去除鄰硝基苯甲醛的酶制劑及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于酶基因工程及酶工程領域，涉及一種去除鄰硝基苯甲醛的酶制劑及應用。一種去除鄰硝基苯甲醛的酶制劑，其特征在于：所述的酶制劑為水溶液或緩沖溶液，包含一種鄰硝基苯甲醛降解酶，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.1所示，以及終濃度為0.1-0.3mM的CaCl2，反應體系pH值為6.5-8.0。酶制劑為緩沖溶液時，該緩沖溶液一般為pH值7.2-7.7的50-100mM磷酸鈉緩沖液或磷酸鉀緩沖液。所述的鄰硝基苯甲醛降解酶的純酶含量為0.03-0.1mg/mL。本發(fā)明的酶制劑通過優(yōu)選添加金屬化合物，使得本發(fā)明的酶制劑酶活高，降解ONBA效果優(yōu)異；所采用的微生物降解酶采用基因工程手段制備，成本低，有利于大規(guī)模推廣；采用酶法降解ONBA，不僅效果好，且操作簡單、安全、所需反應條件溫和，不形成二次污染。
【專利說明】去除鄰硝基苯甲醛的酶制劑及應用【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于酶基因工程及酶工程領域，涉及ー種去除鄰硝基苯甲醛的酶制劑及應用。
【背景技術】
[0002]隨著我國エ業(yè)化進程的加快，有機エ業(yè)合成廢水的排放量越來越大。有機エ業(yè)合成廢水是指在生產(chǎn)過程中排放的含有對生物體有毒的エ業(yè)廢水，這類廢水不僅含大量有機物，且存在大量對生物體有毒害作用的物質(zhì)，已對環(huán)境造成了嚴重的污染，威脅到人類生命健康。參照急性毒性分級標準，鄰硝基苯甲醛(o-nitix)benZaldehyde，ONBA)為中等毒性化合物。ONBA是重要的精細有機化工中間體，廣泛用于醫(yī)藥、染料和有機合成，如用于合成抗心絞痛藥物硝基吡啶(心痛定)、鄰硝基苯乙烯類及鄰硝基肉桂酸類系列產(chǎn)品等。將其硝基還原成氨基后，所得到的鄰氨基苯甲醛還可用于喹啉類化合物的合成，其エ業(yè)需求量十分大。但由于其生產(chǎn)過程伴隨著大量污染物質(zhì)的產(chǎn)生，發(fā)達國家已將其生產(chǎn)線轉移到發(fā)展中國家(污染轉移)，這ー點在我國東南部地區(qū)尤為明顯。具不完全統(tǒng)計，東南地區(qū)年產(chǎn)鄰硝基苯甲醛在70萬噸以上，且絕大多數(shù)生產(chǎn)廢水未經(jīng)處理就直接排放，對周邊環(huán)境造成了極大的損害。在一定程度上，可以說這一點源污染已成為面源污染。
[0003]硝基芳香化合物的去除主要有物理法、化學法和微生物降解法三種。物理和化學方法雖然能夠有效去除此類物質(zhì)，但成本高，需要特制的儀器和裝備，且酸、堿易腐蝕，具有一定的危險性。實際上，硝基芳香化合物在環(huán)境中的降解和轉化主要是由微生物完成的(微生物對其的代謝多通過一系列酶促反應完成)。因此，如何充分利用好功能微生物資源，去除特異性污染物，成為了修復相關環(huán)境的迫切需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的不足，提供ー種去除鄰硝基苯甲醛的酶制劑。
[0005]本發(fā)明的另ー目的是提供該酶制劑的應用。
[0006]本發(fā)明解決其技術問題所采用的技術方案是:
[0007]—種去除鄰硝基苯甲醛的酶制劑，其特征在干:所述的酶制劑為水溶液或緩沖溶液，包含一種鄰硝基苯甲醛降解酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，以及終濃度為
0.1-0.3mM的CaCl2,反應體系pH值為6.5-8.0。酶制劑為緩沖溶液吋，該緩沖溶液一般為pH值7.2-7.7的50-100mM磷酸鈉緩沖液或磷酸鉀緩沖液。所述的鄰硝基苯甲醛降解酶的純酶含量為0.03-0.lmg/mL。進ー步的，所述的CaCl2終濃度為0.2mM。
[0008]一種去除鄰硝基苯甲醛的酶制劑的制備方法，其特征在于:取純化酶液樣本20mL和氯化鈣，用pH值7.5的80mM磷酸鈉緩沖液定容至IL制成酶制劑，酶制劑中氯化鈣的終濃度為 0.1-0.3mM.
