專利名稱：一種重金屬鎘抗性相關(guān)蛋白FKCadA1及其編碼基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物基因工程，和生物修復(fù)領(lǐng)域。具體地說(shuō)，本發(fā)明提供了生活在酸性礦山廢水(acid mining drainage, AMD)的ー種未知微生物所含有的ー種對(duì)重金屬鎘抗性的基因即P型ATP酶(FKCadAl)的序列，以及該序列推測(cè)編碼蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列。本發(fā)明在提高微生物和植物對(duì)重金屬鎘的 抗性方面有著重大的應(yīng)用價(jià)值。
背景技術(shù)：
隨著礦產(chǎn)資源的開(kāi)發(fā)利用、エ業(yè)發(fā)展，重金屬對(duì)環(huán)境造成的污染日趨嚴(yán)重，土壌重金屬污染已經(jīng)成為ー個(gè)危害全球環(huán)境質(zhì)量的問(wèn)題。土壌重金屬會(huì)影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育，降低農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。此外，受土壤重金屬污染的作物在植物體中積累，并通過(guò)食物鏈富集到人體和動(dòng)物體中，危害人畜健康，引發(fā)癌癥和其他疾病等。治理重金屬污染刻不容緩，各種修復(fù)技術(shù)和措施正在研究和應(yīng)用中。各國(guó)政府和科學(xué)家著力通過(guò)兩個(gè)途徑解決這ー問(wèn)題ー為利用物理的，化學(xué)的方法試圖清除土壌或水體的重金屬污染ニ為利用現(xiàn)代生物技術(shù)清除污染。自從20世紀(jì)80年代以來(lái)，生物修復(fù)技術(shù)因其具有處理費(fèi)用低、對(duì)環(huán)境影響小、效率高等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越受到廣大科技人員的廣泛關(guān)注。生物修復(fù)一般分為植物修復(fù)、動(dòng)物修復(fù)和微生物修復(fù)三種類型，其中植物修復(fù)和微生物修復(fù)是研究的熱點(diǎn)。微生物修復(fù)就是利用微生物將環(huán)境中的污染物降解或轉(zhuǎn)化為其他無(wú)害物質(zhì)的過(guò)程。近年來(lái)，基于微生物對(duì)重金屬的作用機(jī)理，以修復(fù)有毒有害金屬污染或回收有經(jīng)濟(jì)價(jià)值重金屬為目的的生物處理技術(shù)日趨成熟。植物修復(fù)指利用植物去治理水體、土壌和底泥等介質(zhì)中的污染的技木。然而用于重金屬污染修復(fù)的生物往往會(huì)受到重金屬的毒害，生長(zhǎng)緩慢、生物量小，甚至不能生存，所以重金屬對(duì)植物和微生物的毒害作用是生物修復(fù)的主要限制因素。解決生物修復(fù)中重金屬對(duì)生物的毒害作用的根本途徑在于研究耐受重金屬的分子生物學(xué)機(jī)制，克隆對(duì)重金屬耐受的關(guān)鍵基因，通過(guò)基因工程手段獲得用于生物修復(fù)中性能優(yōu)良的轉(zhuǎn)基因工程生物。由于技術(shù)上的原因，直到最近，對(duì)微生物基因資源的利用主要局限于可培養(yǎng)微生物。然而，已培養(yǎng)微生物僅占自然界中微生物的不到1%，因此各種生境中的微生物宏基因組是ー個(gè)巨大而未發(fā)掘的基因資源庫(kù)。極端環(huán)境具有豐富的微生物資源，當(dāng)中許多與逆境和關(guān)鍵生命過(guò)程相關(guān)的基因在長(zhǎng)期的適應(yīng)進(jìn)化中獲得了更強(qiáng)的耐性潛能，發(fā)掘這些抗性基因已成為國(guó)際重要的研究熱點(diǎn)。酸性礦山廢水(AMD)是極端生境微生物學(xué)研究的重要系統(tǒng)。AMD來(lái)源于采礦活動(dòng)使含硫礦物(主要為黃鐵礦，F(xiàn)eS2)暴露于空氣和水中，在微生物催化作用下迅速氧化產(chǎn)酸所致，其PH值一般在1-4左右，而且富含硫酸鹽以及Pb、Zn、Cu、Cd和Ni等重金屬，是采礦業(yè)面臨的最嚴(yán)重環(huán)境問(wèn)題之一。在AMD中生存的原核微生物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中逐漸形成了ー些獨(dú)特機(jī)制，以應(yīng)對(duì)低PH值、高鹽度以及高重金屬等多種極端環(huán)境協(xié)迫。因此，AMD生境成為極具特色和豐富的抗逆基因庫(kù)。由于ー些金屬在高濃度時(shí)具有毒性，因此微生物通過(guò)減少運(yùn)輸、阻滲作用或排出作用構(gòu)成對(duì)重金屬的抗性。微生物 雖然可以通過(guò)累積、氧化還原等方式抵御環(huán)境中過(guò)量的重金屬離子，但它們僅作為細(xì)胞暴露于較低濃度重金屬環(huán)境中的有效解毒方式，在高濃度重金屬污染的環(huán)境中，快速生長(zhǎng)的任何生物都必須通過(guò)作為單獨(dú)的或者聯(lián)合其它方式的外排作用來(lái)解毒。