專利名稱：：采用Klebsiellasp.DB-2菌修復(fù)地下水中硝酸鹽污染的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種污染物的修復(fù)方法，特別涉及一種硝酸鹽污染地下水的修復(fù)方法，確切地說(shuō)是采用可溶解的含碳有機(jī)物和DB-2菌修復(fù)地下水中硝酸鹽污染的方法。
背景技術(shù)：
：農(nóng)業(yè)化肥的過(guò)量使用，工業(yè)污水排放量劇增，農(nóng)田大面積污灌，使地下水中的硝酸鹽氮污染嚴(yán)重，我國(guó)大多數(shù)地區(qū)的地下水在不同程度上都遭受到硝酸鹽污染，并且污染程度不斷增加。地下水中的大量硝酸鹽對(duì)人類和動(dòng)植物健康有害，人體攝入的硝酸鹽絕大部分來(lái)自蔬菜和飲用水，高濃度N03'的攝取會(huì)嚴(yán)重影響人類健康，如嬰兒的高鐵血紅蛋白、藍(lán)色嬰兒綜合癥，甚至致癌。因此，控制地下水硝酸鹽污染是一個(gè)迫切問(wèn)題，對(duì)保障居民身心健康和湖泊富營(yíng)養(yǎng)化防治具有雙重價(jià)值。地下水硝酸鹽污染的治理己被廣泛研究并付諸實(shí)踐，在諸多的方法中，生物修復(fù)方法是地下水污染修復(fù)的經(jīng)濟(jì)有效途徑，通過(guò)反硝化細(xì)菌的生物反硝化作用使N(V被轉(zhuǎn)變?yōu)镹(V、NO、N20直至N2從地下水中去除，而產(chǎn)生的只是生物固體。反硝化細(xì)菌是進(jìn)行反硝化作用的微生物，在自然界中普遍存在。在已有的地下水硝酸鹽污染治理技術(shù)中大多采用土著微生物進(jìn)行原位或異位修復(fù)。但由于土著菌包含許多種類的細(xì)菌，其生長(zhǎng)速度慢、代謝活性不高，相互之間會(huì)因?yàn)閷?duì)能源的競(jìng)爭(zhēng)而使所需的反硝化細(xì)菌生長(zhǎng)受到抑制，數(shù)量減少，反硝化作用不明顯。地下水環(huán)境屬于兼氧或缺氧環(huán)境，硝酸鹽隨地下水進(jìn)入深層地下，一些好氧反硝化細(xì)菌不能發(fā)揮作用，因此需要經(jīng)過(guò)專門篩選、培養(yǎng)的高效兼氧優(yōu)勢(shì)反硝化細(xì)菌。在兼氧或缺氧的條件下反硝化細(xì)菌以NOx-N為電子受體，以有機(jī)物(有機(jī)碳)為電子供體去除地下水中的硝酸鹽，因此需要提供足量的有機(jī)碳才能夠完成生物反硝化作用，而地下水中通常缺乏有機(jī)碳。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明是為避免上述現(xiàn)有技術(shù)所存在的問(wèn)題，提供一種采用《/e6wW/flDB-2菌修復(fù)地下水中硝酸鹽污染的方法，利用純化的/:/^5&/&w.DB-2菌，以可溶解的含碳有機(jī)物為碳源，以便有效地用于地下水硝酸鹽污染的生物修復(fù)。本發(fā)明解決技術(shù)問(wèn)題采用如下技術(shù)方案本發(fā)明采用《/e6wW/aw.DB-2菌修復(fù)地下水中硝酸鹽污染的方法的特點(diǎn)是以可溶解含碳有機(jī)物作碳源，使用純化《/efc/e/ZaDB-2菌作為生物修復(fù)菌株，修復(fù)方法包括原位修復(fù)和異位修復(fù)。本發(fā)明采用K/efc/e/tow.DB-2菌修復(fù)地下水中硝酸鹽污染方法的特點(diǎn)也在于所述可溶解含碳有機(jī)物為乙醇或乙酸鹽。所述原位修復(fù)方法是在硝酸鹽污染地區(qū)鉆井或鉆孔，向井內(nèi)或孔內(nèi)灌注或加壓灌注純菌和含碳有機(jī)物的混合液，首次添加時(shí)維持水中菌濃度為106-109個(gè)凡、可溶解含碳有機(jī)物與硝酸鹽氮的摩爾比C/N為1~5:1，對(duì)于硝酸鹽氮含量超過(guò)100mg/L的地下水，第15天再添加一次以保持細(xì)菌的數(shù)量與活性。所述異位修復(fù)方法是將硝酸鹽污染地區(qū)的井水抽出，混合幻e&s/e/tow.DB-2菌種和可溶解的含碳有機(jī)物后，重新灌注到地下；首次添加時(shí)維持水中菌濃度為106-109個(gè)1、可溶解的含碳有機(jī)物與硝酸鹽氮的摩爾比C/N為1~5:1，對(duì)于硝酸鹽氮含量超過(guò)100mg/L的地下水，第15天再投加一次以保持細(xì)菌的數(shù)量與活性。