專利名稱：硝基酚同分異構(gòu)體污染環(huán)境的原位微生物修復(fù)方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及環(huán)境有機(jī)污染物治理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用微生物進(jìn)行有機(jī)污染物的生物修復(fù)的方法。更具體涉及利用Alcaligenes sp. NyZ215,Cupriavidus necator JMP134和I^seudomonas sp. WBC-3三種菌株組成混合菌群在三種硝基酚同分異構(gòu)體污染環(huán)境中進(jìn)行原位生物修復(fù)，同時(shí)還涉及微生物降解菌群在硝基酚同分異構(gòu)體原位生物修復(fù)中的用途，達(dá)到有效去除污染物的目的。
背景技術(shù)：
硝基酚(nitrophenols)屬于硝基類芳香烴化合物，包括3個(gè)同分異構(gòu)體4_硝基酚(對(duì)硝基酚，？-111廿0 1^1101，？肥)、3-硝基酚(間硝基酚，111-111廿0 1^1101，] ^)和2-硝基酚(鄰硝基酚，o-nitrophenol, 0ΝΡ)，它們都是重要的化工原料，常作為醫(yī)藥、染料、農(nóng)藥等的合成前體，還廣泛應(yīng)用于光化學(xué)品生產(chǎn)過程中和用作生化檢測(cè)試劑。硝基酚在環(huán)境中穩(wěn)定，水溶性較高，而且自然條件下難以降解，它可抑制許多生物學(xué)機(jī)能，影響人體物質(zhì)代謝， 危害人類健康，是重要的環(huán)境污染物質(zhì)之一，其中鄰、對(duì)硝基酚被美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(USEPA) 列為優(yōu)先環(huán)境污染物(Priority Pollutant List)。生物增強(qiáng)(bioaugmentation)跟傳統(tǒng)的化學(xué)、物理修復(fù)相比有很大的優(yōu)勢(shì)，最根本特點(diǎn)是消除污染物而不是分離轉(zhuǎn)移污染物，從而在根本上解決環(huán)境問題，被譽(yù)為21世紀(jì)治理環(huán)境污染的優(yōu)選技術(shù)，具有廣泛的發(fā)展和應(yīng)用前景。有關(guān)對(duì)硝基酚(PNP)在土壤中的生物修復(fù)有一些相應(yīng)的報(bào)道，對(duì)于鄰硝基酚(ONP)和間硝基酚(MNP)的土壤原位生物修復(fù)目前沒有相關(guān)報(bào)道，更沒有有關(guān)同時(shí)降解土壤中存在的三種硝基酚同分異構(gòu)體的生物修復(fù)的報(bào)道。在以前相關(guān)的報(bào)道中，菌株Alcaligenes sp. NyZ215(Xiao Y et al. ,2007, J.Bacteriol. 189 :6587-6593), Cupriavidus necator JMP134(Yin Y et al. , Appl Microbiol and Biotechnol,2010,87 :2077-2085), Pseudomonas sp. WBC-3(Zhang JJ et al.，J Bacteriol, 2009,191 :2703-2710)是分別能以2-硝基酚、3-硝基酚和4-硝基酚為唯一碳、氮、能源生長(zhǎng)的微生物。其中WBC-3菌株通過對(duì)苯二酚降解4-硝基酚，并伴有亞硝酸根(NO2-)釋放；而NyZ215菌株通過氧化途徑降解2-硝基酚，中間產(chǎn)物是鄰苯二酚， 同時(shí)釋放亞硝酸根JMP134菌株通過還原途徑分解代謝3-硝基酚，中間產(chǎn)物為苯三酚， 并釋放銨根(NH4+)。ONP 單加氧酶(0ΝΡ 2-monooxygenase =OnpA), MNP 硝基還原酶(MNP nitroreductase :MnpA)禾口 PNP 單力口氧醇(PNP4-monooxygenase :PnpA)分別是三種污染物微生物代謝過程涉及到的起始酶。菌株Alcaligenes sp. NyZ215 和 Pseudomonas sp. WBC-3 由中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏(CCTCC)，保藏號(hào)分別為 M206121 和 M201027，Cupriavidus necator JMP134 由德國(guó)微生物菌種保藏中心(DSMZ)保藏，保藏號(hào)為DSMZ4058。在微生物修復(fù)研究中，目前，分子生態(tài)學(xué)研究已經(jīng)逐漸成為生物修復(fù)效果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和監(jiān)測(cè)手段。傳統(tǒng)的微生物生態(tài)學(xué)研究方法(如微生物分離和菌落計(jì)數(shù))只限于環(huán)境樣品中不到可培養(yǎng)的微生物類群，而隨著實(shí)時(shí)定量PCR(Real-time PCR)、 T-RFLP (Terminal restriction fragment length polymorphism,末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性)、熒光原位雜交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)和變性梯度凝膠電泳(Denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)等技術(shù)的出現(xiàn)，研究者可以從群體水平、細(xì)胞水平和分子水平對(duì)微生物的多樣性及其種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行生態(tài)學(xué)研究。