專利名稱：一株喹啉降解菌及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于環(huán)境污染物生物強化技術領域，具體涉及一株喹啉降解菌及其應用。
背景技術：
喹啉及其衍生物是典型的多環(huán)芳香含氮雜環(huán)化合物，廣泛存在于浙青、頁巖油及原油中，是染料、油漆、農(nóng)藥等領域重要的原料及溶劑。喹啉是一種毒性大、致畸性和致癌性強的有機物，難于生物降解，具有較高水溶性和潛在流動性，易通過土壤污染地下水資源， 對人類健康和生態(tài)環(huán)境具有巨大的潛在危害。與物理和化學方法相比，生物處理法具有處理量大，成本較低，條件溫和，不產(chǎn)生二次污染等特點，更符合構建環(huán)境友好型及資源節(jié)約型社會的要求。然而，傳統(tǒng)的生物處理技術已難以滿足日益嚴格的環(huán)保要求。近年來，生物強化技術在不改變現(xiàn)有處理設施的基礎上，通過特定功能微生物的添加，提高原有生物處理系統(tǒng)對目標污染物的去除效能，大大提高了污水處理能力，因而越來越引起人們的重視。目前，國內(nèi)外已有部分學者篩選出對喹啉具有高效降解性能的菌株，如假單胞菌(Pseudomonas sp.)、皮氏伯克霍爾德氏菌(Burkholderia pickettii)、紅球菌 (Rhodococcus sp·)、叢毛單胞菌屬(Comamonas sp.)、乳桿菌(Lactobacillus)、白腐真菌(white rot fungi)、莫拉菌屬(Moraxella sp. )、口引哚脫硫桿菌(Desulfobacterium indolicum)等，這些研究大多僅停留在實驗室階段。到目前為止，國內(nèi)外有部分學者研究表明芽孢桿菌(Bacillus sp.)可以降解4，5，6_三氯鄰甲氧基苯酚(4，5， 6-trichloroguaiacol)、苯并[a]花(benzo [a]pyrene)禾口口比F (pyridine)，但未見其降角軍喹啉的報道。煉油廢水、焦化廢水和焦油加工廢水中含有一定濃度的喹啉，而喹啉屬于難生化降解有機物，因此僅靠生物處理裝置中的普通微生物很難實現(xiàn)對喹啉的有效降解。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在解決普通微生物對喹啉降解效率低的問題，目的是提供一株喹啉降解菌，實現(xiàn)其對煉油廢水、焦化廢水和焦油加工廢水生物強化處理。本發(fā)明所提供的喹啉降解菌Q2源于中國石油化工股份有限公司武漢分公司廠區(qū)內(nèi)受石化產(chǎn)品污染的土壤。以喹啉作為唯一碳源、氮源和能源進行生長繁殖，在喹啉無機鹽培養(yǎng)基中對土壤中的菌群進行馴化培養(yǎng)，并通過平板劃線分離純化得到。其中，喹啉無機鹽培養(yǎng)基成分為=Na2HPO4· 12H20 4. 26g, KH2PO4 2. 65g，MgSO4 · 7H20 0. 20g，CaCl2 0. 006g, FeSO4 ·7Η20 0. 02g，2mL微量元素儲備液，補足蒸餾水至IOOOmL ；微量元素儲備液組分為 MnSO4 · H2O 0. lg, ZnSO4 · 7H200. 12g, H3BO3 0. 07g, Na2MoO4 · H2O 0. 04g, CuSO4 · 5H20 0. 02g, CoCl2 0. 04g，補足蒸餾水至 IOOOmL0該菌為革蘭氏陽性菌，經(jīng)16S rRNA鑒定為芽孢桿菌(Bacillus sp)，編號Q2，其 16S rDNA的GenBank登錄號為JN132107，于2011年7月6日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學)，保藏編號為CCTCC N0M2011239。生理生化特性鑒定顯示該菌為產(chǎn)硫化
