專利名稱：：大寶山伯克霍爾德菌及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于微生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種能耐重金屬鎘的新的細(xì)菌大寶山伯克霍爾德菌及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：在珠江三角洲地區(qū)，重金屬污染是土壤污染的重要構(gòu)成，嚴(yán)重地威脅著農(nóng)產(chǎn)品的安全性和人體的健康。土壤的重金屬污染具有隱蔽性或潛伏性、不可逆性和長(zhǎng)期性，造成的后果很嚴(yán)重，影響對(duì)象廣泛，影響區(qū)域廣、危害人口多。研發(fā)經(jīng)濟(jì)高效的污染土壤修復(fù)技術(shù)是改善我國(guó)環(huán)境質(zhì)量的迫切要求，也是世界科技的研究熱點(diǎn)。重金屬污染土壤的修復(fù)包括兩種策略一是改變重金屬在土壤中的存在形態(tài)使其固定從而降低其在環(huán)境中的遷移性和生物可利用性(stabilization)，二是從土壤中去除重金屬(extraction)。微生物在重金屬污染土壤的修復(fù)中具有重要的意義，篩選能夠耐受重金屬的微生物菌種資源成為目前重金屬污染修復(fù)的熱點(diǎn)之一。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種能夠耐受重金屬鎘的新的菌種——大寶山伯克霍爾德菌。該菌命名為大寶山伯克霍爾德菌(5wttoWm'aJaZ;acw/w"em/sGIMN1.004)，編號(hào)為CCTCCNo.M209109。本發(fā)明所述的大寶山伯克霍爾德菌是從廣東翁源大寶山礦區(qū)的重金屬污染土壤中分離培養(yǎng)獲得。該菌培養(yǎng)條件為-(1)培養(yǎng)基MGY具體配方如下KCIO.01%;MgS(V7H200.025%;(NH4)2S040.2%;K2HP040.025o/o;葡萄糖0.1%;酵母膏0.01%;瓊脂2.0%;ddH201000ml;pH4.0;(2)培養(yǎng)溫度28°C。本發(fā)明大寶山伯克霍爾德菌CSw狄o她由fl^ao^a"e"^GIMN1.004)的分子分類地位的確定。該菌株的16SrDNA序列如SEQIDNO:1所示。本發(fā)明所述大寶山伯克霍爾德菌具有以下有益效果-本發(fā)明所述大寶山伯克霍爾德菌具有耐受重金屬鎘的能力，其耐受能力強(qiáng)，可以耐受22ramol/L即2640mg/L鎘離子濃度，在對(duì)重金屬污染的土壤修復(fù)中起著重要作用。本發(fā)明所述大寶山伯克霍爾德菌(萬(wàn)",MoWm'arfakzo^uwCTw/sGIMN1.004)已于2009年4月18日保藏于國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，地址武漢大學(xué))，保藏編號(hào)為No.M209109。圖1是本發(fā)明大寶山伯克霍爾德菌的透射電子顯微鏡照片(A，3000倍；B:6000倍)；圖2是本發(fā)明大寶山伯克霍爾德菌及部分相關(guān)菌株依據(jù)16SrDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。具體實(shí)施例方式以下通過(guò)具體實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例l:本發(fā)明大寶山伯克霍爾德菌的分離從廣東大寶山重金屬污染區(qū)采集0-30cm土樣，取10g土壤放入裝有90mL無(wú)菌水的三角瓶中(帶玻珠)，在180rpm轉(zhuǎn)速下振蕩30分鐘，靜置10分鐘后取上層液稀釋10倍后取O.lmL均勻涂布在MGY瓊脂培養(yǎng)基板上，翻轉(zhuǎn)平板置于28"C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2天，即可獲得本發(fā)明所述的大寶山伯克霍爾德菌(5"Wt/wWe"arfa&jas/w"eH^GIMNI.004)。所述大寶山伯克霍爾德菌(Swtto她n'adfl^as/w"m^GIMN1.004)已于2009年4月18日保藏于國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC，地址武漢大學(xué))，保藏編號(hào)為No.M209109MGY瓊脂培養(yǎng)基KCIO.01%;MgS04.7H200,025%;(NH4)2S040.2%;K2HP040.025%;葡萄糖0.1%;酵母膏0.01%;瓊脂2.0%;ddH201000ml;pH4.0:本發(fā)明的大寶山伯克霍爾德菌CBw狄o她riacfa6aos/!OTOT^GIMN1.004)具有下述性質(zhì)1.形態(tài)特征大寶山伯克霍爾德菌在MGY瓊脂培養(yǎng)基平板上能產(chǎn)生紫色顆粒；在加有重金屬的MGY土音養(yǎng)基中的菌落先呈淡粉色后逐漸轉(zhuǎn)為乳白色，菌落圓形，表面皺縮。在NA培養(yǎng)基中菌落圼藍(lán)灰色；菌株GIMN1.004革蘭氏染色為陰性，菌體桿狀；通過(guò)投射電鏡'菌體內(nèi)可觀察到顆粒狀物質(zhì)。如圖1所示。.2.