因此，最有效率的方法是直接將重金屬離子運(yùn)輸出細(xì)胞外。微生物中存在許多與金屬離子運(yùn)輸有關(guān)的蛋白家族，它們大多位于細(xì)胞膜上，起著離子泵的作用。P型ATP酶就是其中之一。在P型ATP酶中，運(yùn)輸子的跨膜通道以及ATP的結(jié)合和水解位點(diǎn)均是由一條多肽鏈構(gòu)成，它只能運(yùn)輸包括質(zhì)子在內(nèi)的一價(jià)和二價(jià)無(wú)機(jī)陽(yáng)離子。在P型ATP酶家族中，最引人注意的特點(diǎn)就是在其N端有高度的保守區(qū)域，估計(jì)為金屬的結(jié)合位點(diǎn)，在水解ATP供能的情況下，改變通道構(gòu)像形成離子通道，將金屬離子送出胞夕卜。大腸桿菌染色體上有四種不同的P型ATP酶，其中一種是MgtA，用來(lái)吸收Mg2+，其他三種運(yùn)輸K+、Cu2+和輸出Zn2+。P. Putida KT2440中有兩種P型ATP酶，CadA2用來(lái)運(yùn)輸Cd2+和Pb2+，而CadAl的作用目前還不清楚。CadA2的功能在P. Putida 06909中也研究得非常清楚了，它負(fù)責(zé)Cd2++和Zn2+的運(yùn)輸。在P.Putida CD2中，也有兩種P型ATP酶，CadA2提供Cd2+、Zn2+和Pb2+的抗性，而其中CadAl的作用目前亦不清楚。另外，迄今為止CadAl基因在微生物中對(duì)重金屬鎘抗性究竟起什么作用仍不清楚，也沒(méi)有從AMD微生物中克隆到CadAl基因的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供AMD微生物中的P型ATP酶，以及編碼該蛋白的新基因，為今后開(kāi)發(fā)基因工程產(chǎn)品奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。在本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種酸性礦山廢水微生物中P型ATP酶(重金屬鎘抗性相關(guān)蛋白FKCadAl)，它為如下蛋白分子(i)或(ii)⑴具有如SEQ ID NO : I所述的氨基酸序列；(ii)在如SEQ ID NO 1限定的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代，缺失或疊加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸衍生的蛋白質(zhì)與(i)的蛋白質(zhì)具有相同的功能。在本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供了一種DNA分子，它包括編碼所述的P型ATP酶的核苷酸序列(如SEQ ID NO :2)。發(fā)明發(fā)現(xiàn)FKCadAl蛋白具有金屬鎘抗性作用，可以在治理環(huán)境鎘污染中應(yīng)用。發(fā)明同時(shí)保護(hù)了該蛋白的編碼基因，具有如SEQ ID NO :2所示的序列；以及該基因在治理環(huán)境鎘污染中的應(yīng)用。發(fā)明用表達(dá)FKCadAl的基因工程菌作為試驗(yàn)對(duì)象，發(fā)現(xiàn)在鎘脅迫下，其鎘耐受性大大高于非基因工程菌。在鎘離子濃度為200 μ M以下時(shí)，尤其是150 μ M以下時(shí)，仍有較高的存活率。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果本發(fā)明從AMD微生物中克隆了一個(gè)新的P型ATP酶基因，命名為FKCadAl，并對(duì)其對(duì)重金屬鎘的抗性進(jìn)行了功能分析。通過(guò)大腸桿菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)證明該基因可以提高大腸桿菌中對(duì)鎘的抗性。應(yīng)用本發(fā)明的基因序列或氨基酸序列進(jìn)行轉(zhuǎn)基因開(kāi)發(fā)基因工程產(chǎn)品面具有重大的應(yīng)用價(jià)值，具體來(lái)說(shuō)可用于培育高生物量的重金屬超富集植物或微生物，用于重金屬污染土壤和水體的生態(tài)修復(fù)。


附圖I為FKCadAl在大腸桿菌中的表達(dá)時(shí)相；其中M :蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)；I :攜帶空載體pET28a的BL21 (DE3)菌株；2-9 :攜帶 pET28a-FKCadAl 的 BL21(DE3)菌株誘導(dǎo)表達(dá)分別 O、1、2、3、4、5、6、7 小時(shí)。附圖2為表達(dá)FKCadAl的大腸桿菌在不同鎘濃度下培養(yǎng)12小時(shí)后的生長(zhǎng)情況。附圖3為表達(dá)FKCadAl的大腸桿菌在150 μ M鎘脅迫下的生長(zhǎng)曲線。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例IFKCadAl基因全序列的克隆野外微生物樣品采集在云浮鉛/鋅礦選取不同酸化階段(以pH為標(biāo)準(zhǔn))的AMD，使用O. 22 μ m的濾膜收集20LAMD里面的細(xì)胞。