專利名稱：一種產(chǎn)pva脫氫酶的基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn) PVA 脫氫酶(polyvinyl alcohol dehydrogenase, ECl. 1. 99. 23，簡稱PVADH)的基因工程菌及其構(gòu)建方法，特別是一種高產(chǎn)PVA脫氫酶的基因 工程菌及構(gòu)建方法與應(yīng)用，屬于遺傳工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
PVA (全稱polyvinyl alcohol)，即聚乙烯醇，是一種人工合成的水溶性的高分子 化合物，具有如下優(yōu)良理化特性溶解性好PVA溶于水，水溫越高則溶解度越大，但幾乎不 溶于有機(jī)溶劑；成膜性強(qiáng)PVA易成膜，其膜的機(jī)械性能優(yōu)良，膜的拉伸強(qiáng)度隨聚合度、醇解 度升高而增強(qiáng)；粘接性好PVA與親水性的纖維素有很好的粘接力，一般情況，聚合度、醇解 度越高，粘接強(qiáng)度越強(qiáng)；熱穩(wěn)定性好PVA粉末加熱到100°C左右時(shí)，外觀逐漸發(fā)生變化。由 于其特殊的理化性能，目前主要用于紡織行業(yè)漿料、織物整理劑、維尼綸纖維原料；建筑裝 潢行業(yè)的107膠、內(nèi)外墻涂料、粘合劑；化工行業(yè)用作聚合乳化劑、分散劑及聚乙烯醇縮甲 醛、縮乙醛、縮丁醛樹脂；造紙行業(yè)用作紙品粘合劑；農(nóng)業(yè)方面用于土壤改良劑、農(nóng)藥粘附 增效劑和聚乙烯醇薄膜；還可用于日用化妝品及高頻淬火劑等方面。紡織工業(yè)中的漿料，以PVA為主要成分，紡織品經(jīng)過上漿處理，其理化性能更好、 手感更佳。但是，上漿工藝也帶來了污染的問題，紡織品經(jīng)過上漿后，還需要進(jìn)行退漿處理， 去除紡織品上未結(jié)合的PVA，傳統(tǒng)的退漿過程是用高溫加酸/堿或是用氧化劑來破壞PVA的 長鏈結(jié)構(gòu)使其降解，但是化學(xué)方法會(huì)對織物纖維結(jié)構(gòu)造成了較大的損傷，同時(shí)退漿廢水的 排放會(huì)對環(huán)境造成極大的污染，如果對污水進(jìn)行處理，后續(xù)處理的費(fèi)用高昂，又會(huì)增加企業(yè) 的負(fù)擔(dān)。近年來人們尋求通過生物法降解PVA，提高了紡織品的質(zhì)量，避免了化學(xué)法降解 PVA對植物纖維造成的損傷。目前，國內(nèi)外嘗試通過PVA降解酶降解PVA。PVA降解酶是一 個(gè)酶系，它們作用的共同效果是能降解PVA。目前已正式報(bào)道的PVA降解酶主要包含三個(gè)種 類PVA脫氫酶(EC1. 1. 99. 23)、PVA氧化酶(仲醇氧化酶)(EC1. 1. 3. 30)和氧化型PVA 水解酶(β -雙酮水解酶)(EC3. 7. 1. 7)。目前對于PVA降解的研究主要集中在三個(gè)方面 1.篩選能夠降解PVA的微生物；2.純化PVA降解酶；3.克隆與PVA降解相關(guān)的基因。PVA脫氫酶(EC1. 1. 99. 23)以PQQ為電子受體的情況下，將PVA脫氫氧化為酮 基化合物。目前，關(guān)于PVA脫氫酶基因的報(bào)道不多，1996年Siimao等人在大腸桿菌中用載體 Pucl8構(gòu)建了 PVA降解菌/ ^ domonas spl VM15C的基因文庫。編碼PVA脫氫酶基因的蛋 白有639個(gè)氨基酸殘基，發(fā)現(xiàn)有一個(gè)血紅素結(jié)合位點(diǎn)和一個(gè)PQQ結(jié)合位點(diǎn)，氨基酸序列 表明與其它醌蛋白脫氫酶有較低的相似性(^iimao M et, Cloning and characterization of the gene encoding pyrroloquinoline quinonone- dependent poly (vinyl alcohol) dehydrogenase of Pseudomonas sp . st rain VM15C) ;Mamoto *艮據(jù)純化的 PVA 脫氧酶氨 基酸的N端序列，克隆出PVA脫氫酶的全基因，全長196^p，共655個(gè)氨基酸，重組酶與/ ^/ domonas spl VM15C產(chǎn)的PVA脫氫酶有51%的同源性，該酶除了能夠降解PVA外，還能夠降解二醇類，如聚丙烯醇、1. 3- 丁醇、2. 4-戊二醇等，但該酶不能作用仲醇和叔醇。目前，國外對PVA脫氫酶的研究主要側(cè)重于其基因報(bào)道和降解機(jī)理上，關(guān)于PVA脫 氫酶基因工程菌的研究報(bào)道很少，關(guān)于高產(chǎn)PVA脫氫酶基因工程菌的報(bào)道則更少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種產(chǎn)PVA脫氫酶(polyvinyl alcohol dehydrogenase, ECl. 1. 99. 23，簡稱 PVADH)的酵母工程菌。所述酵母工程菌染色體上攜帶有PVA脫氫酶的基因、PVADH\所述PVA脫氫酶核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。所述PVA脫氫酶基因位于表達(dá)載體PPIC9K上。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種PVA脫氫酶基因工程菌的構(gòu)建方法。為解決上述技術(shù)問題提供如下具體步驟 第一步PVA脫氫酶基因設(shè)計(jì)