[0009]所述純化酶液樣本的制備方法如下:所述純化酶液樣本的制備方法如下:挑取含有重組質(zhì)粒的菌株，該重組質(zhì)粒上含有nbaA基因編碼片段，用LB培養(yǎng)基于37°C培養(yǎng)，待A600nm值為0.6吋，加入IPTG至終濃度ImM，隨后于20°C過夜表達；離心收集細胞，重懸于80mM pH7.5的磷酸鈉緩沖液，在冰水浴中超聲破碎細胞——功率為400W超聲波破碎5s，暫停15s，共進行60個循環(huán)；隨后，于4°C，1000Og離心30min去除細胞碎片，上清液即為粗酶提取液；使用ー站式組氨酸標簽蛋白純化試劑盒對所述粗酶提取液進行純化，獲得純化酶液樣本。
[0010] 所述的酶制劑在降解土壌中鄰硝基苯甲醛中的應用。應用所述酶制劑降解土壌中鄰硝基苯甲醛時，體系溫度為18-40°c，pH為6.0-8.5。
[0011]本發(fā)明通過克隆Pseudomonas sp.0NBA-17中負責ONBA降解的脫氫酶基因并表達，獲得了 ONBA降解酶，為ONBA的降解提供有效的生物降解手段，對于ONBA污染環(huán)境的修復具有重要意義。該菌是假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)的菌株0NBA-17,于2013年9月2曰在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，編號為CGMCC N0.8095。保藏単位的地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院中科院微生物研究所，該菌的分類命名為假單胞菌 Pseudomonas sp.。
[0012]本發(fā)明采用的NbaA酶對ONBA的酶活力為2442U/mg，分別是NahF酶活力(552U/mg)和NahV酶活力(245U/mg)的442.4%和996.7 %，顯著強于二者。而nbaA同nahF和nahV的序列同源性分別為62%和89%。由上可知，基因序列的不同引發(fā)了酶的空間構象的差異，并最終致使酶作用能力產(chǎn)生差異。
[0013]本發(fā)明酶制劑的有益效果主要體現(xiàn)在以下幾個方面:
[0014](I)通過優(yōu)選添加金屬化合物，使得本發(fā)明的酶制劑酶活高，降解ONBA效果優(yōu)異；
[0015](2)本發(fā)明的酶制劑，所采用的微生物降解酶采用基因工程手段制備，成本低，有利于大規(guī)模推廣；
[0016](3)本發(fā)明的酶制劑，采用酶法降解0NBA，不僅效果好，且操作簡單、安全、所需反應條件溫和，不形成二次污染。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1 是 Pseudomonas sp.0NBA-17 總 DNA(Genomic DNA)電泳檢測圖。
[0018]圖2是pH值對NbaA酶活力的影響圖。
[0019]圖3是不同處理土壤樣品中ONBA含量變化曲線。
【具體實施方式】
[0020]下面通過具體實施例，對本發(fā)明的技術方案作進ー步的具體說明。應當理解，本發(fā)明的實施并不局限于下面的實施例，對本發(fā)明所做的任何形式上的變通和/或改變都將落入本發(fā)明保護范圍。
[0021]在本發(fā)明中，若非特指，所有的份、百分比均為重量単位，所有的設備和原料等均可從市場購得或是本行業(yè)常用的。
[0022]實施例1Pseudomonas sp.0NBA-17 總 DNA (Genomic DNA)的提取
[0023]1.1Pseudomonas sp.0NBA-17 的擴大培養(yǎng)
[0024]在無菌操作環(huán)境下，將_70°C保存的Pseudomonas sp.0NBA-17以接種針挑取小塊，放置、涂布于Luria-Bertani(LB)固體培養(yǎng)基之上。28°C，靜置培養(yǎng)3d。挑選單菌落，經(jīng)2次轉接，觀察發(fā)現(xiàn)平板上菌落形態(tài)一致(無雜菌)。這里所述的“平板”和Luria-Bertani (LB)固體/液體培養(yǎng)基等均為微生物研究/生產(chǎn)領域常見術語、培養(yǎng)基、技術和方法，具體參見《分子克隆實驗指南》(J.薩姆布魯克，等著.分子克隆實驗指南(第三版)[M].黃培堂，等譯.北京:科學出版社，2008)。下文中如無特別備注或說明，均為微生物研究常用技術、方法、培養(yǎng)基、試劑和藥品，且均在《分子克隆實驗指南》中有所記錄。
