凝結(jié)芽孢桿菌芽孢的高密度培養(yǎng)方法及其應(yīng)用，在這種培養(yǎng)方法下凝結(jié)芽孢桿菌在有氧條件下能夠產(chǎn)芽孢，在發(fā)酵過(guò)程中 代謝產(chǎn)出少量L-乳酸；在厭氧靜置條件下凝結(jié)芽孢桿菌能夠產(chǎn)出純度較高的L-乳酸。
本發(fā)明的技術(shù)方案 一株凝結(jié)芽孢桿菌菌株，其分類命名為凝結(jié)芽孢桿 菌(^acz7/w coagw/a"力JSSW-LA-07，巳保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì) 普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCCNo.2602;該菌株JSSW-LA-07在有氧條件 下能夠產(chǎn)芽孢，并在發(fā)酵過(guò)程中代謝產(chǎn)出少量L-乳酸；在靜置厭氧條件下能夠 產(chǎn)出純度較高的L-乳酸。
所述凝結(jié)芽孢桿菌的高密度芽孢制劑的制備方法，是通過(guò)以下步驟來(lái)完成
(1) 斜面菌體活化
無(wú)菌開(kāi)啟菌株JSSW-LA-07的凍干保藏菌種，劃線接種于麩皮營(yíng)養(yǎng)瓊脂試管 斜面，斜面培養(yǎng)基(麩皮營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基)組成以g/L計(jì)為蛋白胨10，牛肉 膏3， NaC15，麩皮10，瓊脂15-20， pH 7.0-7.2; 30-60。C培養(yǎng)24-48h;然后劃 線轉(zhuǎn)接于麩皮營(yíng)養(yǎng)瓊脂茄子瓶斜面，30-6(TC培養(yǎng)24-48h，鏡檢，當(dāng)90%以上菌 體形成芽孢時(shí)，即為成熟，準(zhǔn)備移種；
(2) 搖瓶及種子罐培養(yǎng) 準(zhǔn)備一個(gè)內(nèi)裝玻璃珠的無(wú)菌三角瓶，用無(wú)菌水將茄子瓶斜面上的成熟菌泥
刮洗下來(lái)，裝入三角瓶，振蕩分散菌泥，獲得均勻的菌懸液，將菌懸液在80°C 水浴中加熱10分鐘，以體積比l。/。-10。/。的接種量接入250mL三角瓶，裝液量為 15mL;或500mL三角瓶，裝液量為30mL;搖瓶培養(yǎng)，或接入種子罐培養(yǎng)，種 子罐體積選用IOL、 20L、 50L或100L，種子罐的裝量系數(shù)體積比為60%-70%;
培養(yǎng)基組成為以g/L計(jì)麩皮5-20，酵母膏5.0-10，豆粕粉5-10， K2HP043， NaC15， MnSO4,H2O0.3， pH7.0;
培養(yǎng)條件為搖瓶轉(zhuǎn)速200r/min;種子罐攪拌轉(zhuǎn)速^150 r/min，通氣量 l-2m3/h，培養(yǎng)溫度為30-60°C，培養(yǎng)時(shí)間為18-48h;
(3) 發(fā)酵罐培養(yǎng)
種子培養(yǎng)液以體積比1%-10%的接種量接入發(fā)酵罐，發(fā)酵罐選用1T、 2T、 或3T體積的發(fā)酵罐，發(fā)酵罐裝量系數(shù)體積比為60%-70%; 發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成
發(fā)酵培養(yǎng)基由碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽組成，以g/L計(jì)碳源5-20，氮源5-20， K2HP043， NaC15， MnS04.H20 0.3，碳酸轉(zhuǎn)2-10， pH 6.0-8.0;
發(fā)酵罐培養(yǎng)條件為攪拌轉(zhuǎn)速2150 r/min，通氣量l-2m3/h，培養(yǎng)溫度為 30-60°C，培養(yǎng)時(shí)間為18-48h;在培養(yǎng)過(guò)程中根據(jù)泡沫的高漲情況加豆油或泡敵 進(jìn)行消泡，防止因泡沫逃逸出發(fā)酵罐而引起雜菌污染；取發(fā)酵液進(jìn)行鏡檢，當(dāng) 90%以上的菌體已形成芽孢時(shí)，即可放罐結(jié)束培養(yǎng)；取樣測(cè)總菌數(shù)及芽孢數(shù)；活菌及芽孢檢測(cè)用番茄汁瓊脂計(jì)數(shù)培養(yǎng)基以g/L計(jì)酵母膏10，蛋白胨10，
番茄汁200mL， CaC03 5，瓊脂15-20，蒸餾水800mL， pH7.0-7.2;測(cè)得發(fā)酵液 芽孢數(shù)量達(dá)lxl09cfb/mL以上；
