一種具有高效解磷作用的黑曲霉菌株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種高效的解磷菌黑曲霉(Aspergillusniger)。本發(fā)明所述枯草芽孢桿菌保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC?No.8240。本發(fā)明涉及的黑曲霉(Aspergillusniger)具有較高的解磷作用，不污染環(huán)境，生態(tài)安全。該高效黑曲霉(Aspergillusniger)單獨(dú)使用或與其它植物生長所需要的有機(jī)、無機(jī)營養(yǎng)成分一起使用，制備成生物復(fù)合肥料具有提高產(chǎn)量和改良品質(zhì)的作用。
【專利說明】一種具有高效解磷作用的黑曲霉菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物和生物肥料領(lǐng)域，特別是涉及黑曲霉，具體而言，本發(fā)明涉及一種高效解磷作用的黑曲霉及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]磷肥能夠促進(jìn)植物花芽分化，提早開花結(jié)果，促進(jìn)幼苗根系生長和改善果實(shí)品質(zhì)。施磷能夠促進(jìn)各種代謝正常進(jìn)行，植物生長發(fā)育良好，同時(shí)提高植物的抗寒性和抗旱性。由于磷與糖類、蛋白質(zhì)和脂肪的代謝和三者相互轉(zhuǎn)變都有關(guān)系，多以不論栽培糧食作物、豆類作物和油類作物都需要磷肥。缺磷時(shí)，蛋白質(zhì)合成受阻，新的細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核形成較少，影響細(xì)胞分裂，生長緩慢，也少，分枝或分蘗減少，植株矮小，葉片暗綠，可能是細(xì)胞生長慢，葉綠素含量相對(duì)提高。某些植物葉子有時(shí)呈紅色或紫色。因?yàn)槿绷鬃璧K了糖分運(yùn)輸，也自己累了大量的糖分，有利于黃色素苷的形成。缺磷時(shí)，開花期和成熟期都延遲，產(chǎn)量降低，抗性減弱。但我國有74%的耕地土壤缺磷，土壤中95%以上的磷為無效形式，植物很難直接吸收利用，此外，大量使用化肥明顯造成土壤板結(jié)、土壤保水力下降、草地退化、荒漠化嚴(yán)重等不良后果。因此，提高磷的利用率一直是農(nóng)學(xué)、土壤學(xué)、生態(tài)環(huán)境和微生物學(xué)研究者關(guān)注的執(zhí)占。
[0003]人們?cè)?0世紀(jì)初開始注意到微生物與土壤磷之間的關(guān)系。Sackett (1908年)發(fā)現(xiàn)一些難溶性的復(fù)合物施入土壤中，可以被作為磷源而應(yīng)用，他們從土壤中篩選出50株細(xì)菌，其中36株在平板上形成了肉眼可見的溶磷圈。1948年Gerretsen發(fā)現(xiàn)植物施入不溶性的磷肥，經(jīng)接種土壤微生物后，促進(jìn)了植株的生長，增加磷的吸收。他分離出了這些微生物，發(fā)現(xiàn)這些微生物可幫助磷礦粉的溶解。從此，許多科學(xué)家致力于解磷菌的研究，相繼報(bào)道了許多微生物具有解磷作用。`
[0004]本申請(qǐng)發(fā)明人經(jīng)過多年悉心研究，從植物根際土壤中分離到一株新的黑曲霉菌株，該菌株具有較強(qiáng)的解磷作用，能把無效的磷有效的轉(zhuǎn)變成可用磷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種新的黑曲霉菌株，所述菌株具有較好的解磷作用。
[0006]本發(fā)明所述的黑曲霉(Aspergillus niger)已經(jīng)于2013年9月24日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8240.進(jìn)一步地，本發(fā)明提供上述黑曲霉在解磷方面的用途。
[0007]進(jìn)一步地，本發(fā)明的黑曲霉可以制成微生物菌劑，即將所述菌株在H)培養(yǎng)液中(馬鈴薯200克，葡萄糖20克，水1000 mL)培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為27 °C，培養(yǎng)天數(shù)為5天，轉(zhuǎn)速為200 rpm，培養(yǎng)液過濾后，將菌液細(xì)胞數(shù)調(diào)節(jié)為IO8個(gè)/mL，即制得本發(fā)明的黑曲霉微生物菌劑。
[0008]本發(fā)明所提供的黑曲霉是從植物根際土壤中分離得到的，其實(shí)驗(yàn)室命名為菌株Fdpal0