畢赤酵母O0ZcAia pastoris^的表達(dá)系統(tǒng)有著特殊的密碼子偏好性，如果不對廣權(quán)所 基因要表達(dá)的密碼子的進(jìn)行一定的修飾，畢赤酵母G0ZcAia pastor!S^可能無法正確翻譯 /VJi擬基因，且通過軟件SignalP 3. 0 Server的分析，/VJi擬基因的前75個(gè)堿基為自身的 信號肽。切掉序列的信號肽并根據(jù)畢赤酵母的密碼子偏好性新設(shè)計(jì)的/VA //基因其核苷酸 序列如SEQ ID NO. 1所示。本發(fā)明設(shè)計(jì)的/VJi擬基因合成工作委托上海生工生物工程技術(shù) 服務(wù)有限公司完成。第二步PVA脫氫酶QPVADm重組質(zhì)粒的構(gòu)建
為了使/VA擬基因能在酵母中的可控高效表達(dá)，選用帶有乙醇氧化酶基因(AOX)的啟 動(dòng)子AOXI的畢赤酵母表達(dá)載體(例如pPIC9K，美國hvitrogen公司)，利用合成的廣權(quán)所 基因序列5'端的I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)與3'端的I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，將合成 的/VJi擬基因克隆入載體pPIC9K。由于在AOXI強(qiáng)啟動(dòng)子后面有一段α-因子信號肽序列， 這也為PVA脫氫酶基因在酵母中的正確分泌表達(dá)奠定了基礎(chǔ)；另外，由于PPIC9K載體中含 有氨芐青霉素、遺傳霉素抗性基因，在篩選重組菌時(shí)較為方便。將含有/VJi擬基因的載體與要連接的表達(dá)載體pPIC9K進(jìn)行I和Λ^ I酶切， 連接得到含有/VJi擬基因的重組質(zhì)粒PPIC9K-P權(quán)所。第三步PVA脫氫酶基因工程菌的構(gòu)建
將重組質(zhì)粒pPIC9K-/VJi擬電擊轉(zhuǎn)化宿主畢赤酵母GSl 15，構(gòu)建高效表達(dá)PVA脫氫酶的 組成型畢赤酵母重組菌株。本步驟采用的含PVA脫氫酶合成基因的重組表達(dá)質(zhì)粒PPIC9K+權(quán)i擬可轉(zhuǎn)化畢赤 酵母O0ZcAia pas tor is GS115, hvitrogen)，成為能分泌表達(dá)外源PVA脫氫酶的功能酵母 菌由于含合成基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-/VJi擬上有畢赤酵母AOX基因的部分序列，當(dāng) 重組表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)入酵母細(xì)胞后，通過體內(nèi)同源重組，PPIC9K+權(quán)愿可以定向整合到畢赤酵 母染色體DNA上。在外源誘導(dǎo)物甲醇存在的情況下，AOXI啟動(dòng)子啟動(dòng)外源/VJi擬基因，信 號肽指導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)入畢赤酵母的分泌途徑，正確切割成具有生物活性的外源蛋白表達(dá)產(chǎn) 物，最終將產(chǎn)物分泌至胞外。畢赤酵母的轉(zhuǎn)化常采用電激法或化學(xué)轉(zhuǎn)化法首先接種活化后的畢赤酵母GS115一環(huán)于25 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28 °C-30 °C振蕩培養(yǎng)過夜，然后將上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入100 mL YPD (500 mL三角瓶)液體培養(yǎng)基中，28 °C-30 ！振蕩培養(yǎng)，每隔1 h測定，培養(yǎng)直至菌 體濃度OD6tw為1. 3-1. 5，在冰水中冷卻10 min以上，然后在4°C環(huán)境下，8000 r/min離心 收集菌體，用40 mL預(yù)冷的無菌水懸浮細(xì)胞，在冷水中放置10 min，如此重復(fù)步驟4三次， 即無菌水洗滌3次，用300 4 1^預(yù)冷1 mol/L山梨醇懸浮細(xì)胞，從而獲得受體菌。然后取 50 80 μ L受體菌和5 90 μ g線性化重組表達(dá)質(zhì)粒DNA混勻，電激(電壓1500V 電容 25 μ F ；電阻200 Ω )處理，然后涂布于遺傳霉素(10ug/ml)抗性平板篩選重組子。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種PVA脫氫酶基因工程菌的應(yīng)用方法。為解決上述技術(shù)問題，提供如下技術(shù)方案 第一步重組菌株的篩選