(4)芽孢收集及菌粉制備
將培養(yǎng)液泵入轉(zhuǎn)速為15000r/min的連續(xù)式離心機(jī)進(jìn)行離心，獲得芽孢，將 芽孢與干淀粉以重量比1:1-5混合，在40-50'C干燥20-24h，粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40 目篩，加入配料石粉、麩皮或玉米芯粉中的一種或幾種，混合后制成微生態(tài)制 劑，芽孢含量達(dá)lxl09cfWmL以上。
所述的制備方法，其凝結(jié)芽孢桿菌好氧液體發(fā)酵的碳源和氮源的選擇十分 廣泛，碳源選用麩皮、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、果糖、阿拉伯糖、玉米 糖、大米糖、可溶性淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、小麥淀粉、紅薯淀粉或馬鈴 薯淀粉中的一種或幾種；氮源選用蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、玉米漿粉、豆粕 粉、大豆肽、棉籽蛋白、黃豆餅粉或花生餅粉中的一種或幾種。
靜置厭氧發(fā)酵產(chǎn)L-乳酸將凝結(jié)芽孢桿菌芽孢接入下述培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基 組成以g/L計(jì)為蛋白胨5-10，酵母膏5-10，葡萄糖10-20，牛肉膏l(xiāng)-3，吐溫 -80 0.5， pH7.0。培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度30-60°C,靜置厭氧發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間 24-72h。
L-乳酸檢測(cè)將發(fā)酵液先加熱至80-100°C，然后于4000rpm/min離心5分 鐘，取上清液用L-乳酸脫氫酶法測(cè)定或以此方法為原理的SBA-40C生物傳感分 析儀(山東科學(xué)院生物研究所研制)測(cè)L-乳酸含量，測(cè)得L-乳酸含量達(dá)8.0 g/L 以上。
本發(fā)明的有益效果
1. 凝結(jié)芽孢桿菌屬于兼性好(厭)氧菌，在有氧條件下，能發(fā)酵形成高濃 度、高活性的芽孢；在靜置無(wú)氧條件下，能發(fā)酵產(chǎn)生對(duì)人和動(dòng)物有益的L-乳酸。
2. 發(fā)酵培養(yǎng)基中可選擇的C源、N源十分廣泛，所以運(yùn)用于生產(chǎn)時(shí)，可以選 用經(jīng)濟(jì)實(shí)惠的原料作為C、 N源；并且其溫度生長(zhǎng)范圍廣，在30。C-6(TC范圍均能 生長(zhǎng)，在較高溫度下生長(zhǎng)，減少了染菌的機(jī)會(huì)，單罐培養(yǎng)獲得芽孢濃度可達(dá) lxl。9cfU/ml以上。
3. 凝結(jié)芽孢桿菌是乳酸菌類的一種益生菌，它具有一般乳酸菌的維持腸道 微生態(tài)平衡，刺激免疫，提高機(jī)體健康水平，提高人和動(dòng)物消化功能等作用外， 同時(shí)還具有普通乳酸菌所不具備的環(huán)境抗逆性強(qiáng)、抗胃酸、抗干燥、耐高溫高 壓、易貯存等獨(dú)特的生物特性。
4. 凝結(jié)芽孢桿菌可作為動(dòng)物益生素，直接添加于畜禽類飼料、水產(chǎn)餌料中， 補(bǔ)充、調(diào)節(jié)、維持動(dòng)物腸道內(nèi)微生物的平衡，提高動(dòng)物機(jī)體免疫力、抑制有害 細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖，并且凝結(jié)芽孢桿菌在哺乳動(dòng)物體內(nèi)無(wú)氧條件下產(chǎn)生的L-乳酸能夠直接被機(jī)體吸收，提高動(dòng)物免疫力和抵抗力，從而減少抗生素藥物的使用。 它還可應(yīng)用于養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境的調(diào)控，通過(guò)對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境中有機(jī)污染物、有害物質(zhì) 的分解，病原菌的抑制等，對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境進(jìn)行微生態(tài)修復(fù)，從而改善養(yǎng)殖環(huán)境， 維持環(huán)境生態(tài)平衡。