其中， Real-time PCR技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA或RNA模板的定量，而且具有靈敏度高、具實(shí)時(shí)性和準(zhǔn)確性等特點(diǎn)，故可用于監(jiān)測(cè)環(huán)境中的目標(biāo)微生物和目的基因表達(dá)情況。這種微生物生態(tài)學(xué)分析方法，能夠檢測(cè)生物修復(fù)過程中微生物生態(tài)結(jié)構(gòu)的整體變化，為此類技術(shù)的安全性提供證據(jù)，并為大面積推廣應(yīng)用提供技術(shù)支持。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一在于提供了一種利用微生物進(jìn)行有機(jī)污染物的生物修復(fù)的方法° 利用三禾中菌禾中 Alcaligenes sp. NyZ215,Cupriavidus necator JMP134禾口Pseudomonas sp. WBC-3構(gòu)建了人工菌群，對(duì)土壤、水體環(huán)境中的三種硝基酚同分異構(gòu)體污染物進(jìn)行生物修復(fù)，可以成功的去除土壤和水體中硝基酚污染物的存在，該方法費(fèi)用低，操作簡(jiǎn)便，不會(huì)形成二次污染。本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種利用微生物降解菌群在硝基酚同分異構(gòu)體原位生物修復(fù)中的應(yīng)用。該操作有效地去除了土壤和水體中硝基酚污染物的存在，針對(duì)性強(qiáng)，實(shí)施時(shí)間相對(duì)較短，對(duì)周圍干擾少，并且降解菌可以在修復(fù)的過程中穩(wěn)定的存在。為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施一種利用微生物進(jìn)行有機(jī)污染物的生物修復(fù)的方法，其步驟是A、微生物混合菌群的構(gòu)建三種微生物菌株分別培養(yǎng)，Alcaligenessp. NyZ215 (CCTCC 保藏號(hào) M206121)， Cupriavidus necator JMP134(DSMZ 保藏號(hào) DSMZ4058) ,Pseudomonas sp. WBC-3 (CCTCC 保藏號(hào)M201027)的制備方法，包括如下步驟a.配制無機(jī)鹽培養(yǎng)基成分為磷酸氫二鈉(Na2HPO4 · 12H20) 14. 3g，磷酸二氫鉀(KH2PO4) 3. Og,硫酸鎂(MnSO4 · H2O) 0. 28mg,硫酸亞鐵(FeSO4 · 7H20) 0. 3mg,硫酸鎂 (MgSO4) 0. 06mg,氯化鈣(CaCl2) Img,硫酸銅(CuSO4) 0. 05mg,硫酸鋅(ZnSO4) 0. 05mg 和硼酸 (H3BO3) 0. 05mg，將其以雙蒸水定容至1000ml，調(diào)pH為7. 0，121°C，滅菌20分鐘，在250ml三角燒瓶中加入50ml上述無機(jī)鹽培養(yǎng)基；b.菌種的誘導(dǎo)培養(yǎng)在上述無機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別補(bǔ)加0.5mM 2_硝基酚，3_硝基酚，4-硝基酚，按2 %的接入量分別接入經(jīng)LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的Alcaligenes sp. strain NyZ215, Cupriavidus necator JMP 134，Pseudomonas sp. strain WBC—3，十亙溫 30°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，收集菌液；c.菌體的收集離心收集菌體，用0. 85%生理鹽水清洗菌體1-3次；B、微環(huán)境模型的構(gòu)建a. 土壤微環(huán)境模型的構(gòu)建設(shè)置了 5組不同土壤處理組A:自然土壤natrual soil (NS)B 自然土壤+ 三種硝基酚同分異構(gòu)體(NS+NPs)C:自然土壤+三種硝基酚同分異構(gòu)體+三種接入菌(NS+NPs+3inocula)D 滅菌土壤(sterile soil) + 三種硝基酚同分異構(gòu)體(SS+NPs)E 滅菌土壤+三種硝基酚同分異構(gòu)體+三種接入菌(SS+NPs+3in0CUla)。在帶有塑料可旋蓋的 250ml玻璃瓶中準(zhǔn)備不同的土壤微環(huán)境，每組3個(gè)重復(fù)。每組取114. 5g的天然土壤或滅菌土壤，相當(dāng)于IOOg的土壤干重，30°C孵育48h。接種量約為1 X IO8Cfu (cfu :colony formine unit，菌落形成單位)/g 土壤干重。按1 1 1的比例接種到相應(yīng)的處理組中；b.生物反應(yīng)器的制備平均水力停留時(shí)間為3天?？諝饬魉倏刂圃?00-300ml mirT1，溶解氧濃度為7. 8mg Γ1。誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌株接入的量為3Χ IO7ceIls L—1。將聚氨酯泡沫剪成3cm見方的小塊。每個(gè)聚氨酯泡沫小塊的質(zhì)量控制在0. 5-0. 6g。利用鐵絲將10個(gè)小塊串成一串固定于反應(yīng)器中，作為固定微生物的載體；C、硝基酚同分異構(gòu)體濃度的檢測(cè)a. 土壤中硝基酚同分異構(gòu)體濃度的檢測(cè)微環(huán)境模型置于30°C培養(yǎng)，定時(shí)取樣。利用高效液相色譜檢測(cè)步驟B中的a步中提到的幾種處理組中的硝基酚同分異構(gòu)體污染物的濃度。具體處理樣品的方法為取0.50g 土壤樣品加Iml的甲醇，渦旋振蕩lmin，200rpm振蕩培養(yǎng)30min，12，OOOg離心lOmin，移取 700 μ 1的上清到另一個(gè)1. 