3氫試驗、V-P試驗和硝酸鹽還原試驗陽性，吲哚試驗、甲基紅試驗和淀粉水解試驗陰性。菌落為乳白色，邊緣整齊，呈圓形，光滑濕潤，中心凸起。較優(yōu)培養(yǎng)條件溫度為30°C，初始pH為7 10，接種量為20 %，搖床轉速為 IOOrpm0本發(fā)明還涉及所述芽孢桿菌(Bacillus sp)Q2在喹啉降解中的應用，應用于生物降解工業(yè)廢水中的喹啉，工業(yè)廢水為煉油廢水、焦化廢水和焦油加工廢水中的一種。與現(xiàn)有技術相比，發(fā)明的芽孢桿菌(Bacillus sp)Q2能利用喹啉作為唯一碳源、氮源和能源進行生長繁殖，在30h內(nèi)將500mg/L的喹啉降解完全。芽孢桿菌(Bacillus sp)Q2 能耐受濃度高達1400mg/L的喹啉，對較高濃度喹啉工業(yè)廢水具有優(yōu)良的降解效果，該菌可應用于煉油廢水、焦化廢水和焦油加工廢水的生物強化處理，應用前景廣闊。


圖1為芽孢桿菌(Bacillus sp)Q2的生長與喹啉降解效果關系圖；圖2為喹啉初始濃度對芽孢桿菌(Bacillus sp)Q2降解喹啉的影響；圖3為培養(yǎng)溫度對芽孢桿菌(Bacillus sp)Q2降解喹啉的影響；圖4為初始pH值對芽孢桿菌(Bacillus sp) Q2降解喹啉的影響；圖5為接種量對芽孢桿菌(Bacillus sp)Q2降解喹啉的影響；圖6為搖床轉速對芽孢桿菌(Bacillus sp)Q2降解喹啉的影響；圖7為芽孢桿菌(Bacillus sp) Q2對添加較高濃度喹啉的煉油廢水的強化處理效果；圖8為芽孢桿菌(Bacillus sp) Q2對添加較高濃度喹啉的焦化廢水的強化處理效果；圖9為芽孢桿菌(Bacillus sp) Q2對添加較高濃度喹啉的焦油加工廢水的強化處
理效果。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施方式
對本發(fā)明做進一步描述，并非對其保護范圍的限制。實施例1 芽孢桿菌(Bacillus sp)Q2的分離、鑒定及其對喹啉的降解性能1、菌株的分離、純化(1)菌種來源菌源采自中國石油化工股份有限公司武漢分公司污水處理站內(nèi)受污染的土壤，呈黑褐色，采集距表層3 6cm的土壤樣品4份。(2)菌株的分離純化將采集的土樣加入無菌蒸餾水空曝Mh，靜置后取IOmL上清液接種于90mL含 200mg/L喹啉的LB培養(yǎng)基(蛋白胨1 %，氯化鈉1 %，酵母抽提物0. 5% )中，在30°C和150r/ min活化培養(yǎng)Mh。取5mL培養(yǎng)液轉接至含喹啉200mg/L的喹啉無機鹽培養(yǎng)基中，同樣條件馴化培養(yǎng)2 3d，然后取5mL培養(yǎng)液移接至新鮮喹啉無機鹽培養(yǎng)基，如此反復3次，其中喹啉濃度分別為200、500、1000mg/L ；將含喹啉1000mg/L的馴化液按不同比例稀釋，分別涂布于含喹啉500mg/L的喹啉無機鹽平板上，30°C培養(yǎng)4d。挑選邊緣清晰的菌落，經(jīng)LB平板劃線純化至獲得單菌落，分別進行喹啉降解試驗。確定各菌株降解喹啉能力后，以含喹啉500mg/ L的LB斜面保藏降解性能優(yōu)良的菌株。