專利名稱：用轉(zhuǎn)基因植物－粉紅粘帚霉體系修復(fù)污染土壤的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)及環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域，特別是涉及一種用轉(zhuǎn)基因植物一粉紅粘帚 霉體系修復(fù)重金屬、有機(jī)物污染土壤，特別是重金屬-有機(jī)物復(fù)合污染土壤的方法。
背景技術(shù)：
隨著城鎮(zhèn)化、工業(yè)化、汽車尾氣排放以及農(nóng)業(yè)的集約化發(fā)展，環(huán)境問題越來越受 到人們關(guān)注，重金屬、有機(jī)物引起的土壤污染也日益成為環(huán)境、土壤科學(xué)家們研究的熱點(diǎn) 問題。土壤被重金屬及有機(jī)物污染后，不僅直接影響作物產(chǎn)量和品質(zhì)，還會(huì)通過食物鏈影 響人體健康和安全。利用綠色植物清除污染物的策略，即植物修復(fù)技術(shù)具有成本低，環(huán) 境友好和可再利用等特點(diǎn)，是一種非常有前途的環(huán)境污染原位治理途徑。轉(zhuǎn)基因植物由于 具有更好的耐受力和積累量，可以得到更好的土壤修復(fù)效果。用轉(zhuǎn)基因植物修復(fù)污染土壤， 已經(jīng)成為各國(guó)科學(xué)家研究的重點(diǎn)之一。發(fā)明內(nèi)容
轉(zhuǎn)基因植物一粉紅粘帚霉體系粉紅粘帚霉(C7rosea)是一種廣泛存在于土壤中的植物病原真菌的重寄 生菌，可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，提高植物耐旱耐澇、耐高、低溫能力，對(duì)貧瘠土地的植物生長(zhǎng) 有較好促進(jìn)作用，且具有較好的生物防治能力，為非致病菌。粉紅粘帚霉對(duì)人、畜無(wú)毒無(wú)害， 可防治多種蔬菜病害，是一種很有價(jià)值的綠色生物農(nóng)藥。本發(fā)明主要應(yīng)用了粉紅粘帚霉的 促生作用。
復(fù)合污染對(duì)植物造成嚴(yán)重的損害和生長(zhǎng)抑制，所以，本團(tuán)隊(duì)提出，在種植轉(zhuǎn)基因植 物的同時(shí)施用粉紅粘帚霉，以形成轉(zhuǎn)基因植物一粉紅粘帚霉體系，可望大幅度增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因 植物對(duì)復(fù)合污染的耐受性和累積能力，從而大幅度提高轉(zhuǎn)基因植物對(duì)復(fù)合污染土壤的修復(fù) 能力。本團(tuán)隊(duì)的實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)，用轉(zhuǎn)基因植物一粉紅粘帚霉體系可以顯著增加轉(zhuǎn)基因植物 的修復(fù)能力。盡管目前還未見粉紅粘帚霉用于污染土壤修復(fù)的報(bào)道。
本團(tuán)隊(duì)自己生產(chǎn)了粉紅粘帚霉孢子制劑，可以用于污染土壤的修復(fù)。同時(shí)，也可從 市場(chǎng)上購(gòu)買粉紅粘帚霉孢子制劑，用于修復(fù)污染土壤。
2. 2轉(zhuǎn)基因植物修復(fù)重金屬污染在轉(zhuǎn)基因植物修復(fù)中，植物鰲合肽技術(shù)得到較多應(yīng)用。美國(guó)的Bennett等分別比較了 表達(dá)Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(ECS)或谷胱苷肽合成酶(GS)或ATP硫酸化酶(APS)基 因的印度芥菜對(duì)土壤的修復(fù)效果，結(jié)果表明，表達(dá)Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(ECS)或谷胱 苷肽合成酶(GS)的植株，植物鰲合肽和谷胱苷肽的水平增加，對(duì)鎘的耐受力和積累量也提 高。表達(dá)ATP硫酸化酶的植株，其谷胱苷肽和硫醇的含量均有所提高。ECS和GS植株莖葉 的重金屬累積量顯著高于野生株，其中鎘為1. 5倍，鋅為1. 5 — 2倍，對(duì)于鉻、銅、鉛，ECS植 株的累積量為野生株的2. 4 — 3倍。所有的轉(zhuǎn)基因植株從土壤中清除的重金屬量均顯著高 于野生株，土壤中鎘、鋅的減少量分別為25%和6%。上述幾種轉(zhuǎn)基因植株中，ECS植株的表現(xiàn)最佳。