51111離心管中，然后再12，00(^離心101^11，再移取20(^1的上清液到另一個(gè)1. 5ml離心管中，取20 μ 1進(jìn)樣，HPLC檢測(cè)。具體檢測(cè)條件為C18反相色譜柱 (5μπι，4· 6by 250mm ；Agilent Technologies，流動(dòng)相采用體積比 60%的甲醇和 40%的 1% (體積比)冰乙酸，流速lml/min。檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。0ΝΡ,MNP,PNP的保留時(shí)間(retention time)分別是 17. 0,12. 5、11. 2min。b.生物反應(yīng)器中硝基酚同分異構(gòu)體濃度的檢測(cè)反應(yīng)器于室溫Q0-25°C )開啟，定時(shí)取樣。具體處理樣品的方式移取700 μ 1的上清到另一個(gè)1. 5ml離心管中，然后再12，OOOg離心lOmin，再移取200 μ 1的上清液到另一個(gè)1. 5ml離心管中，取20μ 1進(jìn)樣，HPLC檢測(cè)。高效液相色譜檢測(cè)硝基酚同分異構(gòu)體濃度與C步驟中的a步中提到的方法相同；D、硝基酚污染物的去除a. 土壤中硝基酚的去除相對(duì)于未加入制備的混合菌群的處理，生物修復(fù)的處理中三種硝基酚都降解的要快得多，在整個(gè)30天的實(shí)驗(yàn)中，生物修復(fù)處理中40ppm的4-硝基酚8天時(shí)全部降完，而無生物修復(fù)的處理30天之后也只降了 71% (質(zhì)量比)；經(jīng)過生物修復(fù)的處理中40ppm的3-硝基酚10天內(nèi)全部降完，而未修復(fù)的污染處理中30天只降了 81. 5% (質(zhì)量比)；生物修復(fù)處理中2-硝基酚也只需8天全部降完，但是未進(jìn)行生物修復(fù)的污染處理中僅有51. 2% (質(zhì)量比)消失，證明了生物修復(fù)確實(shí)加快了土壤中硝基酚污染物的去除速度。b.生物反應(yīng)器中硝基酚的去除在為期18天中，共進(jìn)行了 6次降解循環(huán)，未進(jìn)行生物修復(fù)的處理中硝基酚的濃度仍然很高，而加入了制備的混合菌群的處理中硝基酚均被完全降解，降解率達(dá)100%。而對(duì)生物修復(fù)第五次循環(huán)進(jìn)行了更細(xì)致的監(jiān)測(cè)，菌體密度0. D. _吸收值由0. 02升至0. 07，同時(shí)檢測(cè)到銨根離子、亞硝酸根離子的釋放。這表明該菌群在生物反應(yīng)器中仍然可以利用硝基酚為唯一碳源、氮源、能源生長(zhǎng)，并徹底降解三種底物。
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一種利用發(fā)明內(nèi)容的步驟A中制備的微生物降解菌群在硝基酚原位生物修復(fù)中的應(yīng)用，其步驟是A、微生物混合菌群的構(gòu)建三種微生物菌株分別培養(yǎng)，Alcaligenessp. NyZ215 (CCTCC 保藏號(hào) M206121)， Cupriavidus necator JMP134(DSMZ 保藏號(hào) DSMZ4058) ,Pseudomonas sp. WBC-3 (CCTCC 保藏號(hào)M201027)的制備方法，包括如下步驟a.配制無機(jī)鹽培養(yǎng)基成分為磷酸氫二鈉(Na2HPO4 · 12H20) 14. 3g，磷酸二氫鉀(KH2PO4) 3. Og,硫酸鎂(MnSO4 · H2O) 0. 28mg,硫酸亞鐵(FeSO4 · 7H20) 0. 3mg,硫酸鎂 (MgSO4) 0. 06mg,氯化鈣(CaCl2) Img,硫酸銅(CuSO4) 0. 05mg,硫酸鋅(ZnSO4) 0. 05mg 和硼酸 (H3BO3) 0. 05mg,將其以雙蒸水定容至1000ml，調(diào)pH為7. 0，121°C，滅菌20分鐘。在250ml 三角燒瓶中加入50ml上述無機(jī)鹽培養(yǎng)基。b.菌種的誘導(dǎo)培養(yǎng)在上述無機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別補(bǔ)加0.5mM 2_硝基酚，3_硝基酚，4-硝基酚，按2 %的接入量分別接入經(jīng)LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的Alcaligenes sp. strain NyZ215, Cupriavidus necator JMP 134，Pseudomonas sp. strain WB C_3，十亙溫 30°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，收集菌液。c.菌體的收集離心收集菌體，用0. 85%生理鹽水清洗菌體2次；B、針對(duì)制備的微生物混合菌群進(jìn)行的幾個(gè)應(yīng)用a.三種硝基酚的共降解——搖瓶實(shí)驗(yàn)將誘導(dǎo)培養(yǎng)的三種菌株按2%的接種量接入同時(shí)含有0. 5mM 2_硝基酚，3_硝基酚，4-硝基酚的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，恒溫30°C搖床培養(yǎng)。在84小時(shí)之內(nèi)三種硝基酚均被完全降解，降解率達(dá)100%，并且明顯可見菌體量增加。b.三種硝基酚的共降解——生物反應(yīng)器降解反應(yīng)器在室溫Q0-25°C )下按序批式運(yùn)行，三種硝基酚負(fù)載量為50mg/(L ·(!)，平均水力停留時(shí)間為3天?？諝饬魉倏刂圃?00-300ml mirT1，溶解氧濃度為7. 8mg Γ1。誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌株接入的量為3Χ IO7ceIls L—1。將聚氨酯泡沫剪成3cm見方的小塊，作為固定微生物的載體。在為期18天中，共進(jìn)行了 6次降解循環(huán)，硝基酚均被完全降解，降解率達(dá)100%。