[0009]菌株Fdpal在PDA固體培養(yǎng)基在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，肉眼觀察菌落生長特征、測(cè)量菌落生長速度，光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲形狀及孢子大小、形狀、類型等。通過觀察發(fā)現(xiàn)，自中伸出，直徑15~20pm，長約I~3mm，壁厚而光滑。頂部形成球形頂囊，其上全面覆蓋一層?；鸵粚有」＃」Ｉ祥L有成串褐黑色的球狀，直徑2.5~4.0 μ m。分生孢子頭球狀，直徑700~800 μ m，褐黑色。蔓延迅速，初為白色，后變成鮮黃色直至黑色厚絨狀，背面無色或中央略帶黃褐色。根據(jù)《真菌鑒定手冊(cè)》等方法初步鑒定菌株Fdpal為黑曲霉屬，利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)其ITS序列鑒定后該菌為黑曲霉Aspergillus niger。
[0010]本發(fā)明的效果
在平板法中，即將解磷菌在含有難溶性磷酸鹽或有機(jī)磷的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落周圍產(chǎn)生較大的溶磷圈，本發(fā)明的黑曲霉經(jīng)磷鑰藍(lán)分光光度法測(cè)得其解磷效果為537.142mg/L,說明本發(fā)明菌株具有較強(qiáng)的解磷作用。
【具體實(shí)施方式】
[0011]本發(fā)明公開了一種高效解磷菌黑曲霉，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)來實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，這些都被視為包括在被發(fā)明內(nèi)。本發(fā)明所述的黑曲霉已經(jīng)通過較規(guī)范的實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不擺脫本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對(duì)本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動(dòng)和適當(dāng)?shù)淖兏c組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0012]下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
[0013]實(shí)施例1微生物從土樣中的分離
從河北衡水湖附近采回的黃頂菊根際土壤，稱取IOg 土壤用90mL無菌水進(jìn)行混勻，然后在從中取ImL樣用9mL無菌水進(jìn)行稀釋`，以此進(jìn)行6次，稀釋成10_6、10_7、10_8 3個(gè)梯度，移取最后三個(gè)梯度的菌懸液100微升，涂布于蒙金娜無機(jī)磷培養(yǎng)基(葡萄糖10 g，(NH4)2SCM
0.5 g, NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，F(xiàn)eS047H20 0.03 g，MnS044H20 0.03 g，MgS047H20 0.3 g,磷礦粉10 g，酵母膏0.4 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 ml, pH 7.0~7.5)平板上，以最后一次的稀釋液作為對(duì)照，于28°C下培養(yǎng)，并每24h觀察一次。選擇對(duì)照中無菌落，而此前的稀釋液中長出菌落的菌株，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等特征跳取單菌落于液體蒙金娜無機(jī)磷培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并純化編號(hào)。
[0014]實(shí)施例2解磷菌株的篩選
在無菌環(huán)境下，將所有菌株接種到蒙金娜培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)7天。觀察平板中菌落生長情況，根據(jù)產(chǎn)生解磷圈大小篩選出高效解磷菌。
[0015]實(shí)施例3菌株的ITS序列測(cè)定和分析及生理生化試驗(yàn)鑒定
ITS鑒定:將篩選菌株的孢子液接入ro液體培養(yǎng)基中，28°C搖床培養(yǎng)48 h，過濾獲得菌絲，提取真菌基因組DNA。以提取的真菌DNA作為模板，以ITS5和ITS8引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為25 μ 1，反應(yīng)體系為:基因組DNA IyL, 10XPCR buffer 2.5 μ L，NSl 弓丨物 I μ L, NS8 弓丨物 I μ L, dNTPs 2 μ L, Taq 酶 0.25 μ L, ddH20 17.25 μ L。反應(yīng)條件為:94°C 5 min，94°C 30 s，57°C 50 s，72°C 50 s ;循環(huán) 30 次；72°C 10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序后，將獲得的DNA序列，輸入NCBI，用Blast程序與數(shù)據(jù)庫中的所有序列進(jìn)行比較分析。
[0016]同源比較結(jié)果如下:
將該P(yáng)CR擴(kuò)增產(chǎn)物在GenBank中進(jìn)行blast比對(duì)結(jié)果表明，本發(fā)明的菌株Fdpal與其高度同源的50個(gè)菌種均是黑曲霉屬，其同源性均在99%以上。經(jīng)過序列分析顯示，本發(fā)明所分離的菌株屬于黑曲霉。