[0025]1.2Pseudomonas sp.0NBA-17 總 DNA 的提取
[0026]菌體總DNA的提取采用SDS高鹽沉淀法。挑取LB平板上的單菌落，接至1OOmL的LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至穩(wěn)定期。離心收集菌體，加等體積的TEN溶液[IOmMTris-Cl (pH8.0), ImM EDTA(pH8.0),0.1M NaCl]洗滌菌體，離心收集菌體，懸浮于 IOmLTE [IOmM Tris-Cl (pH8.0), ImM EDTA (pH8.0)]溶液中，加入 100 y L 溶菌酶(100mg/mL)，37°C水1h，加入 40 ii L 蛋白酶 K(20mg/mL)，再加入 300 u L20% (w/v% )的 SDS，37°C水浴過夜(約12h)。加入1/2體積飽和NaCl劇烈振蕩，12000g離心IOmin,上清用等體積酚:氯仿抽提2次，12000g離心lOmin，收集上清，加入等體積TE溶液(稀釋調(diào)整NaCl濃度)，0.6倍體積異丙醇沉淀，12000g離心15min，70% (v/v% )こ醇洗滌沉淀，こ醇揮發(fā)后溶于1OOu L TE 中。
[0027]將提取到的菌體總DNA適當稀釋后，經(jīng)0.75% (w/v% )瓊脂糖電泳檢測其質(zhì)量(如圖1所示)，發(fā)現(xiàn)所提取的總DNA大部分集中在23kb左右，基本上沒有RNA存在，純度較好，濃度較高。
[0028]實施例20NBA降解酶編碼基因nbaA的獲得
[0029]經(jīng)過大量的分析實驗，從40對自行設計的引物中篩選出一對有效擴增引物(分別記為 SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4)。
[0030]nbaA-f，5’ -ACGACCATATGAAGGTACAACTGGTGAT-3?(下劃線為 NdeI 酶切位點，基因序列為 SEQ ID N0.3)；
[0031 ] nbaA-r，5 ’ -CATCAAAGCTTGAAGGGATAAGGCTGGCC-3 ’(下劃線為 HindII I 酶切位點，基因序列為SEQ ID N0.4)。
[0032]25 ii L 擴增體系:10 X Taq DNA 聚合酶反應緩沖液 2.5 y L ;dNTP (25mM) 2 y L ;引物(25pmol/ ii L)各 0.5 ii L ；Mg2+ 緩沖液(25mM) 2.5 u L ;實施例1 中所得總 DNA0.5 y L (1OOng) ;Taq 酶(5U/u L)0.3u L ；ddH2016.2 u L0 反應參數(shù):95 °C 預變性 5min，94 °C 變性30sec，52°C退火30sec，72°C延伸lmin，擴增25個循環(huán)，最后72°C終延伸5min。
[0033]擴增產(chǎn)物經(jīng)0.75% (w/v% )瓊脂糖電泳檢測，發(fā)現(xiàn)擴增片段與預期大小(1.4kb左右)相符。切取含有nbaA基因擴增片段的凝膠，放入無菌1.5mL離心管中稱重，使用B10MIGA膠回收純化試劑盒進行目的片段回收，4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0034]參照《分子克隆實驗指南》，用Nde I和HindIII消化上述回收片段，再將片段插入到用上述同種內(nèi)切酶消化過的pET21b(+)載體中。挑取質(zhì)粒，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗證插入片段后，挑取克隆子交上海生エ測序。