Li等將Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶(ECS)基因在擬南芥中表達(dá)，使谷胱甘肽在莖 葉和根中的含量較野生株增加了 2 — 5倍，有效提高了植物對(duì)砷、汞的耐受力。Pomponi教授 等將擬南芥的植物鰲合肽基因在煙草中表達(dá)，提高了植株對(duì)Cd的耐受性和積累量。2007 年，美國(guó)的Banuelos等將半胱氨酸裂合酶(cpSL)和半胱氨酸轉(zhuǎn)甲基酶(SMT)基因分別轉(zhuǎn) 入印度芥菜中表達(dá)，用轉(zhuǎn)基因植株修復(fù)硒污染的土壤。結(jié)果，春季種植的轉(zhuǎn)cpSL基因的植 株對(duì)硒的累積量增加到原來的2倍，與野生型植株相比，葉子中硒濃度提高了1. 8倍。轉(zhuǎn) SMT基因的植株葉子中硒濃度比野生型植株提高了1. 7倍。秋季種植的轉(zhuǎn)SMT基因的植 株對(duì)硒的累積量是野生植株的1. 6倍，且莖、葉中硒的濃度都較高。這些結(jié)果表明，cpSL、 SMT的轉(zhuǎn)基因印度芥菜對(duì)硒的累積能力顯著提高。LeDuc等研究者分別在擬南芥和印度芥 末中同時(shí)表達(dá)ATP硫酸化酶和半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，使植株對(duì)硒的積累量提高了 4 一 9倍。 Banuelos等研究者進(jìn)行了轉(zhuǎn)基因印度芥菜的大田試驗(yàn)，在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)了半胱氨酸裂 合酶或半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，結(jié)果表明，硒的積累量提高了 1.6 — 2倍。Gasic等將擬南 芥的植物鰲合肽基因在印度芥菜中表達(dá)，提高了植株對(duì)鎘的耐受性。
除了鰲合肽技術(shù)外，其它的轉(zhuǎn)基因植物也用于重金屬污染修復(fù)。
日本的Yazaki K等異源表達(dá)哺乳動(dòng)物的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器基因于煙草中，可以同時(shí)提高 對(duì)有機(jī)和無(wú)機(jī)污染物的耐受性，因而，可望用于復(fù)合污染的植物修復(fù)。但是，ABC表達(dá)的不夠 穩(wěn)定。Sasaki等在擬南芥中表達(dá)細(xì)菌萊轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因,構(gòu)建了超級(jí)萊積累植株。Kim等在 擬南芥中表達(dá)ABC轉(zhuǎn)運(yùn)器AtH)R8，提高了對(duì)鎘的耐受力。2006年，美國(guó)的Lindblom等將高 親和的硫酸鹽傳輸子基因在印度芥末中表達(dá)，明顯提高了植株對(duì)Cr，Cd, V和W的耐受力。 日本科學(xué)家Sasaki等將硫桿菌的汞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在擬南芥中表達(dá)，構(gòu)建了超級(jí)耐汞植物，其 汞積累量為野生植物的2倍。Nagata等將細(xì)菌磷酸激酶基因在煙草中表達(dá)，提高了植株的 汞耐受性和積累量。
轉(zhuǎn)基因植物修復(fù)有機(jī)物污染三氯乙烯(TCE)等是污染量較大的有機(jī)污染物，特別是對(duì)地下水的污染較多。細(xì)胞色素 P450 2E1酶可以氧化多種污染物，包括三氯乙烯、溴乙烯、氯仿、四氯化碳及氯乙烯等，對(duì)多 種主要的土壤污染物有效，因此P450 2E1 (CYP 2E1)被認(rèn)為是增強(qiáng)植物有機(jī)污染修復(fù)效 率的候選基因。