所述純化幻e^'d/a平DB-2菌種的制備按如下過(guò)程進(jìn)行a、菌種的選擇取垃圾滲濾液，加入到反硝化細(xì)菌培養(yǎng)基中富集，在厭氧條件下得到富集菌液后，取菌液在反硝化細(xì)菌培養(yǎng)基上按照倍比稀釋的方法涂布，待長(zhǎng)出菌落后，挑取菌落，在反硝化細(xì)菌培養(yǎng)基上劃線，經(jīng)過(guò)多次劃線分離，得到純化的單菌落；將形態(tài)不同的單菌落分別接種到反硝化富集培養(yǎng)基中富集后，用格利斯試劑進(jìn)行定性的菌種篩選，再將所得的菌株分別進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)，篩出一株異養(yǎng)兼性厭氧的高效反硝化細(xì)菌，其菌落為圓形、乳白色、表面光滑、中間突起、邊緣整齊、易挑取，革蘭氏陰性，鏡檢呈短桿狀、八字形排列細(xì)菌，經(jīng)16SrDNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定為克雷伯氏幻efeid/asp.，獲得Klebsiellasp.DB-2菌株；b、尺/^5&/^^.08-2菌種子液培養(yǎng)采用反硝化細(xì)菌培養(yǎng)基，將所述反硝化細(xì)菌培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)到7.2-8.4后滅菌，接種步驟a所得iC/efe/e//"平DB-2菌株，28'C3(TC厭氧培養(yǎng)48小時(shí)，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算菌數(shù)使其濃度達(dá)到108~10u個(gè)/L數(shù)量級(jí)。所述接種的反硝化細(xì)菌幻efe/eto平DB-2的菌液接種量按體積比為1%~3%。反硝化細(xì)菌根據(jù)生長(zhǎng)碳源不同可分為自養(yǎng)反硝化細(xì)菌和異養(yǎng)反硝化細(xì)菌，自養(yǎng)反硝化細(xì)菌利用無(wú)機(jī)碳源，以氫或硫及硫的化合物為主要的電子供體，氫是一種理想的電子供體，不會(huì)造成二次污染，但是氫氣價(jià)格昂貴、易燃，和空氣混合易爆，而且在水中的溶解度較低(1.6mg/L，20°C)，因此在地下水處理中的運(yùn)用受到了很大的限制。硫的價(jià)格雖然低廉、無(wú)毒，但是當(dāng)水中含有硝酸鹽濃度本發(fā)明采用平DB-2菌修復(fù)地下水中硝酸鹽污染，A7e6wW/fl平DB-2是從垃圾滲濾液中分離篩選出的高效異養(yǎng)型兼氧反硝化純菌，其代謝活性較高、去除硝酸鹽速率較快，通過(guò)富集該菌菌液和添加可溶性的含碳有機(jī)物，利用原位或異位修復(fù)技術(shù)，使菌液和碳源溶于水后隨地下水流動(dòng)擴(kuò)散，修復(fù)深層地下水中的硝酸鹽污染，更適合于區(qū)域規(guī)模地下水污染原位修復(fù)需求。與已有技術(shù)相比，本發(fā)明有益效果體現(xiàn)在1、本發(fā)明添加可溶解的含碳有機(jī)物做碳源，采用《/efe/e/to^.DB-2菌對(duì)地下水硝酸鹽污染進(jìn)行修復(fù)，該菌能夠在地下水環(huán)境中發(fā)生反硝化作用去除硝態(tài)氮。當(dāng)?shù)叵滤跛猁}氮含量為50mg/L左右，投菌7天左右地下水硝酸鹽氮含量低于地下水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。2、本發(fā)明是采用外來(lái)反硝化純化菌種去除地下水硝酸鹽污染，可以經(jīng)過(guò)篩選、培養(yǎng)獲得高效反硝化細(xì)菌，其代謝活性高，去除硝酸鹽速率快。當(dāng)碳源消耗完，該菌也隨之衰亡，最終恢復(fù)自然的生態(tài)平衡。3、本發(fā)明利用添加可溶解的含碳有機(jī)物作《/etoW/w/7.DB-2菌反硝化作用的碳源，可溶解的含碳有機(jī)物包括乙醇、乙酸鹽、甲酸鹽、蔗糖、葡萄糖、尿素等，溶解到水中可隨地下水的流動(dòng)擴(kuò)散，使反硝化作用的范圍更廣。