一株鄰苯二甲酸酯高效降解芽孢桿菌的篩選鑒定及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一株從大量使用過地膜的土壤中分離的對(duì)鄰苯二甲酸酯有高效降解能力的菌株JF，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。該菌株生長速度快，產(chǎn)生芽孢，對(duì)外界環(huán)境抵抗力強(qiáng)，在寬溫度（30℃-45℃）和寬pH（pH5.0-8.0）范圍內(nèi)對(duì)鄰苯二甲酸酯的降解率在90%以上。該菌株經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis），登錄號(hào)為KF364634，并保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地點(diǎn)為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期2013年07月22日，保藏編號(hào)：CGMCC?No.?7950。該菌株可用于被鄰苯二甲酸酯所污染的土壤、污水的生物修復(fù)或生物凈化，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，進(jìn)而保障農(nóng)產(chǎn)品安全。
【專利說明】一株鄰苯二甲酸酯高效降解芽孢桿菌的篩選鑒定及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株高效降解鄰苯二甲酸酯芽孢桿菌的篩選鑒定及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]鄰苯二甲酸酯(Phthalates，PAEs,酚酞酯)是世界上生產(chǎn)量大、應(yīng)用面廣的人工合成有機(jī)化合物之一，屬芳香族二羧酸酯，多為高沸點(diǎn)、低蒸氣壓、無色無味的液體，它們被廣泛應(yīng)用于塑料助劑、油漆溶劑、合成橡膠和涂料等的增塑劑和軟化劑，以增大塑料的可塑性和韌性，提高塑料的強(qiáng)度。PAEs類化合物是大約30種化合物的總稱，由鄰苯二甲酸和相應(yīng)的醇化合而成的，我國常用的品種有:鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二辛酯(D0P)、鄰苯二甲酸丁芐酯(BBP)、鄰苯二甲酸二壬酯(DNP)等，其中DBP和DEHP用量最大，DBP和DEHP被美國環(huán)保局列為優(yōu)先控制污染物，歐盟也將DBP作為高風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的管控物質(zhì)，中國也已經(jīng)將其列入環(huán)境優(yōu)先污染物黑名單。
[0003]近年來，隨著鄰苯二甲酸酯(Phthalates, PAEs)在工業(yè)中的大量使用，PAEs已經(jīng)普遍存在于土壤、底泥、水體、空氣以及大氣沉降物等環(huán)境中，成為環(huán)境中重要的污染物之一。目前普遍認(rèn)為PAEs是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，而其中的某些種類對(duì)人體和動(dòng)物具有致畸、致癌、致突變作用，鄰苯二甲酸酯類可通過消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)及皮膚接觸等途徑進(jìn)入人體，具有生殖毒性和發(fā)育毒性，這種危害是隱蔽而漫長的。
[0004]鄰苯二甲酸酯在環(huán)境中半衰期長，其水解和光解的速率非常緩慢，屬難降解物質(zhì)，PAEs的微生物降解是自然環(huán)境中的主要途徑，目前僅見余志晟等報(bào)道的Gordoniasp.QH-9可降解鄰苯二甲酸酯的專利。曾巧云等研究了 PAEs可通過土壤及自身的揮發(fā)進(jìn)入農(nóng)作物，且在農(nóng)作物內(nèi)具有富集特性，經(jīng)食用進(jìn)入人體，直接危害人體健康。由于芽孢桿菌能形成芽孢，在自然環(huán)境中的抵抗力強(qiáng)`于其他微生物，因此，獲得PAEs高效降解菌尤其是高效降解芽孢桿菌具有重要的實(shí)踐意義，可為消除環(huán)境PAEs污染、保護(hù)生態(tài)環(huán)境和保障農(nóng)產(chǎn)品安全提供菌種資源和技術(shù)支撐。