美國(guó)科學(xué)家Doty等將人類細(xì)胞色素基因P450 2E1轉(zhuǎn)入煙草，用其修復(fù)污染土壤。 P450 2E1轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)TCE的代謝能力較空白對(duì)照株提高達(dá)640倍。轉(zhuǎn)基因植株明顯增加 了對(duì)溴乙烯的攝取和脫溴作用。所以，P450 2E1植株可用于鹵化物污染的植物修復(fù)，有效 修復(fù)鹵化物污染。2006年，Rylott等在擬南芥中表達(dá)降解環(huán)三甲撐三硝胺(RDX)的細(xì)胞 色素P450，提高了其對(duì)RDX的耐受力，在含RDX環(huán)境中，莖葉及根的生長(zhǎng)均優(yōu)于野生植株。 希臘學(xué)者Karavangeli等構(gòu)建轉(zhuǎn)基因煙草，表達(dá)玉米的谷胱苷肽轉(zhuǎn)移酶基因，提高了對(duì)對(duì) 氯乙酰苯胺除草劑的降解能力。將細(xì)菌氯兒茶酚雙加氧酶基因在擬南芥中表達(dá)，轉(zhuǎn)基因擬 南芥表現(xiàn)出明顯高的清除兒茶酚的能力，可以用作芳香污染物的植物修復(fù)。
同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因可產(chǎn)生協(xié)同作用。Inui H等在馬鈴薯中表達(dá)人類P450基 因CYP1A1, CYP2B6, CYP2C9 和 CYP2C19。結(jié)果表明，同時(shí)轉(zhuǎn)入 CYP1A1, CYP2B6,及 CYP2C19基因的植株T1977，表現(xiàn)出對(duì)多種除草劑的交叉抵抗力；表達(dá)CYP2C19基因的植株2C9-57R2,對(duì)磺脲類藥物有較強(qiáng)耐受力；表達(dá)CYP2C9基因的植株2C19-12R1，對(duì)多種除 草劑有較強(qiáng)的交叉耐受力。上述結(jié)果表明多基因協(xié)同作用，提高了轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的修復(fù)能 力。Kawahigashi等采用質(zhì)粒pIKBACH，將人類細(xì)胞色素P450的基因CYP1A1，CYP2B6,和 CYP2C19同時(shí)在水稻中表達(dá)，大幅度提高了水稻對(duì)除草劑莠去津和異丙甲草胺的耐受力，可 以對(duì)有機(jī)污染的土壤進(jìn)行植物修復(fù)。Wawrzynski等將絲氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、Y -谷氨酰 半胱氨酸酶基因和植物鰲合肽合成酶基因同時(shí)在植物中表達(dá)，使鎘的積累量提高8倍，而 表達(dá)單一基因的植株，鎘的累積量提高較少。這表明，同時(shí)表達(dá)多個(gè)基因，具有協(xié)同作用。
美國(guó)專利20060150279A1，將鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶基因rhlA或rhlB，或2個(gè)基因同 時(shí)表達(dá)于煙草中，增加了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)銅等污染物的耐受力。美國(guó)專利20060130173A1， 將P型ATPase ZntA基因轉(zhuǎn)入擬南芥，提高了植株對(duì)重金屬的耐受力。美國(guó)專利 20060095982A1，在植物中表達(dá)植物鰲合肽，提高了植株對(duì)污染土壤的修復(fù)能力。中國(guó)專利 CN1594583，將iaaM基因和1_氨基環(huán)丙烷_1_羧酸(ACC)脫氨基酶基因在矮牽牛或煙草中 表達(dá)，提高了轉(zhuǎn)基因植物對(duì)銅、鉛、鎘、鈷等不同重金屬的廣譜富積特性和抗性。
復(fù)合污染修復(fù)土壤污染可以分為單一污染和復(fù)合污染。單一污染如重金屬污染、有機(jī)污染物污染；而 復(fù)合污染是指同時(shí)有重金屬和有機(jī)物造成的污染，其修復(fù)難度最大。