5.該菌不產(chǎn)生對(duì)人體、養(yǎng)殖動(dòng)物有害的物質(zhì)，具有無(wú)毒、無(wú)殘留、無(wú)副作 用等特點(diǎn)，同時(shí)它對(duì)環(huán)境的保護(hù)及治理也起到了積極的作用。因此，它對(duì)生產(chǎn) 綠色、安全的畜禽、水產(chǎn)品，改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境都具有重要意義，廣泛應(yīng)用于 高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效、生態(tài)、安全的畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)及養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境的調(diào)控。 生物材料樣品保藏
一株凝結(jié)芽孢桿菌菌株，其分類命名為凝結(jié)芽孢桿菌^""7/M "g"/"""
JSSW-LA-07，巳保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏
日期2008年7月28日，保藏號(hào)為CGMCC No.2602。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:高密度凝結(jié)芽孢桿菌芽孢的培養(yǎng)
1、 菌體的活化
無(wú)菌開(kāi)啟凝結(jié)芽孢桿菌JSSW-LA-07的凍干菌種，劃線接種于試管麩皮營(yíng)養(yǎng) 瓊脂斜面，斜面培養(yǎng)基組成為蛋白胨10g/L，牛肉膏3g/L， NaCl 5g/L，麩皮 10g/L，瓊脂15-20g/L，蒸熘水1L， pH 7.0-7.2。 4(TC培養(yǎng)20-24小時(shí)，然后劃線 轉(zhuǎn)接于麩皮營(yíng)養(yǎng)瓊脂茄子瓶斜面，4(TC培養(yǎng)20-24小時(shí)，鏡檢，當(dāng)90%以上菌體 形成芽孢時(shí)，即為成熟，可準(zhǔn)備移種。
2、 IOOL種子罐培養(yǎng)
準(zhǔn)備一個(gè)內(nèi)裝玻璃珠的無(wú)菌三角瓶，用無(wú)菌水將茄子瓶斜面上的成熟菌泥 刮洗下來(lái)，裝入三角瓶，振蕩分散菌泥，獲得均勻的菌懸液。將菌懸液在80°C 水浴中加熱10分鐘，以體積比2。/。-10。/。的接種量接入100L種子罐，種子罐的裝 量系數(shù)為60°/。-70°/。(v/v)，艮卩100L種子罐裝培養(yǎng)基60-70L。
種子培養(yǎng)基組成為麩皮20g/L，酵母膏5g/L，豆粕粉10g/L， K2HP043g/L， NaC15g/L, MnS04.H20 0.3g/L， pH7,0。
種子罐培養(yǎng)條件為攪拌轉(zhuǎn)速200r/min，通氣量l-2m3/h，培養(yǎng)溫度為4(TC， 培養(yǎng)時(shí)間為20-24h。
3、 1T發(fā)酵罐培養(yǎng)
種子培養(yǎng)液以體積比5%-10%的接種量接入1T發(fā)酵罐，發(fā)酵罐裝量系數(shù)為 60%-70%(v/v)，即IT發(fā)酵罐裝培養(yǎng)基600-700L。
發(fā)酵培養(yǎng)基組成為麩皮20g/L，酵母膏5g/L，豆粕粉10g/L， K2HP043g/L， NaC15g/L， MnSO4.H2O0.3g/L，碳酸f丐5g/L， pH7.0。
發(fā)酵罐培養(yǎng)條件為攪拌轉(zhuǎn)速200r/min，通氣量1.5mVh，培養(yǎng)溫度為45°C，培養(yǎng)時(shí)間為48h。在培養(yǎng)過(guò)程中根據(jù)泡沬的高漲情況加豆油或泡敵進(jìn)行消泡，防 止因泡沫逃逸出發(fā)酵罐而引起雜菌污染；取發(fā)酵液進(jìn)行鏡檢，當(dāng)90%以上的菌 體已形成芽孢時(shí)，即可放罐結(jié)束培養(yǎng)；取樣測(cè)總菌數(shù)及芽孢數(shù)；
番茄汁瓊脂計(jì)數(shù)培養(yǎng)基酵母膏10g/L，蛋白胨10g/L，番茄汁200mL,蒸 餾水800mL，瓊脂15-20g/L， CaC03 5g/L， pH7.0-7.2。