c.利用三種接入菌對(duì)三種硝基酚同分異構(gòu)體污染的土壤進(jìn)行生物修復(fù)設(shè)置了 5組不同土壤處理組A:自然土壤natrual soil (NS)B 自然土壤+ 三種硝基酚同分異構(gòu)體(NS+NPs)C:自然土壤+三種硝基酚同分異構(gòu)體+三種接入菌 (NS+NPs+3inocula)D 滅菌土壤(sterile soil) +三種硝基酚同分異構(gòu)體(SS+NPs)E 滅菌土壤+三種硝基酚同分異構(gòu)體+三種接入菌(SS+NPs+3in0Cula)。其中三種污染物濃度均為40ppm。30°C培養(yǎng)，定時(shí)取樣進(jìn)行污染物降解監(jiān)測(cè)，證明通過接種降解菌到硝基酚同分異構(gòu)體污染土壤中，能夠完成污染物的去除，達(dá)到原位生物修復(fù)的目的。本發(fā)明所涉及的細(xì)菌菌株添加方法，包括但不僅限于降解菌發(fā)酵液直接添加的方法，還可以將降解菌作為主要活性成分制備各種微生物制劑(可濕性粉劑、乳劑、水劑)，其制備方法為農(nóng)藥的常規(guī)制備方法，然后添加到污染的環(huán)境中。本發(fā)明所涉及的生物修復(fù)環(huán)境，包括但不僅限于土壤，還可以直接應(yīng)用于水體、森林、濕地等各種含有一種或者三種硝基酚污染物的環(huán)境。本發(fā)明所涉及的生物修復(fù)方法，包括但不僅限于原位修復(fù)，還可以應(yīng)用于生物反應(yīng)器等異位生物修復(fù)中。本發(fā)明所涉及的生物修復(fù)方法，包括但不僅限于微生物修復(fù)，還可以用于植物-微生物、動(dòng)物-微生物聯(lián)合生物修復(fù)中。本發(fā)明所涉及的生物修復(fù)的污染物種類，包括但不僅限于三種硝基酚，還可以用于以硝基酚為代謝中間產(chǎn)物的污染物的生物修復(fù)。利用本方法進(jìn)行多種硝基酚污染環(huán)境的生物修復(fù)，具有如下優(yōu)點(diǎn)(1)針對(duì)同時(shí)含有硝基酚三種同分異構(gòu)體的土壤、水體，進(jìn)行目標(biāo)明確的生物修復(fù)；(2)利用本方法進(jìn)行硝基酚同分異構(gòu)體污染的生物修復(fù)，能夠不破壞植物生長(zhǎng)所需的土壤環(huán)境以及水體環(huán)境，不會(huì)形成二次污染或?qū)е挛廴疚锏霓D(zhuǎn)移，并可最大限度地降低污染物濃度；(3)可在原地降解清除污染物，而且費(fèi)用低，并且操作簡(jiǎn)便，操作人員可以避免受污染物直接影響，修復(fù)時(shí)間相對(duì)較短，對(duì)周圍環(huán)境干擾少。跟傳統(tǒng)的化學(xué)、物理修復(fù)相比有很大的優(yōu)勢(shì)，最根本特點(diǎn)是消除污染物而不是分離轉(zhuǎn)移污染物，從而在根本上解決環(huán)境問題，被譽(yù)為21世紀(jì)治理環(huán)境污染的優(yōu)選技術(shù)，具有廣泛的發(fā)展和應(yīng)用前景。


圖1為一種三種硝基酚同分異構(gòu)體共降解的搖瓶實(shí)驗(yàn)示意圖。橫坐標(biāo)為時(shí)間(小時(shí))，縱坐標(biāo)是土壤中的硝基酚的濃度(毫摩爾)。每個(gè)處理設(shè)置了 3個(gè)重復(fù)。結(jié)果表明，84小時(shí)之內(nèi)三種0.5mM硝基酚均被微生物菌群完全降解。0ΝΡ、 MNP和PNP分別表示2-硝基酚、3-硝基酚和4-硝基酚。圖2為一種生物反應(yīng)器中三種硝基酚同分異構(gòu)體的降解示意圖。橫坐標(biāo)為時(shí)間(天)，縱坐標(biāo)是反應(yīng)器中的硝基酚的濃度(毫摩爾)。降解循環(huán)持續(xù)18天，先后加入6批次硝基酚，分別在圖上以cycle顯示。三種硝基酚均被完全降解， 降解率達(dá)100%。(A. 2-硝基酚的濃度隨著時(shí)間變化；B. 3-硝基酚的濃度隨著時(shí)間變化； C. 4-硝基酚的濃度隨著時(shí)間變化)圖3為一種土壤中三種硝基酚污染物的生物修復(fù)示意圖。橫坐標(biāo)為時(shí)間(天)， 縱坐標(biāo)是不同土壤處理中三種硝基酚同分異構(gòu)體濃度(單位是毫克每克干重土壤)以及離子的濃度(單位是微克每克干重土壤)變化。(a. 4-硝基酚；b. 3-硝基酚；c. 2-硝基酚； d. NH4+ ；e. NO2O圖4為一種硝基酚同分異構(gòu)體降解過程中接入菌的代謝過程中第一個(gè)酶的基因豐度變化圖以及土壤中總的細(xì)菌16S rRNA基因豐度變化示意圖。橫坐標(biāo)為時(shí)間(天)，縱坐標(biāo)是土壤樣品中降解菌的降解第一個(gè)基因數(shù)量(ρηρΑ、 mnpA和οηρΑ)以及土壤中總細(xì)菌16S rRNA基因的數(shù)量的對(duì)數(shù)值。(a. 4-硝基酚4端加氧酶(PNP 4-monooxygenase) ；b. 3_ 硝基酚硝基還原酶(MNP nitroreductase) ；c. 2-硝基酚 2 端加氧酶(ONP 2-monooxygenase) ；d. 16SrRNA 基因)
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不受實(shí)施例的限制。