許多地區(qū)存在重金屬和有機(jī)物的復(fù)合污染，復(fù)合污染帶來更嚴(yán)重的影響，因此修 復(fù)復(fù)合污染的任務(wù)更加艱巨。目前的轉(zhuǎn)基因植物，只是轉(zhuǎn)入了針對(duì)重金屬污染或者有機(jī)物 污染的相應(yīng)基因，因此，只能用于單獨(dú)修復(fù)重金屬污染或者有機(jī)物污染，而不能修復(fù)復(fù)合污 染，因此，將可以修復(fù)重金屬污染和有機(jī)污染的相應(yīng)基因同時(shí)在一個(gè)植株中表達(dá)，使其同時(shí) 大幅度提供對(duì)重金屬和有機(jī)污染物的耐受力及累積量，成為修復(fù)復(fù)合污染土壤的有力工 具。
能夠修復(fù)復(fù)合污染土壤的體系，更能修復(fù)單一污染的土壤，因?yàn)閱我晃廴就寥赖?修復(fù)難度較低。
三、發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明基于以上背景，在植物中引入增強(qiáng)植物有機(jī)污染修復(fù)效率的外源基因和可提高 植物對(duì)多種金屬耐受力和積累量的外源基因，獲得一種對(duì)重金屬和有機(jī)物都有較好修復(fù)效 果的轉(zhuǎn)基因植物，并在種植轉(zhuǎn)基因植物的同時(shí)施用粉紅粘帚霉，以形成轉(zhuǎn)基因植物一粉紅 粘帚霉體系，為重金屬、有機(jī)物污染土壤，特別是重金屬-有機(jī)物復(fù)合污染土壤的高效修復(fù) 提供了一條有效的途徑。本發(fā)明的目的在于提供一種利用轉(zhuǎn)基因植物一粉紅粘帚霉體系修 復(fù)重金屬、有機(jī)物污染土壤，特別是重金屬-有機(jī)物復(fù)合污染土壤的方法。
本發(fā)明的目的可以通過如下步驟實(shí)現(xiàn)3.1.將外源基因引入植株(1)構(gòu)建含有可增強(qiáng)植物有機(jī)污染修復(fù)效率的外源基因和可提高植物對(duì)多種金屬耐受 力和積累量的外源基因的雙元表達(dá)載體(2)利用電轉(zhuǎn)化方法將所構(gòu)建的植物雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌(3)通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將外源基因轉(zhuǎn)入植株 3. 2、轉(zhuǎn)基因植株的篩選在施加抗生素選擇培養(yǎng)基上進(jìn)行分化培養(yǎng)和誘導(dǎo)生根培養(yǎng)，篩選出抗性再生植株。
、轉(zhuǎn)基因植株的檢測(cè)分析(1)轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(cè)(2)轉(zhuǎn)基因植株的酶切及Southern雜交檢測(cè)(3)Western印跡法對(duì)外源基因的表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)3. 4、建立粉紅粘帚霉一轉(zhuǎn)基因植體系，進(jìn)行復(fù)合污染土壤修復(fù)實(shí)驗(yàn)。
粉紅粘帚霉為活菌制劑，施用粉紅粘帚霉的方式是施用粉紅粘帚霉孢子制劑，特 別是施用粉紅粘帚霉孢子粉劑，粉紅粘帚霉分生孢子和厚垣孢子均可施用。建立粉紅粘帚 霉一轉(zhuǎn)基因植體系的方式有以下兩種(1)在轉(zhuǎn)基因植物苗根部區(qū)域施用粉紅粘帚霉孢子粉劑，使根部區(qū)域的孢子濃度為 103-5孢子/克土壤；(2)用粉紅粘帚霉孢子粉劑拌轉(zhuǎn)基因植物種子，拌種用孢子粉劑的孢子濃度為103_5孢 子/克。
所用的粉紅粘帚霉孢子，可以從市場(chǎng)上購(gòu)買，也可以自行生產(chǎn)。本發(fā)明所用的粉紅 粘帚霉孢子為自行生產(chǎn)。施用了分生孢子和厚垣孢子，其中厚垣孢子的生產(chǎn)方法詳見中國(guó) 發(fā)明專利，專利號(hào)ZL201110024322. 6。實(shí)驗(yàn)表明，施用分生孢子(生產(chǎn)日期在6個(gè)月以內(nèi)) 和厚垣孢子(生產(chǎn)日期在一年以內(nèi))的效果是相近的。
