專利名稱：一種毒死蜱污染土壤的生物修復(fù)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及環(huán)境保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種毒死蜱污染土壤的生物修復(fù)方法。
背景技術(shù)：
毒死蜱是一種高效、廣譜、中等毒性的有機(jī)磷殺蟲、殺螨劑，廣泛用于防治水稻、麥 類、玉米、棉花、甘蔗、茶葉、果樹、花卉和牧畜等方面的螟蟲、卷葉蟲、粘蟲、介殼蟲、蚜蟲、葉 蟬和害螨等百余種害蟲，是我國用量最大的殺蟲劑之一。毒死蜱在土壤中的半衰期則受毒 死蜱濃度、土壤酸堿度、溫濕度、土質(zhì)、微生物活動狀況等各種因素影響，在不同的條件下， 其半衰期從幾天到幾百天不等。毒死蜱的大量使用及其持久性導(dǎo)致土壤的污染，已引起人 們的重視。生物修復(fù)是治理土壤有機(jī)污染、維護(hù)土壤環(huán)境健康、實(shí)現(xiàn)可持續(xù)利用的重要措施 之一。生物修復(fù)的效率受污染物性質(zhì)、土壤微生物生態(tài)結(jié)構(gòu)以及土壤理化性質(zhì)、環(huán)境條件 等生物和非生物因子的影響，生物強(qiáng)化是提高生物修復(fù)效率的有效方法?，F(xiàn)行的生物強(qiáng)化 主要利用高效降解菌，通常采用的高效降解菌有土著菌、外源菌以及基因工程菌。高效降 解菌進(jìn)入污染土壤面臨兩個問題1)由于生物和非生物的脅迫作用，引入的微生物難以適 應(yīng)土壤環(huán)境，無法維持長期的降解活性；2)存活的降解菌在土壤中難以達(dá)到良好的廣深分 散，限制了土壤整體降解能力與凈化功能的提高。如何從本質(zhì)上增強(qiáng)土壤中有機(jī)物生物降 解的功能多樣性和持久性、增強(qiáng)土壤凈化功能，是生物修復(fù)的關(guān)鍵所在，也是有機(jī)污染生物 修復(fù)有待解決的技術(shù)瓶頸問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種毒死蜱污染土壤的生物修復(fù)方法，該方法解決了傳統(tǒng)方法微生 物難以適應(yīng)土壤環(huán)境以及分散困難的問題。一種毒死蜱污染土壤的生物修復(fù)方法，包括將側(cè)芽孢桿菌 (BacillusLatersprorus)DSP或其攜帶的質(zhì)?；虬撡|(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子接種到殘留毒死蜱的
土壤中。側(cè)芽孢桿菌DSP保藏于位于武漢市珞珈山武漢大學(xué)的中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)，保藏日期為2010年8月16日，保藏號為CCTCCAB 2010351。上述側(cè)芽孢桿菌DSP主要生理學(xué)特征在營養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基上，菌落圓形，光滑，不透明，濕潤，乳白色。菌落直徑1 2mm左右。革蘭氏染色陰性，24h培養(yǎng)細(xì)胞桿狀，細(xì)胞約0. 3mX 2m，芽孢側(cè)中生，孢囊膨大，鞭 毛周生。優(yōu)選地，所述的土壤pH值為2 8. 5，所述的土壤毒死蜱含量為0. 1 2mg/kg ；所 述的土壤有機(jī)質(zhì)含量為5 50g/kg。本發(fā)明還提供了一種側(cè)芽孢桿菌(Bacillus Latersprorus)DSP攜帶的質(zhì)粒及包 含該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。
本發(fā)明側(cè)芽孢桿菌DSP具有降解毒死蜱的能力，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)該菌株的質(zhì)粒為可轉(zhuǎn) 移質(zhì)粒，通過在土壤中接種該質(zhì)?；蛘吆撡|(zhì)粒的菌株，該質(zhì)?？梢赞D(zhuǎn)化到土壤微生物中， 甚至可能與土壤微生物中基因發(fā)生重組，一方面解決了外源微生物在土壤中生存困難的問 題，另一方面降解菌能最大限度的分散，盡可能地降解毒死蜱


圖1為側(cè)芽孢桿菌DSP電鏡觀察圖；圖2為側(cè)芽孢桿菌DSP和質(zhì)粒pDOC處理土壤中毒死蜱的降解曲線；圖3為側(cè)芽孢桿菌DSP和質(zhì)粒pDOC處理土壤中毒死蜱降解菌數(shù)量變化曲線。
