專利名稱：產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌df-1及其去除水體中亞硝酸態(tài)氮的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于污水處理領(lǐng)域，尤其涉及一種產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌DF-1及其去除水體中亞硝酸態(tài)氮的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
近海灘涂水產(chǎn)養(yǎng)殖對(duì)世界食物供給具有十分重要的貢獻(xiàn)，尤其對(duì)那些可利用土地少而人口眾多的國(guó)家，比如像中國(guó)。2006年中國(guó)江蘇的近海水產(chǎn)養(yǎng)殖面積就已經(jīng)達(dá)到122，
000hm2。反硝化作用是氮的生物地球化學(xué)循環(huán)中重要的環(huán)節(jié)，然而近年來(lái)隨著規(guī)?；a(chǎn)養(yǎng)殖的快速發(fā)展，投喂過(guò)剩的飼料和飼養(yǎng)的水生生物排泄物積累產(chǎn)生的亞硝態(tài)氮已成為危害水產(chǎn)養(yǎng)殖的主要毒性物質(zhì)。亞硝態(tài)氮?jiǎng)t會(huì)影響?zhàn)B殖水生生物的生理功能和免疫系統(tǒng)。目前已有報(bào)道關(guān)于氮污染造弓I起的的養(yǎng)殖水產(chǎn)動(dòng)物病害甚至死亡。目前最常用的水污染處理方法主要有三種物理法，化學(xué)法和生物法。同前兩種方法相比，生物法具有處理徹底，無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)。某些微生物可以將水體中的氮氧化物(NOf和NO3-)通過(guò)氣態(tài)中間產(chǎn)物(NO和N2O)轉(zhuǎn)化為氮?dú)?，從而達(dá)到減輕水體中氮污染的目的[6’7]。目前已知的反硝化細(xì)菌多是從淡水環(huán)境中分離得來(lái)，能用于海水養(yǎng)殖中水處理且主要針對(duì)亞硝酸鹽還原能力的報(bào)道極少。從近海灘涂養(yǎng)殖池底質(zhì)淤泥中分離篩選出一株反硝化能力高，且適用于淡水和咸水的好氧反硝化細(xì)菌，，以期為近海養(yǎng)殖亞硝酸鹽污染的生物修復(fù)提供技術(shù)依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
解決的技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是從近海灘涂養(yǎng)殖池底質(zhì)淤泥中分離篩選出一株反硝化能力高，且適用于淡水和咸水的好氧反硝化細(xì)菌，及其去除水體中亞硝酸態(tài)氮的應(yīng)用。技術(shù)方案
產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌iKlebsiella該菌株已在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保
藏單位保藏，保藏日期為2012年09月25日，保藏單位名稱中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC No. 6623。所述產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌DF-1在去除水體中亞硝酸態(tài)氮中的應(yīng)用。所述產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌DF-1在去除水體中亞硝酸態(tài)氮中的應(yīng)用，步驟為以產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌DF-1為作用菌株，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)，將菌液涂布到載體表面，浸入待處理水中，形成生物膜，進(jìn)而去除水體中亞硝酸態(tài)氮。本發(fā)明所用反硝化細(xì)菌從近海灘涂養(yǎng)殖池底質(zhì)淤泥中篩選，經(jīng)16srRNA分析，屬于克雷伯氏桿菌0i7< /wi<977a),命名為產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌DF-1 {Klebsiella oxytocaDF-1 )，該菌株的生理生化特征是(+表示生長(zhǎng)，一表示抑制)
革蘭氏染色陰性，菌落呈圓形，邊緣整齊，乳脂色，半透明，凸起，表面光滑，半流質(zhì)，直徑3 6 mm η葡萄糖發(fā)酵+，MR—，VP—，克氏檸檬酸鹽+,H2S +，吣3還原+。pH 3 —，5 +, 7 +, 9 +,11 +, 12 —。%。鹽度試驗(yàn)0%。+，5%o +，10%。+，15%o —ο。〇溫度試驗(yàn)15°C+,20°C +,25°C +,30°C +,35°C +,40°C +。有益效果 本發(fā)明利用從近海灘涂養(yǎng)殖池底質(zhì)游泥中篩選的反硝化細(xì)菌Λ7ebsiella oxytocaDF-1去除水體中亞硝態(tài)氮，屬于生物法處理污水領(lǐng)域。此方法不僅具有生物法處理污水的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)作為海洋微生物，開(kāi)辟了海洋微生物資源研究和開(kāi)發(fā)新途徑。該菌株遺傳穩(wěn)定，繁殖快，去除作用強(qiáng)，資源保護(hù)，環(huán)境友好，對(duì)水體特別是養(yǎng)殖水體亞硝態(tài)氮的去除，具有廣闊的前景和意義。


圖1為反硝化細(xì)菌DF-1平板生長(zhǎng)圖2不同pH條件下反硝化細(xì)菌DF-1生長(zhǎng)及亞硝酸鹽氮降解曲線；
圖3不同溫度條件下反硝化細(xì)菌DF-1生長(zhǎng)及亞硝酸鹽氮降解曲線；
圖4不同鹽度條件下反硝化細(xì)菌DF-1生長(zhǎng)及亞硝酸鹽氮降解曲線。產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌DF-1最適生長(zhǎng)條件溫度35°C，pH 8_9，鹽度5%。，產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌DF-1能充分利用蔗糖，葡萄糖，乙酸鈉，丁二酸鈉，酒石酸鉀鈉。在此條件下，亞硝化細(xì)菌oxytoca DF-1的亞硝態(tài)氮去除率超過(guò)90%。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1:
以產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌(ar_Fioca)DF-l為作用菌株,經(jīng)母種制備,擴(kuò)大培養(yǎng),將菌液涂布到載體表面，浸入待處理水中，形成生物膜。具體操作步驟是