生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>通過(guò)Bk)log試驗(yàn)，本發(fā)明的大寶山伯克霍爾德氏菌能利用一下碳源AdonitolAmygdalinArbutinD-Cellobiosea-CydodextrinB-Cyclodextrini-ErythritolD-FructoseL-FucoseD-GalacturonicAcidGertibioseGlucose-1-PhosphateGlucose-6-Phosphatea-D-LactoseLactuloseMaltoseMaltotrioseD-MetezitoseD-Melibiose3-Methyl-D-GlucoseB-Methyl-D-GalactosideB-Methyl-D-GlucosideL-RhamnoseStachyoseSucroseTuranoseFormicAcida-HydroxybutyricAcidItaconicAcida-KetobutyricAcida-KetovalericAcidD，L-LacticAcidL丄acticAcidD-LacticAcidMethylEsterD-MalicAcidPropionicAcidPyruvicAcidMethylEsterD-SaccharicAcidSuccinamicAcidSuccinicAcidSuccinicAcidMono-MethylEsterUrocanicAcidL-AlaninamideL-Alanyl-LThreonineL-AsparagineL-GlutamicAcidGlycyl-L-AsparticAcidGlycyl-L-GlutamineGlycyl-L-Proline2ADeoxyAdenosineThymidineUridineUridine-5/-Monophosphatem-Inositola-Methyl陽(yáng)D-Galactosidea-Methyl-D-GlucosideD-RaffinoseSalicinAceticAcidFumaricAcidL-Alanyl-L-GlutamineL-MethionineN-Acetyl-D-GlucosamineN-Acetyl-B-D-MannosamineD-GluconicAcidD-GlucosaminicAcidPyruvicAcidL-Alanyl-L-HistidineInosinea-D-LactosePalatinoseL-Alanine]L-Serine。3.其他性質(zhì)甲基萘醌的主要類型為MK-8，細(xì)胞壁脂肪酸種類和含量如表1。表1細(xì)胞壁脂肪酸種類和含量PercentCommentlComment212:01.77ECLdeviates0.002Reference0.00213:1at12-130.91ECLdeviates-0.00214:04.18ECLdeviates-0.007Reference-0.00813:0iso3OH2.40ECLdeviates0.00715:1isoF2.14ECLdeviates0.010SumInFeature11.34ECLdeviates-0.00413:03OH/15:liH15:1anteisoA0.81ECLdeviates0.00515:0iso0.15ECLdeviates-O扁Reference-0.00215:0—ECLdeviates0.00016:0iso0.14ECLdeviates0,005ReferenceO細(xì)16:025.05ECLdeviates0.001Reference0.00017:1anteisow9c0.09ECLdeviates-0.00317:0cyclo5.52ECLdeviates0.00317:00.67ECLdeviates0.001Reference0.00116:120HO.卯ECLdeviates0.00416:020H0.90ECLdeviates0.00416:030H1.76ECLdeviates0.00118:3w6c(6，9，12)0.38ECLdeviates0.005SumInFeature50.58ECLdeviates-0.00218:0ante/18:2w6,9c18:1w9c5.23ECLdeviates0.001SumInFeature817.76ECLdeviates0.00118:1w7c18:010.57ECLdeviates-O扁Reference-0.00219:0iso0.47ECLdeviates-O扁Reference-0.00119:0cyclow8c4.55ECLdeviates0.00118:120H0.73ECLdeviates0.00320:4w6,9，12,15c2.35ECLdeviates0.003SummedFeature11.3415:1isoH/13:03OH13:03OH/15:liHSummedFeature22.7412:0aldehydeunknown10.928SummedFeature35.9316:1w7c/16:lw6c16:1w6c/16:lw7cSummedFeature50.5818:2w6,9c/18:0ante18:0ante/18:2w6,9cSummedFeature817.7618:1w7c18:1w6c實(shí)施例2:本發(fā)明大寶山伯克霍爾德氏菌16SrDNA的序列測(cè)定1、PCR模板DNA的快速制備將細(xì)菌劃線接種在NA培養(yǎng)基的平板上，3(TC培養(yǎng)過(guò)夜。取單一菌落懸浮于10nl無(wú)菌蒸餾水中，于沸水中加熱5min，離心，取上清作為PCR模板DNA.2、16SrRNA基因PCR擴(kuò)增PCR引物由上海英駿公司合成。