2、菌株的鑒定(1)喹啉降解菌株Q2的菌落形態(tài)特征及生理生化特性喹啉降解菌株Q2菌落為乳白色，邊緣整齊，呈圓形，光滑濕潤，中心凸起。生理生化特性鑒定顯示該菌為產(chǎn)硫化氫試驗、V-P試驗和硝酸鹽還原試驗陽性，吲哚試驗、甲基紅試驗和淀粉水解試驗陰性。(2)喹啉降解菌株Q2的16S rRNA鑒定對喹啉降解菌株Q2的16S rRNA基因進行克隆、測序，然后在GenBank中進行 Blast比對。結果顯示，與其序列相似性達到99%的均為芽孢桿菌屬(Bacillus sp)，其 16S rDNA序列如序列表所示。結合菌株的生理生化特性，將其歸屬于芽孢桿菌屬(Bacillus sp)，編號為Q2。3、菌懸液的制備挑取一環(huán)細菌接種于LB培養(yǎng)基，30°C、150rpm培養(yǎng)Mh，取5mL培養(yǎng)物接于新鮮LB 培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)7 他(細菌處于對數(shù)生長期)，5000rpm、IOmin離心收集菌體，并用喹啉無機鹽培養(yǎng)基(PH 8. 0)洗滌2次，重懸于喹啉無機鹽培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)細胞密度至OD6tltl = 1， 4°C保存?zhèn)溆谩?、對芽孢桿菌(Bacillus sp)Q2的生長與其對喹啉的降解效果的關系將芽孢桿菌(Bacillus sp)Q2接種于含500mg/L喹啉的無機鹽培養(yǎng)基中，于30°C， 150r/min搖床培養(yǎng)，連續(xù)測定細胞的生長及喹啉的殘留濃度如圖1所示，測定結果表明芽孢桿菌(Bacillus sp)Q2的生長趨勢與對喹啉的降解過程基本同步，該菌能利用喹啉作為唯一碳、氮和能源物質(zhì)促進自身生長，并對喹啉有良好的降解效果。5、培養(yǎng)條件對芽孢桿菌(Bacillus sp)Q2的生長及其降解喹啉的能力的影響(1)喹啉初始濃度的影響考察不同的喹啉初始濃度(100、200、400、500、600、 800、1000、1400mg/L)對芽孢桿菌(Bacillus sp)Q2降解喹啉的影響，連續(xù)測定培養(yǎng)液中喹啉的殘留濃度如圖2所示，芽孢桿菌(Bacillus sp)Q2可在30h內(nèi)將500mg/L的喹啉降解完全，隨著喹啉初始濃度的提高，降解過程所需的停滯期明顯延長，當喹啉濃度達到1400mg/L 時，芽孢桿菌(Bacillus sp)Q2對喹啉的去除變得很慢。結果表明，隨著喹啉濃度的升高， 喹啉對芽孢桿菌(Bacillus sp)Q2的降解抑制作用逐漸增強。(2)培養(yǎng)溫度的影響考察不同的培養(yǎng)溫度(10、20、30、40°C )對芽孢桿菌 (Bacillus sp)Q2降解喹啉的影響，連續(xù)測定培養(yǎng)液中喹啉的殘留濃度如圖3所示，30°C下經(jīng)過30h培養(yǎng)，約500mg/L喹啉僅殘余15. 3mg/L,明顯優(yōu)于其它溫度的去除效果。實驗結果表明，芽孢桿菌(Bacillus sp)Q2降解喹啉的溫度對比為30°C> 40°C> 20°C> 10°C。(3)初始pH的影響考察不同的初始pH值(3、4、5、6、7、8、9、10)對芽孢桿菌 (Bacillus sp)Q2降解喹啉的影響，連續(xù)測定培養(yǎng)液中喹啉的殘留濃度如圖4所示，根據(jù)降解過程中喹啉殘留濃度的大小確定不同初始PH值下喹啉降解效果PH = 9 pH = 10 > pH = 8 > pH = 7 > pH = 6 > pH = 5 > pH = 4 > pH = 3。