所述重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-/VJi擬上含有遺傳霉素抗性基因，如果重組質(zhì)粒已經(jīng)整合 到染色體上，重組菌株具有遺傳霉素抗性，可在含有遺傳霉素的平板上生長；涂布含遺傳霉 素抗性平板，挑取陽性轉(zhuǎn)化子，即為產(chǎn)PVA脫氫酶酵母工程菌GS115-/VJI。第二步菌株經(jīng)培養(yǎng)分泌PVA脫氫酶 培養(yǎng)基組成(g/L):
種子培養(yǎng)基蛋白胨10-20，酵母提取物5-10，葡萄糖10-20，氯化鈉5_15 ； 發(fā)酵培養(yǎng)基酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基12-15，生物素0. 0002-0. 0005，甲醇10-50 ；微量元 素溶液，MnSO4 ·4Η20 100，ZnCl2 70，Na2MoO4 ·2Η20 35，H3BO3 60，CoCl2 ·6Η20 200，CuSO4 · 5Η20 29，NiCl2 · 6Η20 25，37% 鹽酸 0. 9 mL。優(yōu)選培養(yǎng)基組成(g/L) 種子培養(yǎng)基
蛋白胨15 g/L，酵母提取物8 g/L，葡萄糖15 g/L，氯化鈉10 g/L； 發(fā)酵培養(yǎng)基酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基12-15 g/L,生物素0. 0002-0. 0005 g/L,甲醇10-50 g/L ；微量元素溶液，MnSO4 ·4Η20 100 g/L, ZnCl2 70 g/L，Na2MoO4 · 2H20 35 g/L, H3BO3 60 g/ L, CoCl2 · 6H20 200 g/L, CuSO4 · 5H20 29 g/L, NiCl2 · 6H20 25 g/L, 37% 鹽酸 0. 9 mL。培養(yǎng)方法種子培養(yǎng)，250mL三角瓶，裝液量50mL，培養(yǎng)溫度-30°C，搖床轉(zhuǎn)速 200r/min，培養(yǎng)Mh ；發(fā)酵培養(yǎng)，離心，收集種子，用無菌生理鹽水洗滌兩次，按10%的接種量 接入裝液量為50mL的三角瓶(500 mL)中，發(fā)酵溫度30°C，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵時(shí) 間3-4天。PVA脫氫酶酶活測定方法
在37°C條件下，反應(yīng)液體系中有200 μ 1 PVA1799(10g/L)，1 mM吩嗪乙基硫酸鹽，0.2 mM 2. 6-二氯靛酚，ImM 氰化鉀，1 mM CaCl2, 3 μ M PQQ, 50 mM 磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)， 反應(yīng)體系1 ml。酶活定義為在該條件下，每降低1 ymol PQQ所需要的酶量，單位為mg protein 1O本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于構(gòu)建了一株高效分泌表達(dá)PVA脫氫酶的畢赤酵母基因工程菌， 解決了 PVA脫氫酶產(chǎn)量低的問題；應(yīng)用該菌種生產(chǎn)PVA脫氫酶，產(chǎn)量高、工藝簡單、便于工業(yè) 化應(yīng)用，該菌株生產(chǎn)的目的蛋白直接分泌到胞外，提取過程簡單，產(chǎn)品純度高，發(fā)酵結(jié)束后 PVA脫氫酶Gd權(quán)D活力可達(dá)110U/mL。本發(fā)明為生物法降解PVA的研究、開發(fā)、生產(chǎn)工作 奠定了基礎(chǔ)，有利于早日實(shí)現(xiàn)紡織品退漿工藝的清潔生產(chǎn)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 :PVA脫氫酶基因的合成
PVA脫氫酶0°權(quán)D的基因來源于Sphingopyxis. sp. 113P中含PVA脫氫酶(/VJD基 因的操縱子(GenBank No. AB190288)，其中第3177位到第5141位是編碼/VJi擬的基因。在 切掉基因自身信號肽，并對其進(jìn)行密碼子偏好性等修飾，在其5'端及3'端分別加上feo/P I和Λ^ I酶切位點(diǎn)，新設(shè)計(jì)的/VJi擬基因其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，由上海生工 生物工程有限公司合成。實(shí)施例2 重組質(zhì)粒pPIC9K- /VJi擬的構(gòu)建