[0005]本專利是從四川省雅安市雨城區(qū)使用地膜的蔬菜田地的土壤中分離到的一株可高效降解鄰苯二甲酸二丁酯的菌株，經(jīng)16S rDNA測(cè)序鑒定，該菌株基因序列與也^77心subtilis菌株序列高度同源。經(jīng)過試驗(yàn)可知該菌株可利用鄰苯二甲酸二丁酯作為唯一碳源和能源生長繁殖，在14h內(nèi)可將LB培養(yǎng)基中200mg/L DBP完全降解，且在寬溫度(300C -45°C)和寬pH (pH5.0-8.0)范圍內(nèi)均對(duì)鄰苯二甲酸二丁酯均有較好的降解能力；同時(shí)，該菌對(duì)鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯、鄰苯二甲酸二辛酯、鄰苯二甲酸丁芐酯、鄰苯二甲酸二壬酯等均具有較強(qiáng)的降解能力。充分說明該菌株在處理含有鄰苯二甲酸酯類化合物污染的生物修復(fù)方面具有獨(dú)特的應(yīng)用潛力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一株可高效降解鄰苯二甲酸酯類化合物的菌株及其應(yīng)用。[0007]本發(fā)明所提供的降解菌株經(jīng)鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地點(diǎn)為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏號(hào)為CGMCC N0.7950，保藏日期為2013年07月22日。
[0008]本發(fā)明所提供的降解菌株feci77i/5.subtilis strain JF的生物學(xué)特性:兼性厭氧，革蘭氏染色陽性的芽孢桿菌，對(duì)葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇發(fā)酵均呈陽性；能水解明膠和淀粉；苯丙胺酸脫氫酶和卵黃卵磷脂酶呈陰性。
[0009]本發(fā)明所提供的降解菌株的分離與篩選:
取四川省雅安市雨城區(qū)使用地膜的蔬菜田地的土壤樣品4份，分別拌勻，各取5g，置于裝有30mL LB培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，于80°C下加熱lOmin，冷至室溫再加入鄰苯二甲酸二丁酯使其質(zhì)量濃度為50 mg/L，于35°C、180 r/min振蕩培養(yǎng)168h。培養(yǎng)結(jié)束后按5%接種量再依次進(jìn)行3次富集培養(yǎng)，每次培養(yǎng)168 h，并逐步提高培養(yǎng)基中鄰苯二甲酸二丁酯濃度，使之分別達(dá)到100 mg/L,200 mg/L,300 mg/L。將最后一級(jí)梯度馴化后的培養(yǎng)液按5%(v/v)接種量轉(zhuǎn)接于30 mL含100 mg/L鄰苯二甲酸二丁酯的LB培養(yǎng)基中，并用無菌生理鹽水作空白對(duì)照，于35°C、180 r/min振蕩培養(yǎng)120 h，測(cè)定各培養(yǎng)液中鄰苯二甲酸二丁酯殘留量。
[0010]將確定有鄰苯二甲酸二丁酯減少的培養(yǎng)液進(jìn)行菌株分離，取培養(yǎng)液稀釋涂布于含100 mg/L鄰苯二甲酸二丁酯的LB平板中，35°C培養(yǎng)72 h后，對(duì)生長出的菌落進(jìn)行分離純化。將純化后的菌株于含100 mg/L鄰苯二甲酸二丁酯的LB斜面上劃線培養(yǎng)，用無菌生理鹽水洗下培養(yǎng)物制成種子液(調(diào)整細(xì)胞濃度約108cfu/mL)。將種子液按5%接種量接種于30mL含100 mg/L鄰苯二甲酸二 丁酯的LB培養(yǎng)基中，并用無菌生理鹽水設(shè)置空白對(duì)照。35°C、180 r/min搖振培養(yǎng)120 h后，測(cè)定各培養(yǎng)液中鄰苯二甲酸二丁酯的殘留量，確定分離菌株對(duì)鄰苯二甲酸二丁酯的降解能力。
[0011]菌株形態(tài)鑒定:革蘭氏染色陽性，芽孢桿菌，菌落近圓形，扁平，不透明，微黃色，不反光，表面皺褶，邊緣不整齊。
[0012]菌株生理生化鑒定
表1菌株JF生理生化測(cè)定結(jié)果。
[0013]菌株JF分子遺傳學(xué)鑒定。
[0014]菌株JF經(jīng)16S rDNA序列測(cè)定，獲得如下序列: gagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcggacagatgggag
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[0016]本發(fā)明所提供的高效降解鄰苯二甲酸酯類化合物的菌株JF是從四川省雅安市雨城區(qū)使用地膜的蔬菜田地的土壤樣品富集得到的，該菌株在寬溫度和寬PH范圍內(nèi)均對(duì)鄰苯二甲酸二丁酯有很高的降解能力，其生長速度快，產(chǎn)生芽孢，對(duì)外界環(huán)境抵抗力強(qiáng)，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地點(diǎn)為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏號(hào)為CGMCC N0.7950，保藏日期為2013年07月22日。