用鉛和多環(huán)芳烴進(jìn)行了復(fù)合污染土壤的轉(zhuǎn)基因植物盆栽修復(fù)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng) 鉛濃度為1000mg/kg;多環(huán)芳烴為1000mg/kg時(shí),野生植株不能生長(zhǎng),轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)受到 明顯抑制，而施用粉紅粘帚霉孢子粉劑后，轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)良好，其對(duì)復(fù)合污染土壤的修復(fù) 能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于沒有施用粉紅粘帚霉孢子粉劑的植株。由于粉紅粘帚霉具有很好的促生抗逆 作用，且轉(zhuǎn)雙基因植物的抗復(fù)合污染能力較強(qiáng)，當(dāng)兩者結(jié)合，組成一種很強(qiáng)的促生抗逆體系 后，形成意想不到、很強(qiáng)的協(xié)同效應(yīng)，顯著增加修復(fù)重金屬、有機(jī)物污染土壤，特別是修復(fù)重 金屬一有機(jī)物復(fù)合污染土壤的能力。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于(I)將可增強(qiáng)植物有機(jī)污染修復(fù)效率的外源基因和可提高植物對(duì)多種金屬耐受力和積 累量的外源基因在植物中同時(shí)表達(dá)，可進(jìn)一步提高植物對(duì)重金屬和有機(jī)物的耐受和積累能 力。在施用粉紅粘帚霉孢子粉劑后，由于形成粉紅粘帚霉一轉(zhuǎn)基因植體系，從而產(chǎn)生了顯著 的協(xié)同效應(yīng)，收到了意想不到的效果，大幅度增加了修復(fù)能力。
(2)本發(fā)明的粉紅粘帚霉一轉(zhuǎn)基因植體系可用于多環(huán)芳烴(PAHs)，三氯乙烯、二 溴乙烷等齒代烴化合物等有機(jī)物污染土壤的修復(fù)(3)本發(fā)明的粉紅粘帚霉一轉(zhuǎn)基因植體系可用于Cd、Cr、Cu、Mn、Zn和Pb等多種重金屬 污染的土壤的修復(fù)；(4)本發(fā)明的粉紅粘帚霉一轉(zhuǎn)基因植體系可用于上述重金屬和有機(jī)物造成的復(fù)合污染 土壤的修復(fù)。顯然，本體系也能更好的修復(fù)單一污染的土壤。
下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1植物雙元表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌將來源于人的細(xì)胞色素P450 2 E1基因和來源于大腸桿菌的Y-谷氨酰半胱氨酸合成酶(Y-ECS)基因用限制性內(nèi)切酶BamHl和Sacl酶切后，連接至植物雙元轉(zhuǎn)化載體 PCAMBIA2301G,獲得的重組表達(dá)載體命名為pCAMBIA2301G_p450_ECS。
利用電穿孔法將重組表達(dá)載體pCAMBIA2301G-p450_ECS轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌菌株 LBA4404。
實(shí)施例2植物轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法，將重組表達(dá)載體pCAMBIA2301G-p450-ECS轉(zhuǎn)入紫花苜 猜葉片中。
將過夜培養(yǎng)的帶有pCAMBIA2301G-p450_ECS質(zhì)粒的農(nóng)桿菌培養(yǎng)液離心，菌體懸 浮于IOml O. 15mol/L的NaCL中，離心收集菌體，再懸浮于Iml 20mmol/L的CaCL2溶液懸 浮，將紫花苜蓿葉片切成O. 5X0. 5cm的小塊，放入含有pCAMBIA2301G-p450-ECS質(zhì)粒的菌 液中浸泡20min，用濾紙吸干多余的菌液，放在MS培養(yǎng)基上共培養(yǎng)3天，然后再轉(zhuǎn)到含有卡 那霉素的篩選培養(yǎng)基(MS+0. 5mg/L6_BA 十 O. 5mg/L 2，4-D +20 mg/L Kanamycin+300 mg/L Cefixime)上進(jìn)行初步篩選。待芽長(zhǎng)至Icm左右，將長(zhǎng)芽的葉盤轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基(MS+ 70 mg/L Kanamycin +300 mg/L Cefixime)上誘導(dǎo)幼芽生根培養(yǎng)。待根系健壯后,將轉(zhuǎn)化植株 移栽到溫室內(nèi)培養(yǎng)，獲得紫花苜蓿轉(zhuǎn)化苗。