所有實(shí)施例中的培養(yǎng)基及分子生物學(xué)操作方法參考Sambrook等“分子克隆”(實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港，1989)及“精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南”(美/F.奧斯伯等著，顏?zhàn)臃f等譯， 北京，科學(xué)出版社，1998)。實(shí)施例1.一種利用微生物進(jìn)行有機(jī)污染物的生物修復(fù)的方法，其步驟是A、微生物混合菌群的構(gòu)建三種微生物菌株分別培養(yǎng)，Alcaligenessp. NyZ215 (CCTCC 保藏號(hào) M206121)， Cupriavidus necator JMP134(DSMZ 保藏號(hào) DSMZ4058) ,Pseudomonas sp. WBC-3 (CCTCC 保藏號(hào)M201027)的制備方法，包括如下步驟a.配制無機(jī)鹽培養(yǎng)基成分為磷酸氫二鈉(Na2HPO4 · 12H20) 14. 3g，磷酸二氫鉀(KH2PO4) 3. Og,硫酸鎂(MnSO4 · H2O) 0. 28mg,硫酸亞鐵(FeSO4 · 7H20) 0. 3mg,硫酸鎂 (MgSO4) 0. 06mg,氯化鈣(CaCl2) Img,硫酸銅(CuSO4) 0. 05mg,硫酸鋅(ZnSO4) 0. 05mg 和硼酸 (H3BO3) 0. 05mg,將其以雙蒸水定容至1000ml，調(diào)pH為7. 0，121°C，滅菌20分鐘。在250ml 三角燒瓶中加入50ml上述無機(jī)鹽培養(yǎng)基。b.菌種的誘導(dǎo)培養(yǎng)在上述無機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別補(bǔ)加0.5mM 2_硝基酚，3_硝基酚，4-硝基酚，按2 %的接入量分別接入經(jīng)LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的Alcaligenes sp. strain NyZ215, Cupriavidus necator JMP 134，Pseudomonas sp. strain WBC—3，十亙溫 30°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，收集菌液。c.菌體的收集離心收集菌體，用0. 85%生理鹽水清洗菌體2次，待用。B、微環(huán)境模型的構(gòu)建a. 土壤微環(huán)境模型的構(gòu)建設(shè)置了 5組不同土壤處理組A:自然土壤natrual soil (NS)、B 自然土壤+ 三種硝基酚同分異構(gòu)體(NS+NPs)、C 自然土壤+三種硝基酚同分異構(gòu)體+三種接入菌 (NS+NPs+3inocula)、D 滅菌土壤(sterile soil) + 三種硝基酚同分異構(gòu)體(SS+NPs)、E 滅菌土壤+三種硝基酚同分異構(gòu)體+三種接入菌(SS+NPs+3in0CUla)。滅菌土的制備方法是稱取土壤高壓滅菌后，30°C培養(yǎng)兩天后再次滅菌，反復(fù)處理三次，得到無菌土壤，并調(diào)節(jié)水含量與天然土壤相同。在帶有塑料可旋蓋的250ml玻璃瓶中準(zhǔn)備不同的土壤微環(huán)境，每組3 個(gè)重復(fù)。每組取114. 5g的天然土壤或滅菌土壤，相當(dāng)于IOOg的土壤干重，室溫Q0-25°C ) 孵育48h。接種量約為lX108cfu(cfu :colony formine unit，菌落形成單位)/g土壤干重。 按1 1 1的比例接種到相應(yīng)的處理組中，b.生物反應(yīng)器的準(zhǔn)備反應(yīng)器在室溫Q0-25°C )下按序批式運(yùn)行，三種硝基酚負(fù)載量為50mg/(L ·(!)，平均水力停留時(shí)間為3天?？諝饬魉倏刂圃?00-300ml mirT1，溶解氧濃度為7. 8mg L—1。誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌株接入的量為3X IO7 cells L—1。將聚氨酯泡沫剪成3cm見方的小塊。每個(gè)聚氨酯泡沫小塊的質(zhì)量控制在0. 5-0. 6g。利用鐵絲將10個(gè)小塊串成一串固定于反應(yīng)器中，作為固定微生物的載體。C、30°C培養(yǎng)并且定時(shí)取樣檢測(cè)三種硝基酚污染物濃度的變化，證明接種污染物的消除通過高效液體色譜法檢測(cè)上述中的不同生物修復(fù)處理組中的硝基酚
同分異構(gòu)體污染物的濃度。HPLC檢測(cè)條件為C18反相色譜柱(SymJ.eby 250mm ；Agilent Technologies，流動(dòng)相采用60% (體積比)的甲醇和40%的(體積比) 冰乙酸，流速lml/min。檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。ONP、MNP、PNP的保留時(shí)間(retention time) 分別是17. 0、12. 5、11. 2min。對(duì)于土壤中樣品處理具體方法為，取0. 50g 土壤樣品加Iml的甲醇，渦旋振蕩lmin, 200rpm振蕩培養(yǎng)30min, 12，OOOg離心IOmin,移取700 μ 1的上清到另一個(gè)1. 5ml離心管中，然后再12，OOOg離心IOmin,再移取200 μ 1的上清液到另一 1. 5ml 離心管中，取20 μ 1進(jìn)樣，HPLC檢測(cè)。而反應(yīng)器中，直接取液體樣品12，OOOg離心lOmin，移取700 μ 1的上清到另一個(gè)1. 5ml離心管中，然后再12，OOOg離心lOmin，再移取200 μ 1的上清液到另一 1. 5ml離心管中，取20 μ 1進(jìn)樣，HPLC檢測(cè)。D.污染環(huán)境中硝基酚同分異構(gòu)體的去除a. 土壤中硝基酚的去除相對(duì)于未加入制備的混合菌群的處理，生物修復(fù)的處理中三種硝基酚都降解的要快得多，在整個(gè)30天的實(shí)驗(yàn)中，生物修復(fù)處理中40ppm的4-硝基酚8天時(shí)全部降完，而無生物修復(fù)的處理30天之后也只降了 71% (質(zhì)量比)；經(jīng)過生物修復(fù)的處理中40ppm的3-硝基酚10天內(nèi)全部降完，而未修復(fù)的污染處理中30天只降了 81. 5% (質(zhì)量比)；生物修復(fù)處理中2-硝基酚也只需8天全部降完，但是未進(jìn)行生物修復(fù)的污染處理中僅有51. 