專利名稱：利用誘導(dǎo)固化作用的耐砷細菌原位修復(fù)砷污染土壤的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用誘導(dǎo)固化作用的耐砷細菌原位修復(fù)砷污染土壤的方法，屬于生物環(huán)境污染修復(fù)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
砷是一種劇毒元素，自從1250年發(fā)現(xiàn)以來，已經(jīng)發(fā)生了很多嚴重的砷中毒事件。全球至少有5000多萬人正面臨著地方性砷中毒的威脅，其中，亞洲的砷污染最為嚴重，主要集中在孟加拉國、印度和中國。土壤及水環(huán)境的砷污染已經(jīng)成為一個受全世界廣泛關(guān)注的環(huán)境問題。砷通常是以As3+和As5+的形式出現(xiàn)在土壤中。砷化合物的毒性極強，砷對人的中毒劑量為0.01-0.052克，致死量為0.06-0.2克，已有研究發(fā)現(xiàn)高濃度的砷會增加患皮膚癌及膀胱、腎臟、肝臟和肺部腫瘤的風險。三價砷甚至能造成胎兒畸形和死亡。由于使用砷化合物的企業(yè)(如玻璃、顏料、農(nóng)藥等)、采礦業(yè)及重金屬冶煉等工業(yè)的迅速發(fā)展，已造成了我國土壤環(huán)境的嚴重砷污染。現(xiàn)已在我國的多個礦區(qū)周圍的土壤中檢測到了高濃度的砷，如我國貴州、郴州、西安和新疆地區(qū)均已發(fā)現(xiàn)了砷濃度范圍高達ll-1217mg Kg—1的大面積土壤。我國于1983年在新疆的奎屯開墾區(qū)發(fā)現(xiàn)了高砷污染地區(qū)，是我國大陸最早發(fā)現(xiàn)地方性砷中毒的省區(qū)，此地土壤中砷濃度高達7.27-75.38mg Kg'據(jù)不完全統(tǒng)計，我國現(xiàn)生活在砷污染地區(qū)的人口數(shù)已經(jīng)超過了兩百萬。由于土壤的鹽堿化加速砷從礦物及巖石等中溶出和遷移，并會在一定程度上阻礙污染物的生物可利用性，所以要去除像新疆這種干旱區(qū)鹽堿地土壤中的砷是更加困難的。新疆礦產(chǎn)資源非常豐富，隨著西部大開發(fā)政策的實施，對新疆礦產(chǎn)資源的開發(fā)力度也越來越大，種種開發(fā)活動已經(jīng)引起了嚴重的土壤砷污染。不同來源的砷會在礦渣或土壤中長期積累，然后含砷污染物會慢慢遷移進入到其他地區(qū)或是水體中，就會使污染區(qū)域不斷擴大。因此，我們迫切需要一種方法對含砷尾礦及高砷土壤進行治理和修復(fù)，至少要先找到一種能夠阻止砷溶出、遷移進入地表及地下水體的高效的、經(jīng)濟實用的、環(huán)境友好型的技術(shù)方法。無疑，生物修復(fù)方法，特別是廣泛存在、易培養(yǎng)的細菌就成了最具潛力的方法。目前，國際上公認的最有前途的砷污染土壤的處理方法就是生物修復(fù)技術(shù)。利用生物技術(shù)修復(fù)砷污染環(huán)境現(xiàn)已有很多應(yīng)用實例，但是修復(fù)效果大都不理想。如大家熟知的超積累植物蜈蚣草，已在很多土壤砷污染地區(qū)得以實際應(yīng)用。但是植物修復(fù)有一定的局限性，很多植物都不能在像中國西北部這樣的干旱惡劣的環(huán)境中生存。而且植物修復(fù)周期太長、效率較低。除此之外，還有包括硫還原菌在內(nèi)的各種細菌修復(fù)方法也被應(yīng)用于砷污染環(huán)境的修復(fù)之中。但是由于吸附了砷的菌體無法分離出來，依然存在于環(huán)境中，然后由于各種原因，已經(jīng)被細菌吸收了的砷又會重新釋放到環(huán)境中。另外，大部分微生物對氧化還原條件和有毒金屬價態(tài)改變的敏感性等問題，都導(dǎo)致了生物修復(fù)技術(shù)在實際中的應(yīng)用還是有一定困難的。另外，某些高鹽度土壤更加大了生物修復(fù)的難度。因此，這些不足就使我們迫切需要找到一種實用、經(jīng)濟、高效的土壤原位修復(fù)技術(shù)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，提供一種利用誘導(dǎo)固化作用的耐砷細菌原位修復(fù)砷污染土壤的方法，該方法首先通過逐次增加營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中的砷含量，分離出一種耐高濃度砷環(huán)境能產(chǎn)生較多尿素分解酶的耐砷細菌；然后將耐砷細菌置于尿素酶和CaCl2的營養(yǎng)湯培養(yǎng)基中，富集得到具有鈣化作用耐砷細菌菌液；再將富集得到鈣化作用耐砷細菌CR5菌液與含砷的污染土壤中混合形成混合溶液，使得混合液pH呈現(xiàn)微弱堿環(huán)境至pH為8-9，將混合溶液置于濕潤環(huán)境下培養(yǎng)，鈣化作用耐砷細菌通過誘導(dǎo)固化作用將富含砷污染土壤中砷得到固定，使砷污染土壤得到原位修復(fù)。