圖1為本發(fā)明在不同C/N比之下地下水硝態(tài)氮的去除情況示意圖。圖2為本發(fā)明在不同C/N比之下地下水總有機(jī)碳的變化情況示意圖。圖3為本發(fā)明在不同水流速度下地下水硝態(tài)氮的去除情況示意圖。圖4為本發(fā)明在不同水流速度下出水中細(xì)菌數(shù)量的變化情況示意圖。具體實(shí)施例方式具體實(shí)施中，采用尺/e6wW/a平DB-2菌修復(fù)地下水硝酸鹽污染的方法，添加含碳有機(jī)物為碳源，包括原位修復(fù)方法和異位修復(fù)方法。在地下水硝酸鹽污染鹽地區(qū)，用電磁勘探技術(shù)進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)勘探，確定該地區(qū)來(lái)水和出水的分布與走向。并根據(jù)其范圍(長(zhǎng)、寬、深度)計(jì)算出該區(qū)地下水的總水量V。按照勘探得知的來(lái)水和出水的走向上選23個(gè)點(diǎn)采用常規(guī)鉆井或更簡(jiǎn)便的高壓地質(zhì)直接鉆孔。取水樣分析井水的硝酸鹽氮含量、亞硝酸鹽氮含量、TOC、反硝化細(xì)菌濃度。其中原位修復(fù)的方法是按照可溶解的含碳有機(jī)物與硝酸鹽氮的摩爾比C/N為1~5:1的比例灌注到井水中，首次添加時(shí)維持水中菌濃度為106-109個(gè)幾，對(duì)于硝酸鹽氮含量超過(guò)100mg/L的地下水，第15天再添加一次以保持細(xì)菌的數(shù)量與活性。異位修復(fù)方法是將硝酸鹽污染地區(qū)的井水抽出，混合A7^m'd/a平DB-2菌種和可溶解的含碳有機(jī)物后，重新灌注到地下，首次添加時(shí)維持水中菌濃度為106-109個(gè)/匕按照可溶解的含碳有機(jī)物與硝酸鹽氮的摩爾比C/N為1~5:1的比例，對(duì)于硝酸鹽氮含量超過(guò)100mg/L的地下水，第15天再投加一次以保持細(xì)菌的數(shù)量與活性。DB-2菌種子液的制備方法為1、菌種選擇本發(fā)明采用的高效純化的反硝化細(xì)菌是從合肥市垃圾填埋場(chǎng)的滲濾液中，利用公知公用的反硝化細(xì)菌培養(yǎng)基經(jīng)過(guò)劃線分離、格利斯試劑進(jìn)行菌種篩選、劃線純化得到的一株異養(yǎng)兼性厭氧的高效反硝化細(xì)菌，獲得該菌株的方法詳見(jiàn)LIUYong,etal,2008年發(fā)表的國(guó)際會(huì)議論文"SimulatedExperimentofRemovingNitratefromGroundwaterbyDenitrobacteria"，Proceedingodthe2ndinternationalconferenceonASIAN-EUROPEANENVIRONMENTALTECHNOLOGYANDKNOWLEDGETRANSFER,Editors:Nellesetal.ISBN578-3-00-024606-7.Hefei.2008，June:5-6:215-217。，經(jīng)16SrDNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定為克雷伯氏iC/efeie//flsp.，命名為A7e&szW/fl^.DB-2，該菌落特征如表l:表1A7efozW/asp.DB-2菌株特征<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>2、K/^w'e/to印.DB-2菌種子液培養(yǎng)采用公知公用的反硝化細(xì)菌培養(yǎng)基調(diào)節(jié)pH為7.2-8.4后滅菌，接種幻efo/e/to平DB-2菌種，28"30。C厭氧培養(yǎng)48小時(shí)，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算菌數(shù)使其濃度達(dá)到1081011個(gè)/L數(shù)量級(jí)。3、反硝化細(xì)菌幻6^/6//"平DB-2的接種量為1%~3%(v/v);添加的可溶解的含碳有機(jī)物用量按照C/N折算。