(4)接種量的影響考察不同的接種量(2vol %,5vol %UOvol %U5vol2(^01^^25^1%)對芽孢桿菌(Bacillus sp)株Q2降解喹啉的影響，連續(xù)測定培養(yǎng)液中喹啉的殘留濃度如圖5所示，可以看出，接種量越大，喹啉降解速率越快，當接種量為20vOl% 和2vol 5%時，搖瓶中喹啉的去除速率最高，表明當接種量達到20VOl%此時再單純依靠增加接種量對提高喹啉降解效果的影響并不明顯。(5)搖床轉速的影響考察不同的搖床轉速(50、100、150、200rpm)對芽孢桿菌 (Bacillus sp)Q2降解喹啉的影響，連續(xù)測定培養(yǎng)液中喹啉的殘留濃度如圖6所示，轉速為 50r/min的喹啉降解率明顯低于轉速為100、150和200r/min的降解率。另外，實驗結果顯示后三者對喹啉降解率的影響并不十分明顯，表明在搖床轉速為100 150r/min時已能滿足芽孢桿菌(Bacillus sp)Q2對溶氧的需求，此時單純依靠增大轉速對提高喹啉降解效果的影響并不顯著。實施例2 芽孢桿菌(Bacillus sp. ) Q2對添加較高濃度喹啉的煉油廢水的強化處
理在錐形瓶中，將芽孢桿菌(Bacillus sp)Q2投加到中石化武漢分公司的活性污泥中，設置3組實驗考察其對喹啉的去除效果。(a) 32mL煉油廢水+33mL喹啉無機鹽培養(yǎng)基+500mg/L喹啉+30mL活性污泥 +5vol%的芽孢桿菌(Bacillus sp)Q2菌懸液;(b) 32mL煉油廢水+33mL喹啉無機鹽培養(yǎng)基+500mg/L喹啉+30mL高壓滅菌后的活性污泥+5Vol%的芽孢桿菌(Bacillus sp)Q2菌懸液;(c) 32mL煉油廢水+38m喹啉無機鹽培養(yǎng)基+500mg/L喹啉+30mL活性污泥。于 30°C，150rpm搖床培養(yǎng)。連續(xù)測定培養(yǎng)液中喹啉的殘留濃度如圖7所示，結果表明未投加芽孢桿菌 (Bacillus sp)Q2的活性污泥對廢水中的喹啉降解緩慢，投加芽孢桿菌(Bacillus sp)Q2則顯著提高了活性污泥對喹啉的降解能力，并在32h內(nèi)將含約500mg/L喹啉的煉油廢水中的喹啉完全去除。實施例3 芽孢桿菌(Bacillus sp)Q2對添加較高濃度喹啉的焦化廢水的強化處
理在錐形瓶中，將芽孢桿菌(Bacillus sp)Q2投加到武鋼焦化公司生化處理裝置的活性污泥中，設置3組實驗考察其對喹啉的去除效果。(a) 32mL焦化廢水+33mL喹啉無機鹽培養(yǎng)基+500mg/L喹啉+30mL活性污泥 +5V01%的Q2菌懸液；(b) 32mL焦化廢水+33mL喹啉無機鹽培養(yǎng)基+500mg/L喹啉+30mL高壓滅菌后的活性污泥+5Vol%的Q2菌懸液；(c) 32mL焦化廢水+38mL喹啉無機鹽培養(yǎng)基+500mg/L喹啉+30mL活性污泥。于 30°C，150rpm搖床培養(yǎng)。連續(xù)測定培養(yǎng)液中喹啉的殘留濃度如圖8所示，結果表明芽孢桿菌(Bacillus sp) Q2起到了明顯的生物強化作用，并在3 內(nèi)將含約500mg/L喹啉的焦化廢水中的喹啉完
全去除。實施例4 芽孢桿菌(Bacillus sp)Q2對添加較高濃度喹啉的焦油加工廢水的強化處理