發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)得發(fā)酵液總菌數(shù)為6.0x109 CFU/mL，芽孢數(shù)達(dá) 5.8xl09CFU/mL，芽孢率96.7%。 SBA生物傳感分析儀測(cè)得L-乳酸的濃度為 3.0g/L。
實(shí)施例2:凝結(jié)芽孢桿菌靜置培養(yǎng)產(chǎn)L-乳酸
1、 靜置發(fā)酵培養(yǎng)
將凝結(jié)芽孢桿菌芽孢接入下述培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基組成為蛋白胨5g/L，酵 母浸膏5g/L，葡萄糖10g/L，牛肉膏l(xiāng)g/L，吐溫-80 0.5g/L，蒸餾水1000mL，pH7.0。 培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度45°C,培養(yǎng)時(shí)間72h，靜置厭氧培養(yǎng)。
2、 L-乳酸檢測(cè)
將發(fā)酵液先加熱至80-100°C，然后于4000rpm/min離心5分鐘，取上清液 用SBA-40C生物傳感分析儀測(cè)L-乳酸含量，測(cè)得L-乳酸含量為8.5 g/L。 實(shí)施例3:制作微生態(tài)制劑
1、 凝結(jié)芽孢桿菌芽孢的培養(yǎng)方法與實(shí)施例l所述相同
2、 凝結(jié)芽孢桿菌菌粉的制備
將高密度純培養(yǎng)收集的凝結(jié)芽孢桿菌濕菌體與干淀粉1 : 1-5混合，在 40-5(TC下干燥20-24h，粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩，最后用干淀粉調(diào)整菌粉中的芽 孢數(shù)，使菌粉中凝結(jié)芽孢桿菌的芽孢數(shù)25xi(^個(gè)/克。
3、 成品制備
取輔料石粉過(guò)40目篩后，與凝結(jié)芽孢桿菌菌粉混合，用詞料混合機(jī)拌勻， 使成品中凝結(jié)芽孢桿菌芽孢總數(shù)2lxl(^個(gè)/克。成品采用鋁箔袋裝，每袋裝量lkg， 15袋為1個(gè)紙箱包裝，紙箱材料采用瓦楞紙。
實(shí)施例4:凝結(jié)芽孢桿菌制劑的應(yīng)用實(shí)例1
取養(yǎng)殖池塘水，在實(shí)驗(yàn)室的水池中進(jìn)行凝結(jié)芽孢桿菌制劑產(chǎn)品凈化水質(zhì)的 試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)用水池為瓷磚貼片水泥池，水體體積0.05m3。水溫25°C，曝氣20 小時(shí)后，添加氯化銨、亞硝酸鉀調(diào)整起始氨氮和亞硝酸鹽濃度。起始氨氮濃度 為1.20mg/L，亞硝酸鹽濃度0.50mg/L，化學(xué)需氧量COD為12.36 mg/L，試驗(yàn)分 為對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組3個(gè)平行，按0.3ppm的添加量將凝結(jié)芽孢桿菌制劑加 入每個(gè)試驗(yàn)組，5天后分別檢測(cè)試驗(yàn)組和對(duì)照組的水質(zhì)變化，水質(zhì)各指標(biāo)變化平 均值如下
試驗(yàn)組氨氮含量為0.23 mg/L，亞硝酸鹽含量為0 mg/L， COD為6.92 mg/L。對(duì)照組氨氮含量1.26 mg/L，亞硝酸鹽含量0.68 mg/L， COD為14.22 mg/L。 因此，凝結(jié)芽孢桿菌JSSW-LA-07可明顯降低養(yǎng)殖水體中的氨氮、亞硝酸 鹽等有害物質(zhì)含量，改善養(yǎng)殖池塘水質(zhì)，可作為水質(zhì)凈化劑應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中。 實(shí)施例5:凝結(jié)芽孢桿菌制劑的應(yīng)用實(shí)例2