該方法操作簡便、易于控制，成本低，可廣泛用于重金屬土壤污染的修復(fù)。本發(fā)明所述的一種利用誘導(dǎo)固化作用的耐砷細菌原位修復(fù)砷污染土壤的方法，其特征在于按下列步驟進行:a、選用砷污染嚴重地區(qū)土壤置于帶蓋的滅菌瓶中，將土壤樣品置于營養(yǎng)肉湯錐形瓶中，營養(yǎng)肉湯PH為8-8.5，砷含量為IOOmg L—1，然后將錐形瓶置于轉(zhuǎn)速為130rpm mirT1，溫度為30°C的條件下培養(yǎng)48h，得到菌液；b、將培養(yǎng)得到的菌液分別依次接入砷含量為IOOmg r\250mgr\500mg L—1的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，按常規(guī)方法分離得到耐砷細菌，該耐砷細菌在基因庫的代碼為CR5，編號為 HQ331532 ；C、然后將耐砷細菌CR5置于質(zhì)量含量為2%的尿素酶、20-60禮17匕(:12和砷含量為100-500mg L—1的營養(yǎng)湯培養(yǎng)基中，將混合液置于轉(zhuǎn)速為130rpm mirT1,溫度為30°C的條件下培養(yǎng)5-7天，富集得到鈣化作用耐砷細菌CR5菌液，所得到的菌液pH為8-9 ；d、將富集得到具有鈣化作用耐砷細菌CR5菌液100-300ml與50_100g含砷量為200-600mg Kg—1的污染土壤進行混合,形成混合溶液，混合液pH呈現(xiàn)微弱堿環(huán)境至pH為8-9，將混合溶液置于濕潤環(huán)境下培養(yǎng)7-15天后終止實驗，鈣化作用耐砷細菌CR5通過鈣化作用將富含砷污染土壤中砷得到固定，砷污染土壤得到原位修復(fù)，阻止其向周圍土壤及地表或地下水中遷移。步驟b和步驟c中選用的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基為蛋白胨IOg L—1、牛肉膏1.5g L—1、酵母粉1.5g Γ1和氯化鈉5g L'步驟a中選用的污染土壤為高鹽環(huán)境下的砷污染土壤，砷污染環(huán)境為其土壤中重金屬為可交換狀態(tài)，且與碳酸鹽相互結(jié)合，包括砷污染土壤、銫污染土壤、銅污染土壤、鉛污染土壤。步驟d中形成混合溶液中的菌液菌密度為107CFU/ml。本發(fā)明所述的利用誘導(dǎo)固化作用的耐砷細菌原位修復(fù)砷污染土壤的方法，具體工藝步驟是:耐砷細菌的分離:選用砷污染嚴重地區(qū)土壤置于帶蓋的滅菌瓶中，稱取l_2g 土壤樣品置于含50ml營養(yǎng)肉湯的錐形瓶中，其營養(yǎng)肉湯pH為8-8.5，三價砷離子含量為IOOmgΙΛ然后將錐形瓶置于轉(zhuǎn)速為130rpm mirT1，溫度為30°C的條件下培養(yǎng)48h，將培養(yǎng)得到的菌液分別依次接入三價砷離子含量為IOOmg r\250mg r\500mg L—1的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，其他培養(yǎng)條件不變分離得到耐砷細菌；誘導(dǎo)固化作用耐砷細菌馴化富集:將分離得到的耐砷細菌置于質(zhì)量含量為2%的尿素酶、20-60mM L-1CaCl2和三價砷離子含量為100_500mg L—1的營養(yǎng)湯培養(yǎng)基中，將混合液置于轉(zhuǎn)速為130rpm mirT1，溫度為30°C的條件下培養(yǎng)5天-7天富集得到鈣化作用耐砷細菌菌液，所得到的菌液PH為8-9 ；誘導(dǎo)固化作用細菌修復(fù)砷污染土壤:將富集得到具有誘導(dǎo)固化作用耐砷細菌菌液100-300 ml與含三價砷離子200-600mg Kg-1的50_100g的污染土壤中混合形成混合溶液，其中菌液菌密度為107CFU/ml，混合液pH呈現(xiàn)微弱堿環(huán)境至pH為8_9，將混合溶液置于濕潤環(huán)境下培養(yǎng)7-15天后終止實驗，鈣化作用耐砷細菌通過鈣化作用將富含砷污染土壤中砷得到固定，砷污染土壤得到原位修復(fù)，阻止其向周圍土壤及地表或地下水中遷移。本發(fā)明所述的利用誘導(dǎo)固化作用的耐砷細菌原位修復(fù)砷污染土壤的方法，該方法中分離的耐砷細菌在基因庫的代碼為CR5，編號為HQ331532 ；