2% (質(zhì)量比)消失，證明了生物修復(fù)確實(shí)加快了土壤中硝基酚污染物的去除速度。b.生物反應(yīng)器中硝基酚的去除在為期18天中，共進(jìn)行了 6次降解循環(huán)，未進(jìn)行生物修復(fù)的處理中硝基酚的濃度仍然很高，而加入了制備的混合菌群的處理中硝基酚均被完全降解，降解率達(dá)100%。而對(duì)生物修復(fù)第五次循環(huán)進(jìn)行了更細(xì)致的監(jiān)測(cè)，菌體密度0. D. _吸收值由0. 02升至0. 07，同時(shí)檢測(cè)到銨根離子、亞硝酸根離子的釋放。這表明該菌群在生物反應(yīng)器中仍然可以利用硝基酚為唯一碳源、氮源、能源生長(zhǎng)，并徹底降解三種底物。實(shí)施例2 一種利用微生物降解菌群在硝基酚原位生物修復(fù)(環(huán)境污染治理)中的應(yīng)用，其步驟是A、微生物混合菌群的構(gòu)建三種微生物菌株分別培養(yǎng)，Alcaligenessp. NyZ215 (CCTCC 保藏號(hào) M206121)， Cupriavidus necator JMP134(DSMZ 保藏號(hào) DSMZ4058) ,Pseudomonas sp. WBC-3 (CCTCC 保藏號(hào)M201027)的制備方法，包括如下步驟a.配制無機(jī)鹽培養(yǎng)基成分為磷酸氫二鈉(Na2HPO4 · 12H20) 14. 3g，磷酸二氫鉀(KH2PO4) 3. Og,硫酸鎂(MnSO4 · H2O) 0. 28mg,硫酸亞鐵(FeSO4 · 7H20) 0. 3mg,硫酸鎂 (MgSO4) 0. 06mg,氯化鈣(CaCl2) Img,硫酸銅(CuSO4) 0. 05mg,硫酸鋅(ZnSO4) 0. 05mg 和硼酸 (H3BO3) 0. 05mg,將其以雙蒸水定容至1000ml，調(diào)pH為7. 0，121°C，滅菌20分鐘。在250ml 三角燒瓶中加入50ml上述無機(jī)鹽培養(yǎng)基。b.菌種的誘導(dǎo)培養(yǎng)在上述無機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別補(bǔ)加0.5mM 2_硝基酚，3_硝基酚，4-硝基酚，按2 %的接入量分別接入經(jīng)LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的Alcaligenes sp. strain NyZ215, Cupriavidus necator JMP 134，Pseudomonas sp. strain WB C_3，十亙溫 30°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，收集菌液。
c.菌體的收集離心收集菌體，用0. 85%生理鹽水清洗菌體2次；B.針對(duì)制備的微生物混合菌群進(jìn)行的幾個(gè)應(yīng)用a.三種硝基酚的共降解——搖瓶試驗(yàn)將誘導(dǎo)培養(yǎng)的三種菌株按2%的接種量接入同時(shí)含有0. 5mM 2_硝基酚，3_硝基酚，4-硝基酚的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，恒溫30°C搖床培養(yǎng)。在84小時(shí)之內(nèi)三種硝基酚均被完全降解，降解率達(dá)100%，并且明顯可見菌體量增加，如圖1所示。這表明在搖瓶中利用三種菌株同時(shí)降解三種硝基酚同分異構(gòu)體是可行的。b.三種硝基酚的共降解——生物反應(yīng)器降解反應(yīng)器在室溫(約21-25°C )下按序批式運(yùn)行，三種硝基酚負(fù)載量為50mg/(L -d)， 平均水力停留時(shí)間為3天?？諝饬魉倏刂圃?00-300ml mirT1，溶解氧濃度為7. 8mg Γ1。誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌株接入的量為3Χ IO7ceIls L—1。將聚氨酯泡沫剪成3cm見方的小塊。每個(gè)聚氨酯泡沫小塊的質(zhì)量控制在0. 5-0. 6g。利用鐵絲將10個(gè)小塊串成一串固定于反應(yīng)器中，作為固定微生物的載體。在為期18天中，共進(jìn)行了 6次降解循環(huán)，硝基酚均被完全降解，降解率達(dá)100%。 對(duì)其中第五次循環(huán)進(jìn)行了更細(xì)致的監(jiān)測(cè)，菌體密度0. D. _吸收值由0. 02升至0. 07，同時(shí)檢測(cè)到銨根離子、亞硝酸根離子的釋放。這表明該菌群在生物反應(yīng)器中仍然可以利用硝基酚為唯一碳源、氮源、能源生長(zhǎng)，并徹底降解三種底物。用HPLC(高效液相色譜)檢測(cè)反應(yīng)器中的三種硝基酚濃度，結(jié)果如圖2所示。降解循環(huán)持續(xù)18天，先后加入6批次三種硝基酚均被完全降解，降解率達(dá)100 %。HPLC檢測(cè)條件為C18 反相色譜柱(5μπι,4. 6by 250mm ；Agilent Technologies，流動(dòng)相采用 60%的甲醇和40%的冰乙酸，流速lml/min。檢測(cè)波長(zhǎng)為^Onm。ONP、MNP、PNP的保留時(shí)間 (retention time)分另U是 17. 0、12· 5、11. 2min。c.利用三種接入菌對(duì)三種硝基酚同分異構(gòu)體污染的土壤進(jìn)行生物修復(fù)設(shè)置了 5組不同土壤處理組A:自然土壤natrual soil (NS)、B 自然土壤+ 三種硝基酚同分異構(gòu)體(NS+NPs)、C 自然土壤+三種硝基酚同分異構(gòu)體+三種接入菌 (NS+NPs+3inocula)、D 滅菌土壤(sterile soil) + 三種硝基酚同分異構(gòu)體(SS+NPs)、E 滅菌土壤+三種硝基酚同分異構(gòu)體+三種接入菌(SS+NPs+3in0Cula)。其中三種污染物濃度均為40ppm。