專利名稱：黑麥草-高效微生物聯(lián)合修復(fù)石油污染鹽堿土壤的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域，涉及微生物菌劑與植物復(fù)配修復(fù)土壤的方法。
背景技術(shù)：
油田區(qū)土壤的石油污染問題在我國普遍存在，成為油田清潔生產(chǎn)及可持續(xù)發(fā)展的 障礙。在我國許多油田都處于濱海鹽堿地帶及生態(tài)環(huán)境惡劣地區(qū)，對土壤環(huán)境的修復(fù)與生 態(tài)環(huán)境的改善是這些地區(qū)面臨的一個主要問題。因此采用生物技術(shù)既可以修復(fù)石油污染 土壤，還可以有效改善油田區(qū)生態(tài)環(huán)境。石油污染土壤修復(fù)過程中高效微生物菌劑的添加 及植物修復(fù)是目前常用的生物修復(fù)技術(shù)。但由于鹽堿土壤的特殊性質(zhì)，生物修復(fù)過程中菌 劑的使用及植物修復(fù)效果會受到影響，特別是鹽堿環(huán)境中植物的生長受到抑制。利用微生 物-植物的聯(lián)合修復(fù)技術(shù)，可以有效改善修復(fù)過程中鹽堿的負(fù)面影響。許多微生物可以與 植物形成共生關(guān)系，促進(jìn)植物根系的生長。因此開發(fā)鹽堿土壤植物-微生物物聯(lián)合修復(fù)技 術(shù)對我國鹽堿區(qū)石油污染土壤修復(fù)具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種黑麥草_高效微生物聯(lián)合修復(fù)石油污染鹽堿土壤的方 法。本發(fā)明黑麥草_高效微生物聯(lián)合修復(fù)石油污染鹽堿土壤的方法，包括如下步驟1)實(shí)驗(yàn)過程中將土壤破碎過篩，在花盆中放入石油污染土壤，用自來水沖洗壓鹽， 待土壤自然干燥后；2)將保藏在斜面培養(yǎng)基中的菌種轉(zhuǎn)接到IOOmL種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基組成 蛋白胨1%，牛肉膏0. 5%，NaC10. 5%，pH為7.0，121°C蒸汽滅菌20min備用；按的接種 量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖1 %，酵母粉0. 5 %，豆粕粉1 %，MgS04 · 7H20 0. 03%, NaCl 0. 5%，pH為7. 0 ；把草炭和麩皮在密閉滅菌箱中高壓蒸汽滅菌，冷卻后按草 炭麩皮重量比9 1混合均勻；將所得發(fā)酵液與的草炭麩皮混合物按V W為1 2混勻， 自然風(fēng)干，裝袋封口，制成菌劑；所使用的菌種為(1)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilIus SWH_1)，或(2)多食鞘 Mllff (Sphingobacterium multivorum SWH-2), ^； (3)㈱李畐身寸f 云力ff 胃(Acinetobacter radioresistens R-1),或(4)紅平紅球菌(Rhodococcus erythropolis R-5),或(5)以 上四種菌的混合菌，重量比例為1 1 1 1或(6)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis ASl. 504)及熒光假單孢菌(Pseudomonas fluorescens ASl. 219)的混合菌，重量比例為 1 1 ；六株菌種均購于中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心。3)將加入菌劑并混勻的土壤中均勻撒入黑麥草種子，播種量為1-1. 5kg/畝，上部 覆土 0. 5-1. 0cm，均勻澆水使土壤保持濕潤狀態(tài)，待植物發(fā)芽生長的正常要求管理。技術(shù)特點(diǎn)選取黑麥草(Lolium perenne L.)作為修復(fù)植物，其特點(diǎn)為須根發(fā) 達(dá)，叢生，分蘗很多，適合于表層土壤石油污染的修復(fù)。黑麥草比較耐濕、耐鹽堿，在含氯鹽0. 25%以下的土壤上生長良好，但最適宜的土壤pH為6 7，在土壤pH為5 8時生長也 較好。黑麥草對管理要求粗放，不需要專業(yè)維護(hù)，適應(yīng)不同的環(huán)境條件，生長期長，在華北地 區(qū)可在冬天生長并越冬，因而具有較好的修復(fù)效果。有益效果1.微生物與菌劑聯(lián)合可以起到協(xié)同作用，微生物菌劑的加入可以促進(jìn)植物的生 長，改善土壤的結(jié)構(gòu)，降低土壤的pH值(從8. 2降到7. 8)，使土壤形成利于污染物降解的環(huán) 境條件。2.黑麥草等園林植物除具有促進(jìn)石油烴降解的作用外，還具有景觀綠化的作用， 通過黑麥草的種植可以美化油田環(huán)境，甚至在冬季也能正常生長。同時，收割的黑麥草在污 染物未超標(biāo)的前提下還可用作飼料，具有一定的經(jīng)濟(jì)效益。3.利用植物-微生物聯(lián)合修復(fù)技術(shù)，可以大大提高石油烴的降解效果，經(jīng)五個月 的生長時間石油烴降解率可以達(dá)到57% ( 二氯甲烷回流提取，重量法)。利用該技術(shù)可以 減少單純微生物修復(fù)所需要的翻耕，補(bǔ)充菌劑的措施，可以在較長的時間內(nèi)使土壤中的石 油烴具有較好的去除效果。