實(shí)施例3粉紅粘帚霉一轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿系對(duì)鉛一多環(huán)芳烴復(fù)合污染土壤的盆 栽修復(fù)實(shí)驗(yàn)試驗(yàn)用直徑40cm，高50cm塑料桶。為提高水的滲透性，底部鋪上5cm高的小石頭， 然后裝入干燥土壤。設(shè)置4組實(shí)驗(yàn)，包括3組種植實(shí)驗(yàn)，一組對(duì)照實(shí)驗(yàn)。種植實(shí)驗(yàn)組按3種 實(shí)驗(yàn)條件種植，將相應(yīng)植株苗種植于盆中。
(I)未轉(zhuǎn)基因的紫花苜蓿苗；(2)由實(shí)施例2得到的轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿苗；(3)由實(shí)施例2得到的轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿苗，苗根部區(qū)域施用粉紅粘帚霉孢子粉劑，濃度 達(dá)到103_5孢子/克土壤。
(4)設(shè)空白對(duì)照盆組，不種紫花苜蓿。在試驗(yàn)初期植株成活后施加I次肥；施加 I次肥；在植物生長(zhǎng)過程中，根據(jù)生長(zhǎng)期施加I次肥。試驗(yàn)時(shí)間為半年。
待植物成活后，在土壤表面淋加含有重金屬鉛和多環(huán)芳烴溶液，使土壤中鉛濃 度為1000mg/kg;多環(huán)芳烴為1000mg/kg。對(duì)這種復(fù)合污染濃度,未轉(zhuǎn)基因的紫花苜猜植株 不能生長(zhǎng)，枯萎。未加粉紅粘帚霉孢子粉劑轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿生長(zhǎng)受到明顯抑制，施用粉紅粘 帚霉孢子粉劑的轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿植株生長(zhǎng)良好。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，其植株干重僅為施用粉紅粘 帚霉孢子粉劑的轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿植株的1/3?？梢?，施用粉紅粘帚霉孢子對(duì)轉(zhuǎn)基因紫花苜 蓿的耐受性有很大提高。同時(shí)，對(duì)植物的土壤修復(fù)能力也有很大提高。生長(zhǎng)6個(gè)月后，檢測(cè) 土壤中重金屬和多環(huán)芳烴濃度。表I給出了實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)不同實(shí)驗(yàn)的土壤中污染物的濃度， 為了使數(shù)據(jù)直觀，便于比較，表中采用了相對(duì)濃度，即以空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)組的土壤的濃度為 100%，其他濃度為與空白組濃度的相對(duì)比值。由表I可見，由于轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿的修復(fù)作 用，土壤中的鉛和多環(huán)芳烴均大幅度下降，但是，施用粉紅粘帚霉孢子粉劑的實(shí)驗(yàn)組，由于 粉紅粘帚霉一轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿體系的高效修復(fù)作用，土壤中的鉛和多環(huán)芳烴降低更多。我 們將修復(fù)效率增加率定義為施用粉紅粘帚霉孢子粉劑的轉(zhuǎn)基因植株即粉紅粘帚霉一轉(zhuǎn)基 因紫花苜蓿體系修復(fù)能力與未施用粉紅粘帚霉孢子粉劑的轉(zhuǎn)基因植株或非轉(zhuǎn)基因植株修復(fù)能力的比值，修復(fù)能力用(100-修復(fù)后土壤相對(duì)濃度)表示，即由于修復(fù)作用減少的污染物量，即修復(fù)前后的濃度差。
權(quán)利要求