為了保持核酸的完整保存，保存樣品凍于液氮中，24小時(shí)內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室，并放于_70°C冰箱長(zhǎng)期保存。核酸的提取DNA提取采用SET方法，過(guò)程如下向SET buffer中加入溶菌酶及蛋白酶K，消化30min后，15, OOOrpm離心15min后用氯仿抽提2次,用異丙醇沉淀過(guò)夜后,75%こ醇清洗2次，最后溶于滅菌水中。用Qiagen tip-100柱純化回收基因組DNA,用核酸蛋白分析儀檢測(cè)DNA質(zhì)量及濃度。基因組測(cè)序用Roche 公司的 GS FLX Titanium General Library Preparation Kit 制備上機(jī)樣品。使用Roche 454Genome Seqencer FLX測(cè)序儀,通過(guò)進(jìn)行測(cè)序,用Pyrobayer軟件獲取喊基序列。基因組序列分析去除低質(zhì)量的測(cè)序結(jié)果后，對(duì)基因組進(jìn)行如下分析序列拼接使用Euler-SR 及 454 公司的 GS De Novo Assembler Software 進(jìn)行序列拼接。用N50指數(shù)評(píng)價(jià)拼接的效果；基因組注釋將拼接好的微生物的全基因組序列用MG和SEED系統(tǒng)進(jìn)行基因組的注釋，發(fā)現(xiàn)新的基因。FKCadAl基因片段的克隆通過(guò)PCR方法以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計(jì)ー對(duì)引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點(diǎn))，PCR獲得一條2000bp大小的條帶，并克隆到PCR2. 1(購(gòu)自invitrogen公司)載體中，序列委托invitrogen公司測(cè)定。FKCadAl基因序列分析測(cè)序結(jié)果表明CadAl基因大小為2049bp (見(jiàn)SEQ ID NO :2)，編碼682個(gè)氨基酸(見(jiàn) SEQ ID NO 1) ο
實(shí)施例2FKCadAl基因的功能分析本實(shí)施例中利用大腸桿菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)分析FKCadAl基因的功能。構(gòu)建重組表達(dá)載體設(shè)計(jì)以下ー對(duì)引物，在FKCadAl基因5’引入BamHI酶切位點(diǎn)，3’引入XhoI酶切位點(diǎn)。FKCadAl-F(SEQ ID NO 3)5’ CGCGGATCCATGCCAACCGATCCAGTTTGT3’FKCadAl-R(SEQ ID NO 4)5’ CCGCTCGAGCATTAATGTATACTGCTGAACTTTGTTC3’以PCR2. I-FKCadAl載體為模板進(jìn)行PCR。分別將PCR產(chǎn)物和酵母穿梭表達(dá)載體pET28a用BamHI和XhoI進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物回收、連接、并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α。經(jīng)測(cè)序并酶切鑒定，得到了 pET28a-FKCadAl重組子。蛋白表達(dá)將重組子pET28a-FKCadAl轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21 (DE3)，通過(guò)PCR驗(yàn)證篩選陽(yáng)性克隆。挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至IOml LB (含Kan50y g/ml)中37°C過(guò)夜培養(yǎng)。將Iml菌液加入到含100ml LB培養(yǎng)基(含Kan50 μ g/ml)，37 °C震蕩培養(yǎng)至0D600約為
O.4-1. O (最好 O. 6，大約需 2hr)。加入IPTG至終濃度為ImM進(jìn)行誘導(dǎo)，每隔I小時(shí)收集Iml菌液，離心12000gX60s收獲沉淀，用80 μ I (1冊(cè)20重懸，加入2(^1 5XSDS-PAGE上樣緩沖液，混勻，沸水浴lOmin。取上清作為樣品做SDS-PAGE分析(見(jiàn)附圖I)。轉(zhuǎn)化子對(duì)重金屬鎘抗性的測(cè)定挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至IOml LB (含Kan 50 μ g/ml)中37 °C過(guò)夜培養(yǎng)。將IOOul 菌加入至Ij IOml Cd2+濃度分別為 O μ Μ、50 μ M、100 μ M、150 μ Μ、200 μ M 的 LB 培養(yǎng)基(含 Kan 50μ g/ml、IPTGlmM)中，37°C、200rpm 震蕩培養(yǎng) 12 小時(shí)，分別測(cè)定 0D600 值。