圖1.實(shí)施例1的修復(fù)過程中黑麥草生物量的變化。0，黑麥草；1，黑麥草 +Bacillus subtilis SffH-I ；2, H^ipt +Sphingobacterium multivorum SWH-2 ；3, H^ 草+Acinetobacter radioresistens R-I ;4，黑麥草+Rhodococcus erythropolis R-5 ； 5,黑麥草 + 混合菌Bacillus subtilis SffH-1, Sphingobacteriummultivorum SWH2, Acinetobacter radioresistens R-I, Rhodococcus erythropolis R_5;6,黑麥草 + 混合 菌BacillussubtilisASl. 504，Pseudomonasfluorescens ASl. 219.誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏 差·圖2.實(shí)施例1的黑麥草與不同菌劑聯(lián)合修復(fù)效果的比較.1，黑麥草 +Bacillus subtilis SffH-I ；2, H^ipt +Sphingobacterium multivorum SWH-2 ；3, H^ 草+Acinetobacter radioresistens R-I ;4，黑麥草+Rhodococcus erythropolis R-5 ； 5,黑麥草 + 混合菌Bacillus subtilis SffH-1, Sphingobacteriummultivorum SWH2, Acinetobacter radioresistens R-I, Rhodococcus erythropolis R_5;6,黑麥草 + 混合 菌BacillussubtilisASl. 504，PseudomonasfluorescensASl. 219.誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)偏差.圖3.實(shí)施例1的修復(fù)過程DGGE分析結(jié)果。1修復(fù)前土壤；2_7加入不同菌劑土 壤，8-13種植黑麥草并加入不同菌劑，14，黑麥草；15，空白。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 在南開大學(xué)生物測試中心進(jìn)行的盆栽試驗(yàn)對采自勝利油田的污染土壤風(fēng)干后磨碎，過2mm篩。取樣測定土壤的全鹽，總石 油烴含量等物理化學(xué)指標(biāo)。經(jīng)測定土壤的總石油烴含量6. 19%,pH7. 9，有機(jī)質(zhì)0. 58% ；總 N 2. 75g kg—1 ；總P，0. llgkg—1。不同石油烴組分的測定結(jié)果如下飽和烴50. 5%，芳香烴 20. 8%，極性物 27. 7%。不同水土比洗鹽條件下對土壤含鹽量及發(fā)芽情況的影響，根據(jù)表1的結(jié)果，洗鹽水土比應(yīng)大于0. 75，此時土壤含鹽量可由最初的4. 276%降低到0. 607，黑麥草可在種植6 日后正常發(fā)芽生長。表1不同水土比條件下洗鹽后的全鹽含量及黑麥草發(fā)芽情況 選用六種不同菌劑組成如下⑴枯草芽孢桿菌，(2)多食鞘氨醇桿菌，⑶抗輻射 不動桿菌，(4)紅平紅球菌，(5)以上各菌的混合菌，(6)枯草芽孢桿菌及熒光假單孢菌的混 合菌。各菌在其最佳培養(yǎng)條件培養(yǎng)至對數(shù)生長期后單獨(dú)或混合加入到草炭中制成菌劑，菌 液與草炭比例為1 2 1 3(w/w).各菌在其最佳培養(yǎng)條件培養(yǎng)至對數(shù)生長期后單獨(dú) 或混合加入到草炭中制成菌劑，菌液與草炭比例為1 2 1 3(w/w).加入不同比例的 菌劑后，將土壤與菌劑充分混合均勻。將IOOOg 土壤放入12cmX 12cm花盆，菌劑與土壤充分混合后播種黑麥草種，覆土 0. 5-lcm后噴灑自來水使土壤充分濕潤但沒有多余水分從花盆底部流出，定期澆水保持土 壤濕潤，162天后收割測定黑麥草的生物量，測定土壤中的石油烴含量及用DGGE技術(shù)測定 土壤微生物群落變化。收獲得到不同處理的生物量結(jié)果見圖1，由圖中可以看出第6種處理組，即添加4 種菌的混合菌與黑麥草聯(lián)合修復(fù)時，黑麥草生物量最大，而單一種植黑麥草的生物量最小。 