具體實(shí)施例方式側(cè)芽孢桿菌DSP在2010年8月16日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)， 其分離、純化和鑒定過程同王曉等公開的側(cè)芽孢桿菌(王曉等，毒死蜱降解菌株Bacillus latersprorus DSP的降解特性及其功能定位，土壤學(xué)報，第43卷4期，2006年07月)培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基酵母膏，5. Og ；蛋白胨10. 0g，氯化鈉10. Og ；蒸餾水，IOOOml ；ρΗ，7· 0。 高壓蒸汽滅菌20min。基礎(chǔ)培養(yǎng)基=MgSO4· 7H20, 20mg ；EDTA, 5mg ；FeSO4 · 7H20, 2mg ；ZnSO4 · 7H20,0. Img ； MnSO4 · H20,0. 03mg ；H3BO3,0. 3mg ；CoSO4 · 7Η20，0· 24mg ；CuSO4 · 5Η20，0· Olmg ；NiSO4 · 7H20, 0. 02mg ；Na2MoO4 · 2Η20，0· 03mg ；Ca(OH)2,0. 5mg ；蒸餾水，IOOOml ；pH, 7. 0。高壓蒸汽滅菌 20minoM 培養(yǎng)基=K2HPO4 · 3Η20，2· 96g ；KH2PO4,0. 87g ； (NH4)2SO4,1. Ig ；MgSO4,0. 097g ； MnSO4 · H20,0. 025g ；FeSO4 · 7H20，0. 005g ；CaSO4,0. 0015g ；抗壞血酸，0. 005g ；蒸溜水， 1000ml ;pH，7. 0。高壓蒸汽滅菌 20min。純培養(yǎng)系統(tǒng)中毒死蜱的提取將培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入分液漏斗中，用3X50ml 二氯甲烷液-液分配萃取，下層有機(jī)相經(jīng)過 無水硫酸鈉合并于250ml平底燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮至l_2ml，然后用氮?dú)饬鞔蹈桑?用重蒸石油醚定容至5ml供GC分析。土壤中毒死蜱的提取取土 20g，加入50ml丙酮和20ml水，150r -min"1振蕩lh，過濾，濃縮后將培養(yǎng)液轉(zhuǎn) 入分液漏斗中，用3 X 50mL石油醚三次振搖，液-液分配萃取，上層有機(jī)相經(jīng)過無水硫酸鈉 合并于250mL平底燒瓶中，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上濃縮至l_2mL，用重蒸石油醚定容至IOmL供GC 分析。毒死蜱的氣相色譜測定氣相色譜儀GC-9790 ；檢測器FPD ；色譜柱AT. RPAII農(nóng)藥分析專用柱， 30mX0. 32讓Χ0.25μπι;進(jìn)樣 口溫度250°C ；柱溫230°C ；檢測器溫度250°C ；載氣(N2) 5OmL · mirf1 ；氧氣120mL · mirf1 ；空氣80mL · mirT1。側(cè)芽孢桿菌DSP質(zhì)粒消除側(cè)芽孢桿菌DSP接種于3ml LB培養(yǎng)基中，30°C搖床過夜培養(yǎng)，然后取200 μ 1菌液，分別接入含吖啶橙濃度為lSOmgl^dOOmgL-1的5ml LB培養(yǎng)基中，30°C搖床培養(yǎng)24h，分 別稀釋涂布于LB平板，42°C培養(yǎng)24h，再于30°C培養(yǎng)24h，然后取若干單個菌落分別稀釋并 涂布于LB平板上，30°C培養(yǎng)過夜，再挑取單個菌落分別點(diǎn)種于LB平板及M平板(含毒死蜱 SOmgr1)的對應(yīng)位置，培養(yǎng)2 3d觀察平板的生長情況。在M平板(含毒死蜱SOmgL—1)上 不生長的菌落視為質(zhì)粒消除菌。質(zhì)粒pDOC的提取質(zhì)粒的提取采用堿法，取1. 5ml新鮮側(cè)芽孢桿菌DSP(圖1)培養(yǎng)液倒入1. 5ml 印pendorf管中，4°C下12000 X g離心30s。棄上清液將菌體沉淀重懸浮于100 μ 1溶液I，室 溫下放置5min。加入溶液II200 μ 1，溫和顛倒印pendorf管數(shù)次，冰浴5min。加入150 μ 1溶 液III，溫和顛倒10s，冰浴10min，4°C下12000Xg離心lOmin。上清液移入干凈印pendorf 管加入等體積的酚/氯仿(1 1)，振蕩混勻，4°C下12000g離心5min。