模擬地下水流動(dòng)反應(yīng)器中的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)用水為取自合肥市濱湖硝酸鹽污染地區(qū)的井水，添加的可溶解的含碳有機(jī)物為無(wú)水乙醇1、模擬反應(yīng)器井水中硝態(tài)氮的去除情況，以黃砂作含水層填充介質(zhì)，在不同C/N比下，當(dāng)水呈靜態(tài)不流動(dòng)時(shí)，水中硝態(tài)氮隨時(shí)間的變化如圖1所示。由圖1可見(jiàn)，井水中沒(méi)有添加乙醇時(shí)(即control),因?yàn)樵泻猩倭康挠袡C(jī)碳，能夠?yàn)榉聪趸阇^^&//08^08-2提供少量碳源，菌株也可維持活性，但隨著碳源的缺失，反硝化進(jìn)程終止，水中的硝酸鹽氮含量基本維持穩(wěn)定；用乙醇做外加碳源后，當(dāng)C/N從1到9改變時(shí)，硝酸鹽氮的去除速率隨C/N比的增大而增大，在144小時(shí)的實(shí)驗(yàn)周期內(nèi)，最終的硝酸鹽氮含量為2.23mg丄—1，去除率達(dá)93.6%。2、模擬反應(yīng)器井水中總有機(jī)碳(TOC)的變化情況，在不同C/N比下，當(dāng)水呈靜態(tài)不流動(dòng)時(shí)，水中TOC隨時(shí)間的變化如圖2所示。從圖2可以看出，沒(méi)有添加乙醇時(shí)，測(cè)得井水中存在少量有機(jī)碳(41.98mg'I/1),在添加乙醇后，隨著菌株反硝化作用的進(jìn)行，碳源被消耗，反應(yīng)器出水中的TOC值不斷下降，這在C/N比較低(C/NS5)時(shí)很明顯，在C/N55時(shí)出水中TOC較低；而當(dāng)C/N比為7和9時(shí)，反應(yīng)器出水中TOC的殘留量較高，說(shuō)明C/N過(guò)量，超過(guò)了菌體生長(zhǎng)對(duì)碳源的需求。因此，在為菌體生長(zhǎng)和反硝化作用提供碳源時(shí)，應(yīng)該綜合考慮硝酸鹽氮的去除與菌株對(duì)碳源的需求量，本實(shí)驗(yàn)條件下C/N55較為適宜。3、反應(yīng)器中不同水流速度對(duì)硝酸鹽氮去除的影響，出水中硝酸鹽氮含量隨時(shí)間變化結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出水流速度快則硝酸鹽氮去除率低，三條曲線在144小時(shí)以后仍然有下降趨勢(shì)，由于本實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ秃畬痈叨葍H為80cm，而如果用于地下水原位修復(fù)，水的流徑會(huì)延長(zhǎng)，細(xì)菌反硝化作用的時(shí)間也相應(yīng)增加，則水中硝酸鹽氮的濃度會(huì)進(jìn)一步降低。另外，地下水流速范圍一般在幾十cm，d'1，在平原區(qū)，地下水徑流速度更低。這種實(shí)際情況將更有利于硝酸鹽氮的去除。因此以乙醇為外加碳源按照C/N比為15:1加入到地下水中，利用反硝化細(xì)菌《feZwW/flsp.DB-2可以有效去除硝酸鹽氮污染，同時(shí)不會(huì)因使用的碳源過(guò)量而導(dǎo)致二次污染，出水中遠(yuǎn)硝酸鹽含量低于地下水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。4、從反應(yīng)器出水中檢測(cè)的尺/e^/e/tosp.DB-2菌株的數(shù)量隨時(shí)間的變化看來(lái)，當(dāng)碳源被消耗時(shí)，細(xì)菌衰亡，其數(shù)量大幅度下降，最終恢復(fù)自然的生態(tài)平衡。權(quán)利要求1、一種采用Klebsiellasp.DB-2菌修復(fù)地下水中硝酸鹽污染的方法，其特征是以可溶解含碳有機(jī)物作碳源，使用純化Klebsiellasp.DB-2菌作為生物修復(fù)菌株，修復(fù)方法包括原位修復(fù)和異位修復(fù)。