本發(fā)明所用培養(yǎng)基為:Luria_Bertani培養(yǎng)基(LB):酵母浸膏(Yeast extract) 5.0g;胰蛋白胨(Casein tryptone) IOg;氯化鈉(Sodium chloride) IOg;蒸懼水(H2O) 1000mL;調(diào)pH至7.0 ;基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MM):硫酸銨((NH4)2SO4) 1.5g，磷酸二氫鉀(KH2PO4)0.5g，磷酸氫二鉀(K2HPO4) 1.5g，硫酸鎂(MgSO4) 0.2g，氯化鈉(NaCl) 0.5g，去離子水(H2O) 1000mL,調(diào) pH至7.0。此兩種固體培養(yǎng)基是在液體培養(yǎng)基中再加20g/L瓊脂(Agar)制成的。培養(yǎng)基于121。。，滅菌20min備用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1為降解菌株JF培養(yǎng)48h的菌落培養(yǎng)特征。
[0018]圖2為降解菌株JF的細(xì)胞形態(tài)圖。
[0019]圖3為【具體實(shí)施方式】實(shí)例I中降解菌株JF的生長與鄰苯二甲酸二丁酯的降解關(guān)系的曲線。
[0020]圖4為溫度對(duì)菌株JF降解鄰苯二甲酸二丁酯速率的影響。
[0021]圖5為pH值對(duì)菌株JF降解鄰苯二甲酸二丁酯速率的影響。
[0022]圖6為底物質(zhì)量濃度對(duì)菌株JF降解鄰苯二甲酸二丁酯速率的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0023]實(shí)例1:確定鄰苯二甲酸酯降解菌株JF的生長情況與鄰苯二甲酸二丁酯降解的關(guān)系
菌種活化:挑取降解鄰苯二甲酸酯的菌株JF至LB液體培養(yǎng)基中，350C，180r/min振蕩培養(yǎng)24h;然后連續(xù)劃線、挑取單菌落培養(yǎng)兩次(35°C)，挑取單菌落接種至LB斜面35°C培養(yǎng)2d備用。
[0024]用無菌生理鹽水洗下斜面上菌體并調(diào)整細(xì)胞濃度為108cfu/mL，制成種子液。[0025]生長曲線的測(cè)定:將降解菌株JF的種子液按5%接種量接種于含有200mg/L鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)的LB液體培養(yǎng)基中，分裝30 mL/250mL錐形瓶，35°C、180r/min培養(yǎng)48h,取樣時(shí)間為0h_36h期間每2h取樣I瓶,36h_48h期間每4h取樣I瓶,樣品存放于4°C冰箱內(nèi)，測(cè)OD600。
[0026]降解曲線的測(cè)定:將降解菌株JF的種子液按5%接種量接種于含有200mg/L鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)的LB液體培養(yǎng)基中，分裝30 mL/250mL錐形瓶，設(shè)接種5%無菌水為空白對(duì)照，35°C、180r/min振蕩培養(yǎng)，取樣時(shí)間為0h_36h期間每2h取樣I瓶，36h_48h期間每4h取樣I瓶,再從錐形瓶中取均勻培養(yǎng)液ImL,用乙腈定容至IOmL,混勻后于10000r/min離心lOmin，取上清液供液相色譜(HPLC)分析用。測(cè)定條件:色譜柱為Gemini IOOA C18柱(150mmX4.60mm, 5.0 μ m);流動(dòng)相為乙腈:水(83:17, V/V),流速 1.0mL/min ;紫外檢測(cè)器，其波長為210nm ;柱溫為25°C ;進(jìn)樣量10 μ L。
[0027]由結(jié)果可知降解菌株經(jīng)過48h培養(yǎng)，對(duì)照組的鄰苯二甲酸二丁酯幾乎無降解，實(shí)驗(yàn)組中約100%鄰苯二甲酸二丁酯被降解菌株JF降解，14h內(nèi)，鄰苯二甲酸二丁酯與降解菌株JF生長呈正相關(guān)，菌株對(duì)鄰苯二甲酸二丁酯降解速率較快，24h菌體生物量達(dá)到最大，此后囷體生長趨于穩(wěn)定。
[0028]實(shí)例2:菌株JF降解鄰苯二甲酸二丁酯的降解特性
底物濃度對(duì)菌株JF降解鄰苯二甲酸二丁酯速率的影響:按5.0% (v/v)的接種量，將種子液(1.0XlO8個(gè)/mL)接種于鄰苯二甲酸二丁酯濃度不同的LB液體培養(yǎng)基(pH7.0，100mg/L, 200 mg/L, 300 mg/L, 400 mg/L)中，分裝 30 mL/250 mL 錐形瓶，35°C、180 r/min 振蕩培養(yǎng)，間隔4h取樣。用[0024]所述方法測(cè)定鄰苯二甲酸二丁酯降解率。