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取Cd2+濃度為150 μ M作為脅迫條件，進(jìn)行了生長(zhǎng)曲線的測(cè)定。挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至IOml LB(含Kan 50 μ g/ml)中37 °C過(guò)夜培養(yǎng)。將IOOul菌加入到 IOml Cd2+濃度為 150μΜ 的 LB 培養(yǎng)基(含 Kan 50 μ g/ml、IPTGlmM)中，37°C、200rpm震蕩培養(yǎng)，每隔2小時(shí)測(cè)定0D600值。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，表達(dá)FKCadAl基因的BL21(DE3)在0-200 μ M Cd2+濃度下都可以正常生長(zhǎng)，而空載體對(duì)照在Cd2+濃度超過(guò)150 μ M時(shí)便不能生長(zhǎng)(見(jiàn)附圖2)。在150 μ MCd2+濃度下，表達(dá)FKCadAl基因的BL21(DE3)在培養(yǎng)過(guò)程中都可以生長(zhǎng)，而空載體對(duì)照的生長(zhǎng)一直受到抑制(見(jiàn)附圖3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，F(xiàn)KCadAl對(duì)重金屬鎘的防御起著重要作用。SEQ ID NO 1MPTDPVCGMFVPQNTNIVLIKD⑶TYYFCSTACKIKFQQPIEARKKDRLALIVAWSFAIPVLIITYFISFGMKDYVMLVLSLPVQFYSGLKFYKGAYQAIKMRSGNMDLLIALGTSVAFFFSVAIIVFPSFIPTNTTYFDTSAFII ALILTGSYIQDITESKANDAANELIKRLPSRVNLMDVNGTTITVSLDKLKKDNIILVKPGENVPVDGTVIDGETEVDESMISGEPEPVVKIKGSSVISGTTNLNGVIKVRVDSVGKDSTINKISELIEHAAAGRVKSQKLADIFSAYFVPVVIGVSIVTAFFWYGFLSYAGSSAVYEITVLSFVSVIIIACPCAIGLAAPITLLVASNASLKNHLLLKNISSLEKLAKINLAVFDKTGTLTDSRPDIDKIVVKDGRYNDISVLEYAASLEQYSNHPIASAIVKYAKSKHITFKDISRVEEKPGEGIYG
權(quán)利要求
1.一種新的重金屬鎘抗性相關(guān)蛋白，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示。
2.權(quán)利要求I所述金屬鎘抗性相關(guān)蛋白在治理環(huán)境鎘污染中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求I所述金屬鎘抗性相關(guān)蛋白的編碼基因，其特征在于具有如SEQID NO:2的核苷酸序列。
4.權(quán)利要求3所述金屬鎘抗性相關(guān)蛋白的編碼基因在治理環(huán)境鎘污染中的應(yīng)用。
5.含有權(quán)利要求3所述金屬鎘抗性相關(guān)蛋白的編碼基因的表達(dá)載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述載體，其特征在于出發(fā)載體為pET28a。
7.一種基因工程菌，其特征在于是由權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌得到的。
8.權(quán)利要求7所述基因工程菌在治理環(huán)境鎘污染中的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于環(huán)境鎘污染中的鎘離子濃度為50μΜ以下。
10.權(quán)利要求I或3所述的蛋白或核苷酸序列在開(kāi)發(fā)金屬鎘抗性轉(zhuǎn)基因工程產(chǎn)品上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了生活在酸性礦山廢水(AMD)的一種未知微生物所含有的一種對(duì)重金屬鎘抗性的基因即P型ATP酶，以及該基因所編碼蛋白質(zhì)分子的氨基酸序列。轉(zhuǎn)化大腸桿菌實(shí)驗(yàn)證明該基因在大腸桿菌中的表達(dá)可以提高其對(duì)重金屬鎘的抗性。本發(fā)明可用于提高微生物和植物對(duì)重金屬鎘的抗性，進(jìn)一步用于清除環(huán)境重金屬污染，為生物修復(fù)提供性能優(yōu)良的生物資源。
文檔編號(hào)C02F3/00GK102618515SQ20121007967
公開(kāi)日2012年8月1日 申請(qǐng)日期2012年3月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月22日
發(fā)明者俞陸軍, 廖斌, 束文圣, 胡敏, 許光遠(yuǎn), 謝麗娟, 陳亮 申請(qǐng)人:中山大學(xué)