權(quán)利要求
1.一種利用誘導(dǎo)固化作用的耐砷細菌原位修復(fù)砷污染土壤的方法，其特征在于按下列步驟進行: a、選用砷污染嚴重地區(qū)土壤置于帶蓋的滅菌瓶中，將土壤樣品置于營養(yǎng)肉湯錐形瓶中，營養(yǎng)肉湯pH為8-8.5，砷含量為100 mg L-1，然后將錐形瓶置于轉(zhuǎn)速為130 rpm min—1，溫度為30°C的條件下培養(yǎng)48 h，得到菌液； b、將培養(yǎng)得到的菌液分別依次接入砷含量為100mg L_\250 mg L—1和500mg Γ1的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，按 常規(guī)方法分離得到耐砷細菌，該耐砷細菌在基因庫的代碼為CR5，編號為 HQ331532 ； C、然后將耐砷細菌CR5置于質(zhì)量含量為2%的尿素酶、20- 60 mM I/1 CaCl2和砷含量為100- 500 mg L4的營養(yǎng)湯培養(yǎng)基中，將混合液置于轉(zhuǎn)速為130rpm mirT1 ,溫度為30°C的條件下培養(yǎng)5-7天，富集得到鈣化作用耐砷細菌CR5菌液，所得到的菌液pH為8-9 ； d、將富集得到具有鈣化作用耐砷細菌CR5菌液100-300 ml與50_100g含砷量為200-600 mg Kg—1的污染土壤進行混合,形成混合溶液,混合液pH呈現(xiàn)微弱堿環(huán)境至pH為8-9，將混合溶液置于濕潤環(huán)境下培養(yǎng)7-15天后終止實驗，鈣化作用耐砷細菌CR5通過鈣化作用將富含砷污染土壤中砷得到固定，砷污染土壤得到原位修復(fù)，阻止其向周圍土壤及地表或地下水中遷移。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟b和步驟c中選用的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基為蛋白胨IOg L'牛肉膏1.5g L'酵母粉1.5g L—1和氯化鈉5g L'
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟a中選用的污染土壤為高鹽環(huán)境下的砷污染土壤，砷污染環(huán)境為其土壤中重金屬為可交換狀態(tài)，且與碳酸鹽相互結(jié)合，包括砷污染土壤、銫污染土壤、銅污染土壤、鉛污染土壤。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟d中形成混合溶液中的菌液菌密度為107-108CFU/mlo
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用誘導(dǎo)固化作用的耐砷細菌原位修復(fù)砷污染土壤的方法，該方法首先通過逐次增加營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中的砷含量，分離出一種耐高濃度砷環(huán)境能產(chǎn)生較多尿素分解酶的耐砷細菌；然后將耐砷細菌置于含有尿素酶和CaCl2的營養(yǎng)湯培養(yǎng)基中，富集得到具有鈣化作用耐砷細菌菌液；再將富集得到鈣化作用耐砷細菌CR5菌液與含砷的污染土壤中混合形成混合溶液，使得混合液pH呈現(xiàn)微弱堿環(huán)境至pH為8-9，將混合溶液置于濕潤環(huán)境下培養(yǎng)，鈣化作用耐砷細菌通過誘導(dǎo)固化作用將富含砷污染土壤中砷得到固定，使砷污染土壤得到原位修復(fù)。該方法操作簡便、易于控制，成本低，可廣泛用于重金屬土壤污染的修復(fù)。
文檔編號B09C1/10GK103121033SQ201310070138
公開日2013年5月29日 申請日期2013年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年3月5日
發(fā)明者潘響亮, 宋文娟, 張道勇, 高磊 申請人:中國科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所