滅菌土的制備方法是稱取土壤高壓滅菌后，30°C培養(yǎng)兩天后再次滅菌，反復(fù)處理三次，得到無菌土壤，并調(diào)節(jié)水含量與天然土壤相同。在帶有塑料可旋蓋的250ml玻璃瓶中準(zhǔn)備不同的土壤微環(huán)境，每組3個(gè)重復(fù)。每組取114. 5g的天然土壤或滅菌土壤，相當(dāng)于IOOg的土壤干重，室溫孵育48h。生物修復(fù)的方法如下，菌株NyZ215、JMP134、WBC_3在液體LB培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，6，OOOg離心Smin收集菌體，用0.85%的生理鹽水清洗兩次后，按1 :1:1 的比例接種到相應(yīng)的處理組中，接種量約為IX 108cfu (cfu :colony formine unit，菌落形成單位)/g 土壤干重。為保持每個(gè)土壤微環(huán)境組的水分含量和離子含量一致，未接種的處理組加入等體積的0.85%的生理鹽水，體系最終含水量約為22%。30°C培養(yǎng)，定時(shí)取樣進(jìn)行污染物降解監(jiān)測(cè)，證明通過接種降解菌到硝基酚同分異構(gòu)體污染土壤中，能夠完成污染物的去除，達(dá)到原位生物修復(fù)的目的。d. 通過高效液體色譜(High Performance Liquid Chromatography :HPLC) 檢測(cè)降解菌株對(duì)硝基酚污染物的生物修復(fù)過程通過高效液體色譜法檢測(cè)上述中的不同生物修復(fù)處理組中的硝基酚同分異構(gòu)體污染物的濃度，具體方法為，取0. 50g 土壤樣品加Iml的甲醇，渦旋振蕩lmin，200rpm振蕩培養(yǎng)30min，12，000g離心lOmin，移取700 μ 1的上清到另一個(gè)1. 5ml離心管中，然后再 12，OOOg離心lOmin，再移取200 μ 1的上清液到另一 1. 5ml離心管中，取20 μ 1進(jìn)樣，HPLC 檢測(cè)。HPLC檢測(cè)結(jié)果如附圖3所示，與污染處理組B和D相比，接種菌存在的土壤處理組 C和E的三種硝基酚降解消除作用明顯，C處理中在8天、10天、8天左右三種硝基酚基本降解完全，而E處理中，三種硝基酚分別與10天、16天、2天降解完全。這說明，利用上述方法，能夠有效的去除土壤中三種硝基酚同分異構(gòu)體混合物的污染，達(dá)到了原位生物修復(fù)的目的。e.硝基酚降解過程中N02-、NH4+的濃度檢測(cè)NyZ215通過氧化途徑降解ONP，WBC-3通過氧化途徑降解PNP，這兩種底物在降解過程中會(huì)伴隨的N02-釋放，JMP134通過還原途徑降解MNP，會(huì)伴隨NH4+的釋放，通過測(cè)定生物修復(fù)過程中N02-、NH4+濃度變化，能夠證明土壤中底物的降解，是源于接入菌的降解作用。N02-檢測(cè)方法土壤樣品0. 5g中加入3ml的2M的氯化鉀溶液，振蕩30min，立即離心12，000g，5min，然后取Iml上清，加入1 %的氨基苯磺酸和0. 02% N-(l-萘)乙二胺， 搖勻靜置IOmin后，540nm紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。NH4+檢測(cè)方法土壤樣品0. 5g中加入2. 5ml的2M的氯化鉀溶液，振蕩30min，立即離心12，000g，5min，然后取Iml上清，按2 3 3的比例加入0. 26M苯酚鈉QOO μ 1)， 0. 01 %硝普鈉，0. 02Ν次氯酸鈉，搖勻靜置30min左右后，630nm紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。f. 土壤硝基酚污染去除過程中微生物的分子生態(tài)學(xué)變化利用熒光定量PCR的方法對(duì)降解菌代謝途徑的第一個(gè)酶基因的表達(dá)情況進(jìn)行定量，分別是ONP單加氧酶(ONP 2-monooxygenase :0ηρΑ)，MNP硝基還原酶(MNP nitroreductase :MnpA)禾口 PNP 單力口氧醇(PNP4-monooxygenase :PnpA)，分別是三種污染物微生物代謝過程涉及到的起始酶。利用這種方法檢測(cè)硝基酚同分異構(gòu)體降解過程中接入菌 Alcaligenes sp. NyZ215, Cupriavidus necator JMP134,Pseudomonas sp. WBC-3 的存活情況。具體方法為利用MoBio UltraClean soil DNA isolation kit (Carlsbad, CA) 對(duì)0. 5g 土壤進(jìn)行DNA提取，作為熒光定量PCR的模板。熒光定量PCR是采用RT-Cycler 136(CapitalBio, Beijing, China)儀器，20 μ 1 反應(yīng)體系包括10 μ 12 X TransStart Eco Green qPCR SuperMix (TransGen Biotech， Bei jing， China)，1 μ 1 模板 DNA，0. 4 μ 1 Passive Reference Dye 禾口 0. 2mM 弓|物(onpAl/onpA2 for onpA ；mnpAl/mnp A2 for mnpA ； pnpAl/pnpA2 for pnpA)。具體程序是95°C，5min ；95°C，20s, 60°C，20s, 72°C，20s, 45 個(gè)循環(huán) ’然后60°C至94°C進(jìn)行熔解曲線的分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖4，(a) (b) (c)是硝基酚同分異構(gòu)體降解過程中接入菌的代謝過程中第一個(gè)酶的基因(pnpA，mnpA和onpA)豐度變化圖，(d)為土壤中總的細(xì)菌16S rRNA基因豐度變化圖。說明污染物修復(fù)過程中三個(gè)降解基因持續(xù)表達(dá)，證明污染物降解是由引入的降解微生物引起的，并說明三種接入菌可以在該土壤體系中穩(wěn)定的存在。這些都為利用該技術(shù)進(jìn)行污染物的降解和環(huán)境治理提供了依據(jù)。