所得nbaA編碼基因序列如SEQ ID N0.2所示(由1446個核苷酸組成)，其相應氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示(482個氨基酸組成)?；蛐蛄斜葘ο仁堑卿浢绹鴩疑锛夹g信息中心(NCBI)網(wǎng)站，再經(jīng)BLAST搜索引擎搜尋GenBank完成。結果顯示，同nbaA編碼基因序列同源的功能基因最高序列同源性僅為90% (GQ848198.1)，且GQ848198.1指代基因未見其關于ONBA降解的報道。而同NbaA氨基酸序列同源的蛋白(水楊醛脫氫酶，YP_006536128.1)最高序列同源性不足90 %，且YP_006536128.1指代蛋白未見其關于ONBA降解的報道。
[0035]實施例3表達載體的構建、表達與純化
[0036]用NdeI和HindIII消化上述實施例2中的nbaA基因擴增產(chǎn)物，再將片段插入到用上述同種內(nèi)切酶消化過的pET21b(+)載體中。在重組質(zhì)粒中，nbaA基因由17啟動子啟動，表達產(chǎn)物C端帶有6個組氨酸標簽，氨芐青霉素為篩選標記。聯(lián)入片段經(jīng)上海生エ測序驗證，以確保PCR過程中沒有引入突變。
[0037]重組質(zhì)粒轉入Escherichia coli BL21 (DE3),隨后挑取含有重組質(zhì)粒的的菌株(編號為K-7)，經(jīng)上海生エ測序驗證外源基因?qū)肭闆r，證實外源基因?qū)氤晒Α?br> [0038]K-7用LB培養(yǎng)基于37°C培養(yǎng)，待A6tltol值為0.6時，加入IPTG至終濃度ImM，隨后于20°C過夜表達，以避免包涵體產(chǎn)生。離心收集細胞，重懸于80mM的磷酸鈉緩沖液(pH7.5)，在冰水浴中超聲(功率為400W)破碎細胞——超聲波破碎5s，暫停15s，共進行60個循環(huán)。隨后，于4°C，10000g離心30min去除細胞碎片。上清液即為粗酶提取液，低溫保存。該步驟實驗進行同時，設置未轉入重組質(zhì)粒的E.coli BL2KDE3)作為對照，并同樣進行誘導、離心、破碎和收集粗酶提取液等步驟。
[0039]使用ー站式組氨酸標簽蛋白純化試劑盒(N1-NTA Spin Kit, QIAGEN)對上述粗酶提取液進行純化，獲得純化酶液樣本(其中鄰硝基苯甲醛降解酶的純酶含量為3.5mg/mL)，所有操作均在低溫環(huán)境下進行。
[0040]實施例4NbaA蛋白對ONBA的作用效果
[0041]參照趙化冰等人研究(趙化冰，李永君，陳威，蔡寶立.惡臭假單胞菌ND6菌株中與萘降解相關的新型水楊醛脫氫酶NahV.科學通報，2007，52:1257-1262)，采用上述實施例3中的純化酶液樣本，向0.5mL的反應體系(含80mM的磷酸鈉緩沖液，200 y M的NAD+，pH7.5，25°C)中加入終濃度為200iiM的ONBA作為反應底物，并測定NbaA酶活力。一個酶活力単位(U)定義為:25て條件下，毎分鐘還原Iymol NAD+所需的酶量。比活力表示為每毫克蛋白的酶活力單位。蛋白濃度以牛血清白蛋白作為標準參照，通過Bradford法測定。ONBA含量測定參照Yu等人報道進行(Yu Fang-Bo, Shen Biao, Li Shun-Peng.1solation and characterization of Pseudomonas sp.strain ONBA-17degradmgo-nitriobenzaldehyde.Current Microbiology，2006，53:457-461)。
[0042]結果顯示，上述純化酶液樣本對ONBA的酶活力為2442U/mg (該值為5次實驗重復的平均值，標準偏差為5.6U/mg)，對照(實施例3中提到的未轉入重組質(zhì)粒E.coli BL21的粗酶提取純化物)無ONBA降解能力，這也進一步證實了實施例2中所得基因片段的功能作用。較已有報道，本發(fā)明得到的NbaA酶活力分別是NahF酶活力(552U/mg)(該值為5次實驗重復的平均值，標準偏差為4.2U/mg)和NahV酶活力(245U/mg)(該值為5次實驗重復的平均值，標準偏差為3.6U/mg)的442.4%和996.7%，顯著強于二者。而nbaA同nahF和nahV的序列同源性分別為62%和89%。由上可知，基因序列的不同引發(fā)了酶的空間構象的差異，并最終致使酶作用能力產(chǎn)生差異。