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用《fe^/e/tow.DB-2菌修復(fù)地下水中硝酸鹽污染的方法，其特征是所述可溶解含碳有機(jī)物為乙醇或乙酸鹽。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用DB-2菌修復(fù)地下水中硝酸鹽污染的方法，其特征是所述原位修復(fù)方法是在硝酸鹽污染地區(qū)鉆井或鉆孔，向井內(nèi)或孔內(nèi)灌注或加壓灌注純菌和含碳有機(jī)物的混合液，首次添加時(shí)維持水中菌濃度為106-109個(gè)幾、可溶解含碳有機(jī)物與硝酸鹽氮的摩爾比C/N為1~5:1，對(duì)于硝酸鹽氮含量超過(guò)100mg/L的地下水，第15天再添加一次以保持細(xì)菌的數(shù)量與活性。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用夂/^wW/fl平DB-2菌修復(fù)地下水中硝酸鹽污染的方法，其特征是所述異位修復(fù)方法是將硝酸鹽污染地區(qū)的井水抽出，混合/^^&/^^.DB-2菌種和可溶解的含碳有機(jī)物后，重新灌注到地下；首次添加時(shí)維持水中菌濃度為106-109個(gè)幾、可溶解的含碳有機(jī)物與硝酸鹽氮的摩爾比C/N為1~5:1，對(duì)于硝酸鹽氮含量超過(guò)100mg/L的地下水，第15天再投加一次以保持細(xì)菌的數(shù)量與活性。5、根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用DB-2菌修復(fù)地下水中硝酸鹽污染的方法，其特征是所述純化尺/efe/e/^^.DB-2菌種的制備按如下過(guò)程進(jìn)行a、菌種的選擇取垃圾滲濾液，加入到反硝化細(xì)菌培養(yǎng)基中富集，在厭氧條件下得到富集菌液后，取菌液在反硝化細(xì)菌培養(yǎng)基上按照倍比稀釋的方法涂布，待長(zhǎng)出菌落后，挑取菌落，在反硝化細(xì)菌培養(yǎng)基上劃線，經(jīng)過(guò)多次劃線分離，得到純化的單菌落；將形態(tài)不同的單菌落分別接種到反硝化富集培養(yǎng)基中富集后，用格利斯試劑進(jìn)行定性的菌種篩選，再將所得的菌株分別進(jìn)行定量實(shí)驗(yàn)，篩出一株異養(yǎng)兼性厭氧的高效反硝化細(xì)菌，其菌落為圓形、乳白色、表面光滑、中間突起、邊緣整齊、易挑取，革蘭氏陰性，鏡檢呈短桿狀、八字形排列細(xì)菌，經(jīng)16SrDNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定為克雷伯氏幻efc!W/a印.，獲得Klebsiellasp.DB-2菌株；b、幻efe!W/a^.DB-2菌種子液培養(yǎng)采用反硝化細(xì)菌培養(yǎng)基，將所述反硝化細(xì)菌培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)到7.2-8.4后滅菌，接種步驟a所得K/efe/e〃a平DB-2菌株，28匸30'C厭氧培養(yǎng)48小時(shí)，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算菌數(shù)使其濃度達(dá)到1081011個(gè)/L數(shù)量級(jí)。6、根據(jù)權(quán)利要求書5所述的方法，其特征是所述接種的反硝化細(xì)菌《/eZ^Wto^.DB-2的菌液接種量按體積比為1%~3%。全文摘要一種采用Klebsiellasp.DB-2菌修復(fù)地下水中硝酸鹽污染的方法，其特征是以可溶解含碳有機(jī)物作碳源，使用純化Klebsiellasp.DB-2菌作為生物修復(fù)菌株，修復(fù)方法包括原位修復(fù)和異位修復(fù)。本發(fā)明方法可以有效地用于地下水硝酸鹽污染的生物修復(fù)。文檔編號(hào)C02F3/34GK101613156SQ20091014440公開(kāi)日2009年12月30日申請(qǐng)日期2009年8月7日優(yōu)先權(quán)日2009年8月7日發(fā)明者嚴(yán)小三,詠劉,錢家忠,舟陳,陳天虎,雷馬申請(qǐng)人:合肥工業(yè)大學(xué)