權(quán)利要求
1. 一種利用微生物菌群進(jìn)行混合有機(jī)污染物的生物修復(fù)的方法，其步驟是A、微生物混合菌群的構(gòu)建a.配制無機(jī)鹽培養(yǎng)基成分為磷酸氫二鈉14.3g，磷酸二氫鉀3. 0g，硫酸鎂0. 28mg，硫酸亞鐵0. 3mg,硫酸鎂0. 06mg,氯化I丐Img,硫酸銅0. 05mg,硫酸鋅0. 05mg和硼酸0. 05mg, 將其以雙蒸水定容至1000ml，調(diào)pH為7. 0，121°C，滅菌20分鐘，在250ml三角燒瓶中加入 50ml上述無機(jī)鹽培養(yǎng)基；b.菌種的誘導(dǎo)培養(yǎng)在步驟a的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別補(bǔ)加0.5mM2-硝基酚，3-硝基酹，4-硝基酹,按2%的接入量分別接入經(jīng)LB培養(yǎng)基培養(yǎng)的Alcaligenes sp. strain NyZ215, Cupriavidus necator JMP134, Pseudomonas sp. strain WBC-3,恒溫 3CTC培養(yǎng)至對(duì)數(shù)后期，收集菌液；c.菌體的收集離心收集菌體,用0.85%生理鹽水清洗菌體2次；B、微環(huán)境模型的構(gòu)建a.土壤微環(huán)境模型的構(gòu)建設(shè)置了五組不同土壤處理組A 自然土壤；B :自然土壤加三種硝基酚同分異構(gòu)體；C 自然土壤加三種硝基酚同分異構(gòu)體加步驟A中提到的混合菌群；D :滅菌土壤加三種硝基酚同分異構(gòu)體；E :滅菌土壤加三種硝基酚同分異構(gòu)體加步驟A中提到的混合菌群，每組取 114. 5g的天然土壤或滅菌土壤，即IOOg的土壤干重，3個(gè)重復(fù)，放置帶有塑料旋蓋的250ml 玻璃瓶中，30°C孵育48h，接種量為lX108cfu/g 土壤干重，按I : I : I的數(shù)量比例接種到相應(yīng)的處理組中；b.生物反應(yīng)器的制備平均水力停留時(shí)間為3天，空氣流速控制在200-300ml mirT1，溶解氧濃度為7. 8mg F1, 誘導(dǎo)培養(yǎng)的菌株接入的量為3 X IO7Cells L—1，將聚氨酯泡沫剪成3cm，每個(gè)聚氨酯泡沫小塊的質(zhì)量控制在0. 5-0. 6g，利用鐵絲將10個(gè)小塊串成一串固定于反應(yīng)器中，作為固定微生物的載體；C、硝基酚同分異構(gòu)體濃度的檢測(cè)a.土壤中硝基酚同分異構(gòu)體濃度的檢測(cè)微環(huán)境模型置于30°C培養(yǎng)，定時(shí)取樣。利用高效液相色譜檢測(cè)步驟B中的a步中提到的幾種處理組中的硝基酚同分異構(gòu)體污染物的濃度，具體處理樣品的方法為取0. 50g 土壤樣品加Iml的甲醇，潤(rùn)旋振蕩lmin, 200rpm振蕩培養(yǎng)30min, 12，OOOg離心IOmin,移取 700 u I的上清到另一個(gè)I. 5ml離心管中，然后再12，OOOg離心lOmin，再移200 U I的上清液到另一個(gè)I. 5ml離心管中，取20iU進(jìn)樣，HPLC檢測(cè)，具體檢測(cè)條件為C18反相色譜柱(5 u m, 4. 6by 250mm ；Agilent Technologies,流動(dòng)相采用體積比60%的甲醇和40%的 1%冰乙酸，流速lml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm，0NP,MNP,PNP的保留時(shí)間分別是17. 0,12. 511.2min ；b.生物反應(yīng)器中硝基酚同分異構(gòu)體濃度的檢測(cè)反應(yīng)器于室溫開啟，定時(shí)取樣，具體處理樣品的方式移取700 Ul的上清到另一個(gè) I. 5ml離心管中，然后再12，OOOg離心lOmin，再移取200 U I的上清液到另一個(gè)I. 5ml離心管中，取20 ill進(jìn)樣，HPLC檢測(cè)，高效液相色譜檢測(cè)硝基酚同分異構(gòu)體濃度與C步驟中的a 步中提到的方法相同。CN 102527712 A
2.權(quán)利要求1中所述的一種利用微生物菌群在硝基酚同分異構(gòu)體原位生物修復(fù)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用微生物混合菌群對(duì)硝基酚同分異構(gòu)體污染環(huán)境的原位修復(fù)方法及應(yīng)用。其步驟是A、微生物混合菌群的構(gòu)建:a.配制無機(jī)鹽培養(yǎng)基b.菌種的誘導(dǎo)培養(yǎng)c.菌體的收集；B、不同微環(huán)境模型的構(gòu)建a．土壤微環(huán)境模型的構(gòu)建b．生物反應(yīng)器的制備C、土壤樣品置于30℃，生物反應(yīng)器置于室溫，定時(shí)取樣檢測(cè)污染物濃度變化。本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)40ppm硝基酚每毫克干重土壤的原位修復(fù)，以及50毫克每升生物反應(yīng)器中三種硝基酚的生物修復(fù)，并且?guī)追N接入菌都可以在土壤和反應(yīng)器中持續(xù)穩(wěn)定的存在，證明了此種修復(fù)方法可以應(yīng)用到含有硝基酚同分異構(gòu)體污染的土壤、水體的環(huán)境治理中，為環(huán)境污染物的治理提供了新的思路。
文檔編號(hào)B09C1/10GK102527712SQ201110444439
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月23日
發(fā)明者傅賀, 劉虹, 周寧一, 張俊杰, 王淑君, 遲向群 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所