[0017]實(shí)施例4本發(fā)明所述黑曲霉微生物菌劑的制備
將保藏編號(hào)為CGMCC N0.8240的黑曲霉在H)培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)液溫度為27 V,天數(shù)為5天,轉(zhuǎn)速為200rpm, pH值為8。發(fā)酵培養(yǎng)后，加入5%的鹿糖,然后過濾并調(diào)節(jié)菌液細(xì)胞數(shù)為IO8個(gè)/mL，即制得本發(fā)明的黑曲霉微生物菌劑。
[0018]實(shí)施例5鑰銻鈧比色法測(cè)定微生物解磷能力
在含磷的溶液中，加入鑰酸銨，在一定酸度條件下，溶液中的磷酸與鑰酸絡(luò)合形成黃色的磷鑰雜合酸一磷鑰黃，然后用抗壞血酸加酒石酸銻鉀作還原劑，可以使磷鑰雜多酸轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的藍(lán)色溶液(鑰藍(lán))，其顏色深淺與磷含量成正比關(guān)系，由此可進(jìn)行比色定量.用分光光度計(jì)在波長700 nm處測(cè)定鑰藍(lán)的吸光值，以定量分析磷含量。
[0019]磷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
依次吸取0.0、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 mL 5 mg/L磷酸標(biāo)準(zhǔn)溶液入試管，各加入2 mL鋁鋪抗顯色劑，以蒸懼水定容至20 mL,搖勻靜置15-20 min后,700 nm下測(cè)定吸光度“以吸光度為縱坐標(biāo)，以磷濃度為橫坐標(biāo)，繪制磷標(biāo)準(zhǔn)曲線”，此時(shí)各管中磷濃度分別為:0.00,0.20、
0.40、0.60、0.80、1.00 mg/L。
[0020]培養(yǎng)液中可溶性磷含量的測(cè)定
取I mL在難溶性無機(jī)磷液體培養(yǎng)基(葡萄糖10 g，(NH4)2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl0.3 g，MgSO4.7Η20 0.3 g，F(xiàn)eSO4.7H20 0.03 g，MnSO4.H2O 0.03 g, Ca3 (PO4)2 5.0 g，定容至1000 mL, pH 7.0~7.5)中培養(yǎng)4d后的菌體發(fā)酵液以10000 g離心10 min，上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋后加吸取200 PL入比色板，再加入鋁銻抗顯色劑2 mL,蒸餾水定容至20 mL,靜置15-20 min后，700 nm下測(cè)定可溶性磷含量為537.142 mg/L。
[0021]本發(fā)明的一種高效解磷菌黑曲霉及其應(yīng)用已經(jīng)通過具體的實(shí)例進(jìn)行了描述，本領(lǐng)域技術(shù)人員可借鑒本
【發(fā)明內(nèi)容】
，適當(dāng)改變?cè)?、工藝條件等環(huán)節(jié)來實(shí)現(xiàn)相應(yīng)的其它目的，其相關(guān)改變都沒有脫離本發(fā)明的內(nèi)容，所有類似的替換和改動(dòng)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，都被視為包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種黑曲霉(Aspergillus niger)，其特征在于，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8240，其于2013年9月24日保藏在中國微生物菌種保藏委員會(huì)普通微生物中心。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的黑曲霉在土壤解磷方面的應(yīng)用。
3.—種微生物菌劑，其特征在于，將權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌在H)培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)液溫度為27 °C，天數(shù)為5天，轉(zhuǎn)速為200 rpm，然后過濾并調(diào)節(jié)菌液細(xì)胞數(shù)為IO8個(gè)/mL，即制得微生物菌劑。
【文檔編號(hào)】B09C1/10GK103805518SQ201310474986
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2013年10月12日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月12日
【發(fā)明者】時(shí)翠平, 趙斌, 霍靜倩, 董金皋, 張金林, 齊萌 申請(qǐng)人:河北農(nóng)業(yè)大學(xué)