[0029]培養(yǎng)溫度對(duì)菌株JF降解鄰苯二甲酸二丁酯速率的影響:按5.0% (v/v)的接種量，將種子液(1.0X IO8個(gè)/mL) 接種于鄰苯二甲酸二丁酯質(zhì)量濃度為200 mg/L的LB液體培養(yǎng)基(PH7.0)中，分裝 30 mL/250 mL 錐形瓶，不同溫度下(30°C，35°C，40°C，45°C ) 180r/min振蕩培養(yǎng)，間隔4h取樣。用[0024]所述方法測(cè)定鄰苯二甲酸二丁酯降解率。
[0030]pH對(duì)菌株JF降解鄰苯二甲酸二丁酯速率的影響:按5.0% (v/v)的接種量，將種子液(1.0X IO8個(gè)/mL)接種于不同pH (5.0，6.0，7.0，8.0)的鄰苯二甲酸二丁酯質(zhì)量濃度為200 mg/L的LB液體培養(yǎng)基中，分裝30 mL/250 mL錐形瓶，35°C，180 r/min振蕩培養(yǎng)，間隔4h取樣。用[0024]所述方法測(cè)定鄰苯二甲酸二丁酯降解率。
[0031]菌株JF降解鄰苯二甲酸二丁酯的降解特性結(jié)果:在測(cè)試的底物(鄰苯二甲酸二丁酯)質(zhì)量濃度、溫度、PH值范圍內(nèi)，鄰苯二甲酸二丁酯半衰期為3.1 h~7.0h，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其自然降解半衰期(4.4 d~15.1d)，在底物質(zhì)量濃度為100mg/L時(shí)12h內(nèi)可完全降解鄰苯二甲酸二丁酯，進(jìn)一步證明了菌株JF可以高效降解鄰苯二甲酸二丁酯，且菌株的生長速率較快。溫度在30~45°C范圍內(nèi)，菌株對(duì)鄰苯二甲酸二丁酯降解率變化比較大，且呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)；pH值對(duì)鄰苯二甲酸二丁酯降解率影響不大；底物濃度在100~400mg/L范圍內(nèi)，鄰苯二甲酸二丁酯降解率變化較大，底物質(zhì)量濃度達(dá)到400mg/L時(shí)，鄰苯二甲酸二丁酯降解率較低，顯然鄰苯二甲酸二丁酯抑制了菌株的生長。這一研究結(jié)果可為菌株JF應(yīng)用于污水處理和土壤修復(fù)提供一定的數(shù)據(jù)參考。
[0032]實(shí)例3:鄰苯二甲酸酯降解菌株JF在麗培養(yǎng)基中對(duì)鄰苯二甲酸二丁酯的降解效果將降解菌株的種子液按5%接種量接種于200mg/L鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)的麗液體培養(yǎng)基中，分裝30 mL/250mL錐形瓶，設(shè)接種5%無菌水為空白對(duì)照，35°C、180r/min振蕩培養(yǎng)。
[0033]培養(yǎng)60h后取樣，用[0024]所述方法測(cè)定培養(yǎng)液中鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)的殘留量，對(duì)照組鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)幾乎沒有降解，實(shí)驗(yàn)組中約92.66%鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)被菌株JF降解。
[0034]實(shí)例4:鄰苯二甲酸酯降解菌株JF對(duì)鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)的降解效果
將降解菌株的種子液按5%接種量接種于200mg/L鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)的LB液體培養(yǎng)基中，分裝30 mL/250mL錐形瓶，設(shè)接種5%無菌水為空白對(duì)照，35°C、180r/min振蕩培養(yǎng)。
[0035]培養(yǎng)20h后取樣，用[0024]所述方法測(cè)定培養(yǎng)液中鄰苯二甲酸二(2_乙基己)酯的殘留量，對(duì)照組鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯幾乎無降解，實(shí)驗(yàn)組中約97.01%鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯被菌株JF降解。 [0036]實(shí)例5:鄰苯二甲酸酯降解菌株JF對(duì)被污染土壤中的鄰苯二甲酸酯的降解效果 從四川省雅安市雨城區(qū)使用地膜的蔬菜田地的土壤中取一定量的土壤樣品，添加鄰苯
二甲酸二丁酯(DBP)使其質(zhì)量濃度約為200mg/L，將降解菌株的種子液按5%接種量接種(實(shí)驗(yàn)組)，設(shè)接種5%無菌水為空白對(duì)照，35°C培養(yǎng)，每24h取樣，用[0024]所述方法測(cè)定土壤樣品中DBP的殘留量。