在錐形瓶中，將芽孢桿菌(Bacillus sp)Q2投加到武鋼焦化的活性污泥中，設置3 組實驗考察其對喹啉的去除效果。(a) 32mL焦油加工廢水+33mL喹啉無機鹽培養(yǎng)基+500mg/L喹啉+30mL活性污泥 +5V01%的Q2菌懸液；(b) 32mL焦油加工廢水+33mL喹啉無機鹽培養(yǎng)基+500mg/L喹啉+30mL高壓滅菌后的活性污泥+5vol %的Q2菌懸液；(c) 32mL焦油加工廢水+38mL喹啉無機鹽培養(yǎng)基+500mg/L喹啉+30mL活性污泥。 于30°C，150rpm搖床培養(yǎng)。連續(xù)測定培養(yǎng)液中喹啉的殘留濃度如圖9所示，結果表明芽孢桿菌(Bacillus sp) Q2起到了明顯的生物強化作用，并在3 內(nèi)將含約500mg/L喹啉的焦油加工廢水中的喹啉完全去除。本具體實施方式
的芽孢桿菌(Bacillus sp)Q2能利用喹啉作為唯一碳源、氮源和能源進行生長繁殖，在30h內(nèi)將500mg/L的喹啉降解完全。芽孢桿菌(Bacillus sp.)Q2能耐受濃度高達1400mg/L的喹啉，對較高濃度喹啉工業(yè)廢水具有優(yōu)良的降解效果，該菌可應用于煉油廢水、焦化廢水和焦油加工廢水的生物強化處理，應用前景廣闊。
權利要求
1.一株喹啉降解菌，經(jīng)鑒定為芽孢桿菌(Bacillus sp)，編號Q2，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期2011年7月6日，保藏編號為CCTCC NO :M2011239，菌株16S rDNA 的GenBank登錄號為JN132107，其特征在于芽孢桿菌(Bacillus sp) Q2為革蘭氏陽性菌， 菌落為乳白色，邊緣整齊，呈圓形，光滑濕潤，中心凸起；該菌為產(chǎn)硫化氫試驗、V-P試驗和硝酸鹽還原試驗陽性，吲哚試驗、甲基紅試驗和淀粉水解試驗陰性，能利用喹啉作為唯一碳源、氮源和能源進行生長繁殖。
2.如權利要求1所述喹啉降解菌的應用，其特征在于所述芽孢桿菌(Bacillussp)Q2 能以喹啉為唯一碳源和氮源進行生長，用于生物降解工業(yè)廢水中的喹啉。
3.如權利要求2所述喹啉降解菌的應用，其特征在于所述工業(yè)廢水為煉油廢水、焦化廢水和焦油加工廢水中的一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株喹啉降解菌及其應用。本發(fā)明所提供的一株喹啉降解菌Q2屬于芽孢桿菌(Bacillus sp)，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2011年7月6日，保藏編號為CCTCC NOM2011239，菌株16S rDNA的GenBank登錄號為JN132107。該菌為革蘭氏陽性菌，菌落為乳白色，邊緣整齊，呈圓形，光滑濕潤，中心凸起。該菌可以利用喹啉作為唯一碳源、氮源和能源進行生長繁殖，在30h內(nèi)將500mg/L的喹啉降解完全。Q2能耐受濃度高達1400mg/L的喹啉，對較高濃度喹啉工業(yè)廢水具有優(yōu)良的降解效果，該菌可應用于煉油廢水、或焦化廢水、或焦油加工廢水的生物強化處理，應用前景廣闊。
文檔編號C02F3/34GK102399714SQ20111031243
公開日2012年4月4日 申請日期2011年10月14日 優(yōu)先權日2011年10月14日
發(fā)明者劉學東, 劉家海, 姚嫚, 庹保華, 曾凡亮, 顏家保 申請人:中國石油化工股份有限公司, 武漢科技大學