試驗(yàn)選擇出生重相近的l日齡彼德遜雞300只，試驗(yàn)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組， 每組3個(gè)平行，分別于同一養(yǎng)殖大棚內(nèi)地面平養(yǎng)。對(duì)照組，只飼喂基礎(chǔ)日糧，不 添加凝結(jié)芽孢桿菌制劑，試驗(yàn)組在基礎(chǔ)日糧中添加重量比0.5%的凝結(jié)芽孢桿菌 制劑。在開(kāi)食前各組全部稱出出生重量，出生后24h開(kāi)食，將凝結(jié)芽孢桿菌制劑 和飼料充分混勻后飼喂。試驗(yàn)期為49d，每周稱重1次，并空腹取腸內(nèi)容物，將 其稀釋后，以涂布方法接種在SS瓊脂培養(yǎng)基上進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，37。C有氧培養(yǎng)24h 后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。到7周齡時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果如下
對(duì)照組平均增重2058g，料重比2.20，存活率94.67%，沙門(mén)氏菌陽(yáng)性率29.60% 試驗(yàn)組:平均增重2385g，料重比1.90，存活率97.33%，沙門(mén)氏菌陽(yáng)性率23.50% 試驗(yàn)組與對(duì)照組比較，試驗(yàn)組平均增重比對(duì)照組提高15.89%，經(jīng)單因素方 差分析，差異極顯著(PO.01);試驗(yàn)組比對(duì)照組料重比降低極顯著；從存活率情 況看，試驗(yàn)組比對(duì)照組存活率提高；試驗(yàn)組比對(duì)照組沙門(mén)氏菌陽(yáng)性率降低 20.61%。以上結(jié)果表明，在雞飼料中添加凝結(jié)芽孢桿菌制劑對(duì)雞的生長(zhǎng)發(fā)育大 有益處，它在提高增重，提高飼料轉(zhuǎn)化率，降低料重比，提高存活率，增強(qiáng)抗 病能力及免疫力方面效果明顯。因此，該凝結(jié)芽孢桿菌制劑能夠替代抗生素或 抗菌藥作為生長(zhǎng)促進(jìn)劑使用。
權(quán)利要求
1、一株凝結(jié)芽孢桿菌菌株，其分類命名為凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)JSSW-LA-07，巳保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.2602；該菌株JSSW-LA-07在有氧條件下能夠產(chǎn)芽孢，并在發(fā)酵過(guò)程中代謝產(chǎn)出少量L-乳酸；在靜置厭氧條件下能夠產(chǎn)出純度較高的L-乳酸。
2、 一種權(quán)利要求1所述凝結(jié)芽孢桿菌的高密度芽孢制劑的制備方法，其特 征是通過(guò)以下步驟來(lái)完成(1) 斜面菌體活化無(wú)菌開(kāi)啟菌株JSSW-LA-07的凍干保藏菌種，劃線接種于麩皮營(yíng)養(yǎng)瓊脂試管 斜面，斜面培養(yǎng)基組成以g/L計(jì)為蛋白胨10，牛肉膏3， NaC15，麩皮10， 瓊月旨15-20， pH 7.0-7.2; 30-6(TC培養(yǎng)24-48h;然后劃線轉(zhuǎn)接于麩皮營(yíng)養(yǎng)瓊脂茄 子瓶斜面，30-60。C培養(yǎng)24-48h，鏡檢，當(dāng)90%以上菌體形成芽孢時(shí)，即為成熟， 準(zhǔn)備移種；(2) 搖瓶及種子罐培養(yǎng) 準(zhǔn)備一個(gè)內(nèi)裝玻璃珠的無(wú)菌三角瓶，用無(wú)菌水將茄子瓶斜面上的成熟菌泥刮洗下來(lái)，裝入三角瓶，振蕩分散菌泥，獲得均勻的菌懸液，將菌懸液在8(TC 水浴中加熱10分鐘，以體積比1。/。-10。/。的接種量接入250mL三角瓶，裝液量為 15mL;或500mL三角瓶，裝液量為30mL;搖瓶培養(yǎng)，或接入種子罐培養(yǎng)，種 子罐體積選用IOL、 20L、 50L或100L，種子罐的裝量系數(shù)體積比為60%-70%;培養(yǎng)基組成為以g/L計(jì)麩皮5-20，酵母膏5.0-10，豆粕粉5-10， K2HP04 3， NaC15， MnSO4'H2O0.3， pH7.0;培養(yǎng)條件為搖瓶轉(zhuǎn)速200r/min;種子罐攪拌轉(zhuǎn)速^150 r/min，通氣量 l-2mVh，培養(yǎng)溫度為30-60°C，培養(yǎng)時(shí)間為18-48h;(3) 發(fā)酵罐培養(yǎng)種子培養(yǎng)液以體積比1%-10%的接種量接入發(fā)酵罐，發(fā)酵罐選用1T、 2T、 或3T體積的發(fā)酵罐，發(fā)酵罐裝量系數(shù)體積比為60%-70%; 