[0037]通過HPLC檢測(cè)樣品中鄰苯二甲酸二丁酯的殘留量，空白土壤樣品中鄰苯二甲酸二丁酯含量變化較小，實(shí)驗(yàn)組的土壤樣品在5d時(shí)幾乎檢測(cè)不到鄰苯二甲酸二丁酯。
[0038]實(shí)例6:鄰苯二甲酸酯降解菌株JF對(duì)塑膠廠污水中鄰苯二甲酸酯的降解效果 從四川省成都市某塑膠廠的污水中取一定量的污水樣品，添加鄰苯二甲酸二丁酯
(DBP)使其濃度約為200mg/L，將降解菌株的種子液按5%接種量接種(實(shí)驗(yàn)組)，設(shè)接種5%無菌水為空白對(duì)照，35°C培養(yǎng)，每24h取樣，用[0024]所述方法測(cè)定污水樣品中DBP的殘留量。
[0039]通過HPLC檢測(cè)樣品中鄰苯二甲酸二丁酯的殘留量，空白污水樣品中鄰苯二甲酸二丁酯含量變化較小，實(shí)驗(yàn)組的污水樣品在4d時(shí)幾乎檢測(cè)不到鄰苯二甲酸二丁酯。
[0040]以上的實(shí)例僅僅是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行描述，而并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可以對(duì)上述說明進(jìn)行改進(jìn)或變形，但所有的這些改進(jìn)或變形均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求確定的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一株枯草芽孢桿菌JF (Bacillus subtilis strainJF),其特征在于保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地點(diǎn)為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏號(hào)為CGMCC N0.7950，保藏日期為2013年07月22日。
2.權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌JF(,Bacillus subtilis strainJF),其特征在于:(I)個(gè)體形態(tài)特征:革蘭氏染色陽性，芽孢桿菌；(2)菌落特征:菌落近圓形，扁平，不透明，微黃色，不反光，表面皺褶，邊緣不整齊；(3)生化指標(biāo)特征:兼性厭氧，對(duì)葡萄糖、阿拉伯糖、木糖和甘露醇發(fā)酵均呈陽性；能水解明膠和淀粉；苯丙胺酸脫氫酶和卵黃卵磷脂酶呈陰性；(4)16S rDNA序列特征:該菌株的16S rDNA基因測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行Blast同源性對(duì)比，該菌株序列與subtilis菌株基因序列高度同源，得到登錄號(hào)為KF364634。
3.權(quán)利要求1所述枯草芽孢桿菌JF(Zfeci77w5.subtilis strainJF)在降解鄰苯二甲酸酯化合物中的應(yīng)用。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的枯草芽孢桿菌JF的應(yīng)用，其特征在于，降解組合條件為:溫度 30-45°C, pH=5.0-8.0。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的枯草芽孢桿菌JF的應(yīng)用，其特征在于，降解組合條件為:溫度35°C，pH=7.0,接種量5%，裝液量30mL/250mL錐形瓶，搖床轉(zhuǎn)速180r/min。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的枯草芽孢桿菌JF的應(yīng)用，該菌株可用于鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基己)酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二辛酯(DOP)、鄰苯二甲酸丁芐酯(BBP)、鄰苯二甲酸二異壬酯(DINP)等鄰苯二甲酸酯的生物降解，以及這些物質(zhì)污染的土壤、水體的生物修復(fù)或生物凈化，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，進(jìn)而保障農(nóng)產(chǎn)品安全。`
【文檔編號(hào)】C02F3/34GK103571771SQ201310413638
【公開日】2014年2月12日 申請(qǐng)日期:2013年9月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月12日
【發(fā)明者】不公告發(fā)明人 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)