1.一種利用粉紅粘帚霉一轉(zhuǎn)基因植物體系修復(fù)重金屬、有機(jī)物污染土壤，特別是修復(fù)重金屬-有機(jī)物復(fù)合污染土壤的方法，其特征在于在污染土壤中種植轉(zhuǎn)基因植物并施用粉紅粘帚霉，建立粉紅粘帚霉一轉(zhuǎn)基因植物體系用以修復(fù)被污染土壤； 所述的粉紅粘帚霉{Clonostachys rosea )是一種廣泛存在于土壤中的植物病原真菌的重寄生菌，具有植物促生作用，可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育，提高植物耐旱耐澇、耐高、低溫能力，還有較好的生物防治能力，為非致病菌；施用粉紅粘帚霉的方式是施用粉紅粘帚霉孢子制劑，特別是施用粉紅粘帚霉孢子粉劑；粉紅粘帚霉分生孢子和厚垣孢子均可施用；施用粉紅粘帚霉孢子粉劑的方法有兩種(I)、在轉(zhuǎn)基因植物苗根部區(qū)域施用粉紅粘帚霉孢子粉劑，使根部區(qū)域的孢子濃度為103_5孢子/克土壤；(2)、用粉紅粘帚霉孢子粉劑拌轉(zhuǎn)基因植物種子，拌種用孢子粉劑的孢子濃度為103—5孢子/克； 所述轉(zhuǎn)基因植物是將可增強(qiáng)植物有機(jī)污染修復(fù)效率的外源基因和可提高植物對(duì)多種金屬耐受力和積累量的外源基因引入植物，從而獲得可修復(fù)重金屬和有機(jī)物復(fù)合污染土壤的轉(zhuǎn)基因植物；所述可增強(qiáng)植物有機(jī)污染修復(fù)效率的外源基因和可提高植物對(duì)多種金屬耐受力和積累量的外源基因如下來源于哺乳動(dòng)物的金屬硫蛋白(MT)基因、來源于高等植物的類MT基因或者來源于哺乳動(dòng)物的細(xì)胞色素P450 2E1基因、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)脫氨基酶基因、Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(Y -ECS)； 所述的有機(jī)物為多環(huán)芳烴(PAHs)，三氯乙烯、二溴乙烷等鹵代烴化合物； 所述的重金屬為Cd、Cr、Cu、Mn、Zn和Pb ； 所述的污染土壤為重金屬污染的土壤，有機(jī)物污染的土壤，重金屬-有機(jī)物復(fù)合污染的土壤； 所述的植物為煙草、花椰菜、紫花苜蓿、印度芥菜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用粉紅粘帚霉－轉(zhuǎn)基因植物體系修復(fù)重金屬、有機(jī)物污染土壤，特別是修復(fù)重金屬-有機(jī)物復(fù)合污染土壤的方法。其特征在于將可增強(qiáng)植物有機(jī)污染修復(fù)效率的外源基因和可提高植物對(duì)多種金屬耐受力和積累量的外源基因引入植物，構(gòu)建一種對(duì)重金屬污染、有機(jī)物污染，特別是對(duì)重金屬－有機(jī)物復(fù)合污染都有較好修復(fù)作用的轉(zhuǎn)基因植物；在種植轉(zhuǎn)基因植物同時(shí)，施用粉紅粘帚霉，形成粉紅粘帚霉－轉(zhuǎn)基因植物體系，從而高效修復(fù)被污染土壤。本發(fā)明對(duì)于以下三種類型的污染土壤都有較好的修復(fù)作用:(1)有機(jī)污染物如多環(huán)芳烴，三氯乙烯、二溴乙烷等鹵代烴化合物污染土壤；(2)多種重金屬如Cd、Cr、Cu、Mn、Zn及Pb等污染的土壤；(3)重金屬-有機(jī)物復(fù)合污染土壤。其過程包括轉(zhuǎn)基因植物的構(gòu)建，陽(yáng)性植株的篩選及培養(yǎng)，建立粉紅粘帚霉－轉(zhuǎn)基因植物體系，進(jìn)行污染土壤的修復(fù)。本發(fā)明在重金屬污染、有機(jī)物污染、重金屬-有機(jī)物復(fù)合污染的土壤修復(fù)中具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)B09C1/00GK103042025SQ20131000141
公開日2013年4月17日 申請(qǐng)日期2013年1月4日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月4日
發(fā)明者張媛媛, 劉均洪, 張玉艷, 鞏婷云, 王靜 申請(qǐng)人:青島科技大學(xué)