將水相移入干凈的 印pendorf管中加入2倍體積的無水乙醇，振蕩混勻置于-20°C冰箱中20min，然后在4°C 下12000Xg離心lOmin。棄上清液，加入Iml 70%的乙醇沉淀一次，4°C下12000Xg離心 5111土11。吸除上清液，真空干燥101^11，將沉淀溶于2(^1 TE緩沖液(pH8. 0，含20μ g ml-IRNA 核酸酶Α)中，儲于_20°C冰箱中。質(zhì)粒pDOC轉(zhuǎn)化取1的側(cè)芽孢桿菌DSP質(zhì)粒加入感受態(tài)E. Coli JM109，輕輕搖勻，冰浴放 置30min，42°C水浴中熱擊90s后迅速置于冰浴冷卻5min，加入ImlLB液體培養(yǎng)基，混勻 后在37°C振蕩培養(yǎng)lh，使細(xì)菌恢復(fù)正常生長狀態(tài)，分別取100 μ 1涂布M平板(含毒死蜱 50mg · L-1)，于30°C培養(yǎng)2 3d觀察細(xì)菌生長情況，篩選獲得E. Coli JM109 (pDOC)。菌株毒死蜱降解力試驗(yàn)在100ml滅菌的三角瓶中加入20ml基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加毒死蜱濃度Img · L—1，分別 接種側(cè)芽孢桿菌DSP (pDOC)、質(zhì)粒消除后的側(cè)芽孢桿菌DSP (pD0C_)、質(zhì)?；貜?fù)的側(cè)芽孢桿菌 DSP(pDOC)、Ε. Coli JM109、Ε. ColiJM109 (pDOC)，在 ρΗ 7. 0、25°C、150r · mirT1 的條件下黑 暗振蕩培養(yǎng)，3d后定時取樣，測定毒死蜱降解率。同時設(shè)不加菌的對照，處理與對照各為3 個重復(fù)。試驗(yàn)結(jié)果如表1，質(zhì)粒消除后，原毒死蜱降解菌失去降解能力；E. Coli JM109本身 不具備對毒死蜱的降解能力，獲得質(zhì)粒PDOC后獲得降解能力。結(jié)果證明，側(cè)芽孢桿菌s DSP 對毒死蜱的降解功能位于質(zhì)粒pDOC。表1不同試驗(yàn)菌株對毒死蜱的降解率
權(quán)利要求
一種毒死蜱污染土壤的生物修復(fù)方法，包括將側(cè)芽孢桿菌(BacillusLatersprorus)DSP或其攜帶的質(zhì)?；虬撡|(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子接種到殘留毒死蜱的土壤中，所述的側(cè)芽孢桿菌DSP的保藏號為CCTCC AB 2010351。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物修復(fù)方法，其特征在于所述的土壤PH值為2 8.5。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的生物修復(fù)方法，其特征在于所述的土壤有機(jī)質(zhì)含量為5 50g/kgo
4.一種權(quán)利要求1所述的側(cè)芽孢桿菌(Bacillus Latersprorus)DSP攜帶的質(zhì)粒。
5.一種含權(quán)利要求4所述的質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種毒死蜱污染土壤的生物修復(fù)方法，包括將側(cè)芽孢桿菌(Bacillus Latersprorus)DSP或其攜帶的質(zhì)粒或包含該質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子接種到殘留毒死蜱的土壤中。本發(fā)明側(cè)芽孢桿菌DSP具有降解毒死蜱的能力，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)該菌株的質(zhì)粒為可轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，通過在土壤中接種該質(zhì)?；蛘吆撡|(zhì)粒的菌株，該質(zhì)粒可以轉(zhuǎn)化到土壤微生物中，甚至可能與土壤微生物中基因發(fā)生重組，一方面解決了外源微生物在土壤中生存困難的問題，另一方面降解菌能最大限度的分散，盡可能地降解毒死蜱。
文檔編號B09C1/10GK101966530SQ20101027681
公開日2011年2月9日 申請日期2010年9月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月9日
發(fā)明者張群, 王曉, 虞云龍 申請人:浙江大學(xué)