帶有/VJi擬基因的載體和表達(dá)載體pPIC9K分別進(jìn)行Λ^ I和I雙酶切，試劑盒 回收后，使用Τ4連接酶進(jìn)行連接。連接反應(yīng)體系為(10 yL):目的基因片斷2 yL，載體 DNA 2 μ L，IOX T4 連接酶 Buffer 1 μ L，T4DNA 連接酶 1 μ L, ddH20 4 μ L。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌JM109進(jìn)行轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化方法如下
(1)無菌狀態(tài)下取感受態(tài)細(xì)胞200μ L置于無菌的微量離心管中；
(2)每管加入1-2μ L重組質(zhì)粒，輕輕旋轉(zhuǎn)以混合內(nèi)容物，在冰上放置30 min；
(3)42°C熱休克90 s (準(zhǔn)確)，不要搖動(dòng)離心管；
(4)快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴中，使細(xì)胞冷卻1-2min；
(5)每管加入無抗生素的普通LB培養(yǎng)液800uL；
(6)用無菌鋪菌器將200μ L菌液鋪于含氨芐青霉素的瓊脂平板，37°C平放20 min直 至液體被吸收，然后倒置培養(yǎng)過夜，觀察。挑選陽性轉(zhuǎn)化子，測序驗(yàn)證，結(jié)果表明連接成功。實(shí)施例3 =PVA脫氫酶基因工程菌的構(gòu)建
將表達(dá)載體PPIC9K- PVADHm Sal I酶切線形化。酶切體系(50 μ L體系)重組質(zhì) 粒 10 μ L，Buffer 5 μ L, Sal I 3 μ L, ddH20 32 μ L。37 °C水浴 3 h，用 PCR 產(chǎn)物純化 試劑盒對線形化產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，電擊法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，具體方法如下
(1)接種活化后的畢赤酵母GS115—環(huán)于25mL YPD液體培養(yǎng)基中，28 °C-30 °C振蕩 培養(yǎng)過夜；
(2)將上述培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入100mL YPD (500 mL三角瓶)液體培養(yǎng)基中，28 °C-30 °C振蕩 培養(yǎng)，每隔1 h測定，培養(yǎng)直至菌體濃度0D_為1. 3-1. 5 ；
(3)在冰水中冷卻10min以上；
(4)48000 r/min離心收集菌體，用40 mL預(yù)冷的無菌水懸浮細(xì)胞，在冷水中放置 10 min ；
(5)重復(fù)步驟4三次，即無菌水洗滌3次；
(6)用300μ L預(yù)冷1 mol/L山梨醇懸浮細(xì)胞；
(7)加入10μ L線形化質(zhì)粒，在冰水中混勻5 min ；
(8)放入冰預(yù)冷的無菌電轉(zhuǎn)化杯(0.2 cm)中，在1500 V，電擊1_2次；
(9)加入1mL預(yù)冷的1 mol/L的山梨醇溶液；
(10)取上述100-200μ L涂布YNB平板(或離心涂布100 μ L)；
(11)28 0C -30 °〇倒置培養(yǎng)1-2天，挑選白色菌落。
實(shí)施例4 酵母工程菌的篩選 1、酵母工程菌的G418篩選
接種畢赤酵母GS115轉(zhuǎn)化子于25 mL YPD液體培養(yǎng)基中，28°C _30°C振蕩培養(yǎng)過夜，離 心收集菌體，無菌水懸浮，取100 μ L分別涂布于含G418終濃度為0. 5、1、2 mg/mL的YPD 平板培養(yǎng)基上，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。2、陽性重組質(zhì)粒PCR驗(yàn)證(25 μ L體系)
體系重組質(zhì)粒 0. 1 μ L，Buffer 2. 5 μ L，引物(20 mmol/L)各 2 μ L，dNTP (各 2. 5 mmol/L) 2 μ L，TagOM 聚合酶 0· 4 μ L, ddH20 18 μ L。反應(yīng)條件94°C預(yù)變性4 min，變性94 °C 1 min、退火55°C 1 min、延伸 72°C Imin 35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸10 min。凝膠電泳驗(yàn)證。3、雙酶切驗(yàn)證提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，進(jìn)行EcoR I和Afco I雙酶切，對產(chǎn)物進(jìn)行電泳驗(yàn) 證。4、酵母工程菌的培養(yǎng)及誘導(dǎo)表達(dá)
(1)陽性轉(zhuǎn)化子和空載體PPIC9K轉(zhuǎn)化的畢赤酵母GS115分別接種于20mL YPD液體 培養(yǎng)基，30°C振蕩培養(yǎng)過夜(穩(wěn)定期)；