[0043]將純化酶液樣本在50°C水浴30min后，再通過上述方法測定酶活力。結果表明，在較高溫度下NbaA比NahF和NahV更穩(wěn)定。在50°C保溫30min后，NbaA仍保持了 88.4%的酶活力(該值為4次實驗重復的平均值，標準偏差為0.6% )，而NahF和NahV僅保存了71.4% (該值為4次實驗重復的平均值，標準偏差為0.7% )和11.2% (該值為4次實驗重復的平均值，標準偏差為0.2%)的酶活力，差異顯著。
[0044]實施例5反應體系pH對酶活性的影響
[0045]參照實施例4準備反應體系,緩沖液仍為80mM的磷酸鈉緩沖液(測試pH值分設
5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0)，以 200 ii M 的 ONBA 為底物，并添加實施例 3 和 4 中提及的純化酶液樣本，結果如圖2所示。由圖2可知，當反應體系pH值介于6.5和8.0之間時，酶活力保持在較高水平(較高水平指最大酶活性的75%及以上)。
[0046]實施例6添加金屬化合物對酶活性的影響
[0047]參照實施例4和5準備反應體系，緩沖液為80mM的磷酸鈉緩沖液(pH值7.5)，以200 ii M的ONBA為底物，添加實施例3、4和5中提及的純化酶液樣本，以及終濃度為0.2mM的易溶于水的金屬化合物(測試金屬離子包括:氯化鋰、氯化鈣、硝酸銀、氯化鎳、氯化鋅、氯化鎘、氯化銅、氯化亞鐵、氯化鋇和氯化鈷)。同吋，設置不添加上述測試金屬化合物的處理作為對照。結果如表1所示，鎳、銀、鋰、銅和鈷離子對酶活有明顯的抑制作用，鋅、亞鉄、鋇和鎘離子對酶活力影響不顯著，鈣離子添加可使酶活力較對照提高44%，達顯著差異水平。
[0048]表1、金屬離子對酶活力的影響
【權利要求】
1.一種去除鄰硝基苯甲醛的酶制劑，其特征在于:所述的酶制劑為水溶液或緩沖溶液，包含一種鄰硝基苯甲醛降解酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，以及終濃度為0.1-0.3mM 的 CaCl2,反應體系 pH 值為 6.5-8.0。
2.根據(jù)權利要求1所述的酶制劑，其特征在于:所述的鄰硝基苯甲醛降解酶的純酶含量為 0.03-0.lmg/mL。
3.權利要求1所述的酶制劑，其特征在于:所述的CaCl2終濃度為0.2mM。
4.一種去除鄰硝基苯甲醛的酶制劑的制備方法，其特征在于:取純化酶液樣本20mL和氯化鈣，用pH值7.5的80mM磷酸鈉緩沖液定容至IL制成酶制劑，酶制劑中氯化鈣的終濃度為 0.1-0.3mM0
5.根據(jù)權利要求1所述的酶制劑的制備方法，其特征在于:所述純化酶液樣本的制備方法如下:挑取含有重組質(zhì)粒的菌株，該重組質(zhì)粒上含有nbaA基因編碼片段，用LB培養(yǎng)基于37°C培養(yǎng)，待A6tltlnm值為0.6時，加入IPTG至終濃度1mm，隨后于20°C過夜表達；離心收集細胞，重懸于80mM pH7.5的磷酸鈉緩沖液，在冰水浴中超聲破碎細胞——功率為400W超聲波破碎5s，暫停15s，共進行60個循環(huán)；隨后，于4°C，1000Og離心30min去除細胞碎片，上清液即為粗酶提取液；使用ー站式組氨酸標簽蛋白純化試劑盒對所述粗酶提取液進行純化，獲得純化酶液樣本。
6.一種權利要求1所述的酶制劑在降解土壌中鄰硝基苯甲醛中的應用。
7.根據(jù)權利要求6所述的應用，其特征在于:應用權利要求1所述酶制劑降解土壌中鄰硝基苯甲醛時，體系溫度為18-40°C，pH為6.0-8.5。
【文檔編號】B09C1/10GK103497936SQ201310454298
【公開日】2014年1月8日 申請日期:2013年9月27日 優(yōu)先權日:2013年9月27日
【發(fā)明者】虞方伯, 管莉菠, 單勝道, 駱林平 申請人:浙江農(nóng)林大學