(O用液體SM培養(yǎng)基富集微生物，即將底質(zhì)淤泥加入到已滅菌的液體SM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。SM 液體培養(yǎng)基配方為0. 284%wt 丁二酸鈉，O. 0015%wt NaNO2,0. 136%wt KH2PO4,O. 027%wt (NH4)2SO4jO. l%wt 酵母提取物，0. 019%wt MgSO4 · 7H20，0· 368 %wt NaCl，pH 8.2。(2)用固體DM培養(yǎng)基初篩微生物，即用液體SM培養(yǎng)基中的菌液在固體DM培養(yǎng)基上劃線37攝氏度培養(yǎng)，固體DM培養(yǎng)基配方為O. 472%wt 丁二酸鈉，O. 0015%wt NaNO2,O. 15%wt KH2PO4,0. 042%wt Na2HPO4,0. 06%wt NH4CIjO. 5%wt 酪蛋白氨基酸，0. 368 %wtNaCl，pH 8. 2，2%wt 瓊脂。(3)用BTB培養(yǎng)基復(fù)篩反硝化細(xì)菌，即挑取DM固體培養(yǎng)基上菌落在BTB培養(yǎng)基上劃線，使BTB培養(yǎng)基有綠色變?yōu)樗{(lán)色的微生物是反硝化細(xì)菌。BTB培養(yǎng)基配方為O. l%wtL-天冬酰胺，O. l%wt KNO3,0. l%wt KH2PO4,0. 005%wt FeCl2 · 6Η20，0· 02%wt CaCl2 · 2Η20,O. l%wt MgSO4 ·7Η20，O. 368%wt NaCl，lg/L BTB (溶劑為 l%wt 乙醇溶液)，ρΗ7· O, 2%wt 瓊月旨。
(4)用液體DM培養(yǎng)基篩選產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌DF-1，即將使BTB培養(yǎng)基由綠變藍(lán)的菌株加入到液體DM培養(yǎng)基培養(yǎng)，計(jì)算不同菌株亞硝態(tài)氮去除率，選取去除率最大的菌株。(5)將篩選出的最適菌株進(jìn)行序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析。用于16S rRNA PCR反應(yīng)的引物為通用引物，PF :5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，PR :5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR 反應(yīng)體系(20uL) 2. OuL 10XPCR 緩沖液；0. 4uL dNTP ；1. OuL 引物 PF ；1. OuL 引物 PR ；2uL 模板；O. 2uLTaq 酶；13. 4uL 超純水。PCR 反應(yīng)條件94°C預(yù)變性 5 min ；94°C,1 min ；57°C，1 min ；72°C，1 min ;進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖凝膠電泳分析，通過(guò)片段大小確定是否為目的片段，然后將含有目的片段的PCR產(chǎn)物再經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后用DNA膠回收試劑盒進(jìn)行片斷回收，回收產(chǎn)物進(jìn)行PCR產(chǎn)物測(cè)序，測(cè)序?yàn)殡p向引物測(cè)序，測(cè)序引物為27F和1492R，將所測(cè)序列經(jīng)BLAST程序與GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，用Custal X1. 8軟件進(jìn)行多重比較分析，再用MEGA5. O軟件中Neighbor-Jioning方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。(6)經(jīng)過(guò)菌體形態(tài)、生理生化、16srRNA分析鑒定，確定所選菌株屬于克雷伯氏桿菌(Jlebsiella),兔筆為產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌(Jlebsiella oxytoca)DF-1。以產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌DF-1為作用菌株，經(jīng)母種制備，擴(kuò)大培養(yǎng)，將菌液涂布到載體表面，浸入待處理水中，形成生物膜。在生物膜形成和穩(wěn)定過(guò)程，對(duì)亞硝態(tài)氮的去除作用會(huì)持續(xù)進(jìn)行，處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下表所示。 表I不同碳源對(duì)反硝化細(xì)菌DF-1生長(zhǎng)及反硝化性能的影響
權(quán)利要求
1.產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌0i7e/wii 77a<or_Fioca)DF-l,該菌株已在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2012年09月25日，保藏單位名稱中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC No. 6623。
2.權(quán)利要求1所述產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌DF-1在去除水體中亞硝酸態(tài)氮中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求2所述產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌DF-1在去除水體中亞硝酸態(tài)氮中的應(yīng)用，其特征在于步驟為以產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌DF-1為作用菌株，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)，將菌液涂布到載體表面， 浸入待處理水中，形成生物膜，進(jìn)而去除水體中亞硝酸態(tài)氮。
全文摘要
產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌DF-1及其去除水體中亞硝酸態(tài)氮的應(yīng)用。該菌株已在國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局指定的保藏單位保藏，保藏日期為2012年09月25日，保藏單位名稱中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)CGMCC No.6623。本發(fā)明提供的產(chǎn)酸克雷伯氏桿菌DF-1遺傳穩(wěn)定，繁殖快，亞硝酸態(tài)氮去除率高，可進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，應(yīng)用于污水的亞硝酸態(tài)氮去除。
文檔編號(hào)C02F3/02GK103013867SQ20121051224
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月4日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月4日
發(fā)明者隆小華, 劉元瑞, 臧旸, 劉兆普 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)