圖中看出添加菌劑后的黑麥草的生物量都比單一種植黑麥草的生物量要高，即菌劑的添加 促進(jìn)了黑麥草植物的生長。圖2給出了六種菌劑及黑麥草聯(lián)合修復(fù)對石油污染土壤的降解效果。六種不同 菌劑與黑麥草聯(lián)合修復(fù)對土壤石油烴都具有較好的修復(fù)效果，162天后石油烴降解率為 53. 03% -58. 73%。其中四種混合菌與黑麥草的聯(lián)合修復(fù)效果最好，降解率達(dá)到58. 73%, 比單一菌和黑麥草的聯(lián)合修復(fù)效果都高，且比空白高出18%。四種單一菌和黑麥草的聯(lián)合 修復(fù)中，降解效果的順序?yàn)榧t平紅球菌>枯草芽孢桿菌>多食鞘氨醇桿菌>抗輻射不動桿 菌，這四種菌劑和黑麥草的修復(fù)效果差異不大，最大的差異僅為1.9%。四種單一菌和黑麥 草的聯(lián)合修復(fù)中均比混合菌2(枯草芽孢桿菌和熒光假單胞菌)的修復(fù)效果要好。菌劑和黑 麥草的聯(lián)合修復(fù)降解率比黑麥草的單一修復(fù)要高，黑麥草單一修復(fù)石油降解率為48. 36%。圖3中不同處理土壤中DGGE條帶較未處理樣品比較都有增多。G1-G7為個處理都 存在的一般條帶，Sl-Sll為只有在個別樣品中出現(xiàn)的條帶。圖中的結(jié)果可以說明通過植物 與微生物的聯(lián)合處理，可以增加土壤微生物的多樣性。
權(quán)利要求
一種黑麥草 高效微生物聯(lián)合修復(fù)石油污染鹽堿土壤的方法，包括如下步驟1)實(shí)驗(yàn)過程中將土壤破碎過篩，在花盆中放入石油污染土壤，用自來水沖洗壓鹽，待土壤自然干燥后；2)將保藏在斜面培養(yǎng)基中的菌種轉(zhuǎn)接到100mL種子培養(yǎng)基中，種子培養(yǎng)基組成蛋白胨1％，牛肉膏0.5％，NaCl0.5％，pH為7.0，121℃蒸汽滅菌20min備用；按1％的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基組成葡萄糖1％，酵母粉0.5％，豆粕粉1％，MgSO4·7H2O 0.03％，NaCl0.5％，pH為7.0；把草炭和麩皮在密閉滅菌箱中高壓蒸汽滅菌，冷卻后按草炭麩皮重量比9∶1混合均勻；將所得發(fā)酵液與的草炭麩皮混合物按V∶W為1∶2混勻，自然風(fēng)干，裝袋封口，制成菌劑；所使用的菌種為(1)枯草芽孢桿菌(Bacillussubtillus SWH 1)，或(2)多食鞘氨醇桿菌(Sphingobacterium multivorum SWH 2)，或(3)抗輻射不動桿菌(Acinetobacter radioresistens R 1)，或(4)紅平紅球菌(RhodococcuserythropolisR 5)，或(5)以上四種菌的混合菌，重量比例為1∶1∶1∶1或(6)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis AS1.504)及熒光假單孢菌(Pseudomonas fluorescens AS1.219)的混合菌，重量比例為1∶1；3)將加入菌劑并混勻的土壤中均勻撒入黑麥草種子，播種量為1 1.5kg/畝，上部覆土0.5 1.0cm，均勻澆水使土壤保持濕潤狀態(tài)，待植物發(fā)芽生長的正常要求管理。
全文摘要
黑麥草-高效微生物聯(lián)合修復(fù)石油污染鹽堿土壤的方法，本發(fā)明屬于環(huán)境修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域涉及微生物菌劑與植物復(fù)配修復(fù)土壤的方法。先進(jìn)行土壤的預(yù)處理，再制成不同菌劑，黑麥草的種植，待發(fā)芽后按植物生長的正常要求管理。微生物與菌劑聯(lián)合可以起到協(xié)同作用，微生物菌劑的加入可以促進(jìn)植物的生長，改善土壤的結(jié)構(gòu)，降低土壤的pH值，使土壤形成利于污染物降解的環(huán)境條件。黑麥草等園林植物除具有促進(jìn)石油烴降解的作用外，還具有景觀綠化的作用，同時，收割的黑麥草在污染物未超標(biāo)的前提下還可用作飼料，具有一定的經(jīng)濟(jì)效益。提高石油烴的降解效果，經(jīng)五個月的生長時間石油烴降解率可以達(dá)到57％。利用該技術(shù)可以減少單純微生物修復(fù)所需要的翻耕，補(bǔ)充菌劑的措施，在較長的時間內(nèi)使土壤中的石油烴具有較好的去除效果。
文檔編號B09C1/10GK101890426SQ20101022941
公開日2010年11月24日 申請日期2010年7月19日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月19日
發(fā)明者周啟星, 唐景春, 牛曉偉, 王如剛, 王敏, 董健 申請人:南開大學(xué)