發(fā)酵罐培養(yǎng)基組成發(fā)酵培養(yǎng)基由碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽組成，以g/L計(jì)碳源5-20，氮源5-20， K2HP043， NaC15， MnS04'H20 0.3,碳酸韓2-10， pH 6.0-8.0;發(fā)酵罐培養(yǎng)條件為攪拌轉(zhuǎn)速2150 r/min，通氣量l-2m3/h，培養(yǎng)溫度為 30-60°C，培養(yǎng)時(shí)間為18-48h;在培養(yǎng)過(guò)程中根據(jù)泡沬的高漲情況加豆油或泡敵 進(jìn)行消泡，防止因泡沫逃逸出發(fā)酵罐而引起雜菌污染；取發(fā)酵液進(jìn)行鏡檢，當(dāng) 90%以上的菌體已形成芽孢時(shí)，即可放罐結(jié)束培養(yǎng)；取樣測(cè)總菌數(shù)及芽孢數(shù)；活菌及芽孢檢測(cè)用番茄汁瓊脂計(jì)數(shù)培養(yǎng)基以g/L計(jì)酵母膏10，蛋白胨10，番茄汁200mL, CaC03 5，瓊脂15-20，蒸餾水800mL， pH 7.0-7.2;測(cè)得發(fā)酵液 芽孢數(shù)量達(dá)lxl09cfWmL以上；(4)芽孢收集及菌粉制備將培養(yǎng)液泵入轉(zhuǎn)速為15000r/min的連續(xù)式離心機(jī)進(jìn)行離心，獲得芽孢，將 芽孢與干淀粉以重量比1:1-5混合，在40-50'C干燥20-24h，粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40 目篩，加入配料石粉、麩皮或玉米芯粉中的一種或幾種，混合后制成微生態(tài)制 劑，芽孢含量達(dá)lxl09cfii/mL以上。
3、根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征是凝結(jié)芽孢桿菌液體發(fā)酵的碳 源和氮源的選擇十分廣泛，碳源選用麩皮、葡萄糖、蔗糖、乳糖、麥芽糖、果 糖、阿拉伯糖、玉米糖、大米糖、可溶性淀粉、玉米淀粉、木薯淀粉、小麥淀 粉、紅薯淀粉或馬鈴薯淀粉中的一種或幾種；氮源選用蛋白胨、酵母膏、牛肉 膏、玉米漿粉、豆粕粉、大豆肽、棉籽蛋白、黃豆餅粉或花生餅粉中的一種或 幾種。
全文摘要
一種凝結(jié)芽孢桿菌及高密度培養(yǎng)的芽孢制劑的制備及其應(yīng)用，屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域。一株凝結(jié)芽孢桿菌菌株，其分類命名為凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)JSSW-LA-07，已保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No.2602；該凝結(jié)芽孢桿菌菌株JSSW-LA-07在有氧條件下能夠產(chǎn)芽孢，并在發(fā)酵過(guò)程中代謝產(chǎn)出少量L-乳酸；在無(wú)氧靜置條件下能夠產(chǎn)出純度較高的L-乳酸。該菌不產(chǎn)生對(duì)人體、養(yǎng)殖動(dòng)物有害的物質(zhì)，具有無(wú)毒、無(wú)殘留、無(wú)副作用等特點(diǎn)，它對(duì)生產(chǎn)綠色、安全的畜禽、水產(chǎn)品，改善養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境都具有重要意義，可廣泛應(yīng)用于高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效、生態(tài)、安全的畜禽、水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)及養(yǎng)殖生態(tài)環(huán)境的調(diào)控。
文檔編號(hào)C02F3/34GK101412983SQ20081023551
公開(kāi)日2009年4月22日 申請(qǐng)日期2008年11月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月20日
發(fā)明者何義進(jìn), 群 匡, 冬 夏, 梅 孫, 施大林, 陳秋紅 申請(qǐng)人:江蘇省蘇微微生物研究有限公司;中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心