PrimerA:5,-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'PrimerB:5'-AAGGAGGTGATCCACCCCCA-3'PCR反應(yīng)體系(總體積50^1):10倍緩沖液5)al,dNTP(2mmo1/1)4[al，PrimerA(10pmo1/1)1^1，PrimerB(10pmo1/1)l(J，Taq酶(2U/1)0.4|al，DNA模板lial,滅菌ddH2037.~1。6PCR擴(kuò)增條件94。C5min:94。Clmin，58。Clmin,72。C2min,30個(gè)循環(huán)；72。C7min。3、序列測(cè)定PCR產(chǎn)物純化后，送上海英駿公司用3730全自動(dòng)測(cè)序儀測(cè)序，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)附圖2。其16SrDNA序列如SEQIDNO:1所示(登錄號(hào)FJ210816.1)，測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的己知序列進(jìn)行BLAST比較，確定與本發(fā)明的菌株親緣關(guān)系最近的種屬。從數(shù)據(jù)庫(kù)獲得相關(guān)種屬的16SrDNA序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。大寶山伯克霍爾德菌的基因序列與Swv^oWeW^TO//sp.nov.(KACC11589)的同源性為99.0%,但是兩株菌在菌落形態(tài)以及生理生化方面都有較大差異。從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以看出，大寶山伯克霍爾德菌與KACC11589和SwrttoWer/asp.A6.2兩株菌關(guān)系密切，聚成一類構(gòu)成一個(gè)分支，但又獨(dú)立兩株菌。通過(guò)DNA-DNA雜交顯示，大寶山伯克霍爾德菌與親緣關(guān)系最近的模式菌株KACC11589的DNA-DNA雜交結(jié)果為25.0%。本發(fā)明的大寶山伯克霍爾德菌與其同源性最高的^/"狄o/c/m'asp.nov.(KACC11589)菌株微生物學(xué)特性的比較見(jiàn)表2。表2大寶山伯克霍爾德菌與其同源性最高的Swrtt;/o/c/en'aw//菌株微生物學(xué)特性比較特征GIMN1據(jù)接觸酶一+厭氧生長(zhǎng)—一V-P測(cè)定一一D-葡萄糖產(chǎn)酸+一L-阿拉伯糖++D-木糖+NDD-甘露醇++明膠水解+一淀粉一一檸檬酸鹽利用ND一硝酸鹽還原++生長(zhǎng)溫度最適30°c最適28°C脂肪酸C16:0C18:lw7c醌型泛醌-8ND注+:陽(yáng)性；-:陰性；ND:表示沒(méi)有測(cè)定綜合16SrDNA序列分析和DNA-DNA雜交結(jié)果(1987年國(guó)際系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)委員會(huì)ICSB規(guī)定，DNA同源性小于70%或雜交分子的熱解鏈溫度差小于或等于2'C為細(xì)菌種的界線，Wayneetal,19S7)，本發(fā)明的伯克霍爾德氏菌是一種新的細(xì)菌，命名為大寶山伯克霍爾德菌(丑wr^2o/c/er/"Z)"Zaas^"wew^s7^GIMN1.004)。實(shí)施例3:本發(fā)明所述大寶山伯克霍爾德氏菌耐重金屬能力測(cè)定通過(guò)測(cè)定微生物對(duì)重金屬的最大耐受濃度(Maximaltolerantconcentration,MTC)，來(lái)確定細(xì)菌對(duì)某種金屬離子的極限耐受濃度。挑取本發(fā)明的大寶山伯克霍爾德氏菌菌株的單菌落，接種至裝有50mL液體NA培養(yǎng)基的三角瓶中，在28'C的搖床上培養(yǎng)(180轉(zhuǎn)速)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，然后將培養(yǎng)好的菌液用接種針劃線接種到一系列包含不同濃度的鎘離子的NA固體平板上，翻轉(zhuǎn)平板置于28'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4d后觀察菌落的生長(zhǎng)。如果在某個(gè)濃度只能細(xì)微地觀察到有菌落的生長(zhǎng)，并且在略微高于這個(gè)濃度的平板上觀察不到菌落的生長(zhǎng)，這一濃度便是本發(fā)明大寶山伯克霍爾德氏菌菌株對(duì)這種金屬的最大耐受濃度MTC。測(cè)試結(jié)果表明，本發(fā)明大寶山伯克霍爾德氏菌菌株耐受鎘的能力達(dá)到22隱ol/L即2640mg/L。序列表〈110〉廣東省微生物研究所〈120〉大寶山伯克霍爾德菌及其應(yīng)用<160>1〈170〉Patentlnversion3.1<210>1〈211〉1437〈212〉醒〈213>^/rA力cJcferz'at/a630s力a"e/357's〈400〉1acacatgcaagtcgaacggcagcacgggggcaaccctggtggcgagtggc50gaacgggtgagtaatacatcgg33CgtgtCCtgg3gtgggggatagcccg100gCg333gCCggattaataccgcatacgctctacggagga33gCggggg3t150cttcggacctcgcgctcaaggggCggCCgEltggcggattagctagttggt200agggtaa鄉(xiāng)cctaccaaggcgacgatccgtagctggtctg3g3gg3Cg3250CC3gCC3CaCtgggactgagacacggcccagactcctacggg3ggC3gC3300gtggggaattttggacaatgggggcaaccctgatccagcaatgccgcgtg350tgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcacttttgtccggaaagaaatcc400tttgggctaatacctcggaggg3tg3Cggtaccggaagaataagcsccgg450ctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtgcgagcgttaatc500gg犯tt3Ctgggcgtsaagcgtgcgcaggcggttcgctaagaccgatgtg550aaatccccgggcttaacctgggsactgcattggtg3Ctggcgagctagag600tgtggcagaggggggt卿attccacgtgt3gC3gtg333tgcgtag3ga650tgtggaggaataccgatggcgsaggcagccccctgggctaacactgacgc700tcatgcacgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtcc750acgccctaaacgatgtcaactagttgttggggattcatttccttagtaac800gt3gct犯cgcgtg33gttgaccgcctgggg3gt3CggtCgcaagattaa850aactc犯agg犯ttgacgggasttcgatgc33cgcg犯a3cctgctg卿ggtgagagtgatggctgtcgtcagctcgtgagcgcaacccttgtctctagCCggtg3C333ccggagg犯ttatgggtagggcttcacacaacccgcg3ggggg3gCt33actctgcaetctcgagtgcatgcatgccgcggtgsatacgtccatgggsgtgggtttt3CCggtcaccacggtaggattcagacccgcac3agcggtggstaccttacctacccttgacatctcga犯gag3accgtcgcatCgtg卿tgttgggtt33gttgctacgaaagggcactctggtggggatgacgtcaagtcgtc3tac3atggtcgg犯C3tcccaga犯accgatcgtaggaagctggaatcgctagtaatcccgggtcttgtacacacc3gaagtggct3gtcta3ccgtgsctggggtgaagtcgg3tgtgg3tt■ggacggaatc950C3ggtgCtgC1000tcccgcaacg1050agagag2ictg1100ctcatggccc1150gsgggttgcc1200tccggattgc1250tcgcggatca1300gcccgtcaca1350C33gg3gg3C1400143權(quán)利要求1.大寶山伯克霍爾德菌(BurkholderiadabaoshanensisGIMN1.004)，其特征在于其保藏編號(hào)為CCTCCNo.M209109。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的大寶山伯克霍爾德菌(^/nWwWm"i/aMayfejTKTO:"G1MN1.004),其特征在于該大寶山伯克霍爾德菌Ow狄。/血riacfo&aas/w朋m^GIMN1.004)的16SrDNA序列如SEQIDNO:l所示。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的大寶山伯克霍爾德菌(S"7^。Wen'aifaZ)ao^朋era"GIMN1.004)，其特征在于具有以下的微生物學(xué)特征-a)形態(tài)特征所述大寶山伯克霍爾德菌在MGY瓊脂培養(yǎng)基平板上能產(chǎn)生紫色顆粒；在加有重金屬的MGY培養(yǎng)基中的菌落先呈淡粉色后逐漸轉(zhuǎn)為乳白色，菌落圓形，表面皺縮；在NA培養(yǎng)基中菌落呈藍(lán)灰色；菌株GIMN1.004革蘭氏染色為陰性，菌體桿狀；通過(guò)投射電鏡，菌體內(nèi)可觀察到顆粒狀物質(zhì)；b)生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage2</column></row><table>C)其他特征所述大寶山伯克霍爾德菌甲基萘醌主要類型為MK-8。4.權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的大寶山伯克霍爾德菌(5w狄oWeh"(foZ)ao^a"e"^'GIMN1.004)在耐重金屬鎘中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了一種大寶山伯克霍爾德菌(BurkholderiadabaoshanensisGIMN1.004)，該菌已在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏日期為2009年5月10日，保藏編號(hào)為CCTCCNo.M209109。本發(fā)明大寶山伯克霍爾德菌具有耐重金屬鎘的能力，其耐重金屬能力強(qiáng)，在對(duì)重金屬污染的土壤修復(fù)中起著重要作用。文檔編號(hào)B09C1/10GK101684452SQ200910040518公開(kāi)日2010年3月31日申請(qǐng)日期2009年6月24日優(yōu)先權(quán)日2009年6月24日發(fā)明者朱紅惠,俊郭,郭建華,黎志坤申請(qǐng)人:廣東省微生物研究所