(2)離心收集菌體，生理鹽水洗滌2次，轉(zhuǎn)入100mL MGY培養(yǎng)基(加入1 mLlOOX生 物素)中；30°C，200 r/min振蕩培養(yǎng)48 h ；
(3)離心收集菌體，生理鹽水洗滌2次，轉(zhuǎn)入30mL匪液體培養(yǎng)基(加入300 yL甲 醇，300 μ L100X生物素)中；30°C，200 r/min振蕩培養(yǎng)7天；定時(shí)進(jìn)行酶活測定。產(chǎn)物用 SDS-PAGE蛋白電泳分析。實(shí)施例5 發(fā)酵生產(chǎn)PVA脫氫酶
培養(yǎng)基組成種子培養(yǎng)基，蛋白胨15 g/L，酵母提取物8 g/L，葡萄糖15 g/L，氯化鈉10 g/L ；發(fā)酵培養(yǎng)基，酵母氮源基礎(chǔ)培養(yǎng)基12-15 g/L,生物素0. 0002-0. 0005 g/L,甲醇10-50 g/L ；微量元素溶液，MnSO4 ·4Η20 100 g/L, ZnCl2 70 g/L，Na2MoO4 · 2H20 35 g/L, H3BO3 60 g/ L, CoCl2 · 6H20 200 g/L, CuSO4 · 5H20 29 g/L, NiCl2 · 6H20 25 g/L, 37% 鹽酸 0. 9 mL。培養(yǎng)方法種子培養(yǎng)，250mL三角瓶，裝液量50mL，培養(yǎng)溫度-30°C，搖床轉(zhuǎn)速 200r/min，培養(yǎng)Mh ；發(fā)酵培養(yǎng)，離心，收集種子，用無菌生理鹽水洗滌兩次，按10%的接種量 接入裝液量為50mL的三角瓶(500 mL)中，發(fā)酵溫度30°C，搖床轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵時(shí) 間3-4天，PVA脫氫酶0°權(quán)D活力可達(dá)110U/mL。實(shí)施例6 =PVA水溶液處理 種子培養(yǎng)基同實(shí)施例5。酵母工程菌接種于250mL三角瓶，裝液量50mL的種子培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度 280C -30°C，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，培養(yǎng)Mh。按5-10%的比例接入以PVA為唯一碳源的培養(yǎng) 基90小時(shí)，能將lg/L的PVA完全降解。雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
序 列 表<110> <120> <160> <170> <210> <211> <212> <213> <220> <223>
江南大學(xué)
一種產(chǎn)PVA脫氫酶的基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用 1
PatentIn version 3. 3 1
1901 DNA
人工合成序列
根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)，用于基因表達(dá)。
〈400〉 1gaattctccggtaccgtggccgaaactgctcctcaatccggtcacgcagtaccagcagac60cagctggacggcgagactctgtacaaggcaCgttgtgCCgcttgccatgataacgctgaa120ggtcgtactccttctcgtgaggtactgtccaagaatccagcctccttcatcctggcttct180atgcgtactggcgctatggtcccaatggccgaaggtctgacgctggaagagatgactgct240attgcccgtgcagtcggcaaggcagatgctaaaactgacgatggtattgatctgcgtcgt300atttggggtaattccgtggaaggcactccactggacgctcctcagtgttcttctgcacct360acgcctgttgacctgggcgctgctaatcaatggaatggttggtctaccgaaaaggataat420ggccgttttcagcgtaaaccagccctggacgttgccgatatccctaagctgaaactgaag480tgggccttccaatacccaggttccaaaaacggtcaggccacggttatcggcgatcgtctg540ttcaccacttccacctctggtgctgtttacgccctgaacgcaaagactggttgtgtgtac600tggcgtcacgcagctgaaggtgccactcgtacttctccagtaatcgctgccctgcctgaa660ggcgccccagcaaaaactgcactgttcttttctgatttcaccaaggccgccgtagccctg720gatgctgaaacgggtaagcaactgtggaagactgttgtcgatgatcagccagctctgcaa780atgactggctctatcacctattgggatggcaaaatctatgtgcctatctcttccggtact840gaggccttcgctcaaattccaacttgggagtgttgcaaatttcgtggcgctctggttgct900ctggatgctgcaaccggcaagattctgtggaagcgttacactaccgagcaagagccacgt960ccttttaaactgaacaaagctggccgtcaaatgtggggtccatctggcggtgctatttgg1020gtcactccaacggtggacgaggcacgtcgtctgatttatgtcggcacgtccaactcctac1080actgacgttccatacgataattctgactccgtcatggccattgacgccgatactggtgct1140gttcgttggactgtccaactgctggctgacgacaactatattgacggttgttggcagaaa1200ggtaaagaacatgccaactgtccaaatcctctgggtcctgatttttccattggcgctgca1260ccaatttatcgtaaaatggctgatggtaaggagttcctgctggtgggtcaaaaatccggt1320atgatctacgctctggaccctgctaacaagggtgctaaaatttgggagcgtcagctgtct1380ctgggttctgCCCtgggtggcatcgaatttggtactgcagcagacgacggtaaagtttat1440gctggtgtctctgatattgcttctcaagctaaggatcgtggcaaacctggtctgtgggct1500ctggacatccgtactggtgaggtcgcttggaactttctgaacgctcctgacaccaagtgt1560cgttggaataactggtggtgccacggcgcattttcccaagctatttctgttattcctggt1620gcaatcttcg ccggttctta cgatggccat ttccgtgcct ttgacaccgc tactggtaag1680
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aatatcctga tggccttttc tgttgatggt aaggcggccg c190權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)PVA脫氫酶的酵母工程菌，其特征在于染色體上攜帶有PVA脫氫酶基因。
2.權(quán)利要求1所述的酵母工程菌，其特征在于，所述PVA脫氫酶基因根據(jù)畢赤酵母密碼 子偏好設(shè)計(jì)，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
3.權(quán)利要求1或2任一所述的酵母工程菌，其特在在于所述PVA脫氫酶基因位于表達(dá) 載體PPIC9K上。
4.一種權(quán)利要求1-3任一所述酵母工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于包括如下步驟 第一步根據(jù)酵母密碼子偏好型設(shè)計(jì)PVA脫氫酶基因，克隆到中間載體；第二步克隆設(shè)計(jì)的PVA脫氫酶基因到表達(dá)載體PPIC9K ；第三步將所得的表達(dá)載體電擊轉(zhuǎn)化宿主畢赤酵母O0ZcAia pastor is GS115)，構(gòu)建高 效表達(dá)PVA脫氫酶的組成型畢赤酵母工程菌。
5.權(quán)利要求1所述酵母工程菌在PVA脫氫酶生產(chǎn)中的應(yīng)用。
6.權(quán)利要求1所述酵母工程菌處理PVA中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)PVA脫氫酶(polyvinylalcoholdehydrogenase,EC1.1.99.23，簡稱PVADH)的基因工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，屬于遺傳工程領(lǐng)域。本發(fā)明通過將優(yōu)化后的PVA脫氫酶基因連接到畢赤酵母GS115(Pichiapastoris)染色體上，構(gòu)建了一株高效分泌表達(dá)PVA脫氫酶的基因工程菌，解決了PVA脫氫酶產(chǎn)量低的問題。應(yīng)用該菌種生產(chǎn)PVA脫氫酶，產(chǎn)量高達(dá)110U/mL，工藝簡單、便于工業(yè)化應(yīng)用。
文檔編號C02F3/00GK102080054SQ20101058133
公開日2011年6月1日 申請日期2010年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月10日
發(fā)明者堵國成, 張東旭, 賈東旭, 陳堅(jiān) 申請人:江南大學(xué)