頭球狀頂生孢菌及其用途
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種頭球狀頂生孢菌，其保藏名稱(chēng)為：Acrogenospora?sphaerocephala?HZ-4，保藏單位：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)；保藏日期：2013年5月26，保藏號(hào)：CCTCC?NO：M2013230。該頭球狀頂生孢菌能用于降解合成染料，合成染料例如為酸性藍(lán)40、活性紅11、酸性藍(lán)193、酸性藍(lán)62、酸性藍(lán)113、酸性紅73。
【專(zhuān)利說(shuō)明】頭球狀頂生孢菌及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種頭球狀頂生孢菌菌株及其用途---分解合成染料。
【背景技術(shù)】
[0002]許多工業(yè)生產(chǎn)，如紡織、皮革、化妝品、造紙、印染、塑料等行業(yè)，都采用化學(xué)合成染料對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行染色。但是，生產(chǎn)合成染料的原料一般是有毒、致癌甚至易爆的化學(xué)品；上述使用染料的企業(yè)中排放的廢水含有嚴(yán)重的污染物，需要進(jìn)行處理。但是對(duì)這些污染廢水進(jìn)行褪色處理非常困難，許多染料難以有效降解。一般的物理化學(xué)處理過(guò)程花費(fèi)非常高，而且容易形成二次污染，從而限制了這類(lèi)方法的普及性。而通過(guò)微生物對(duì)含有有機(jī)染料的有色污水進(jìn)行脫色降解，是效率高、成本低并且是環(huán)境友好的處理方法。
[0003]關(guān)于利用微生物或生物酶對(duì)有色污水進(jìn)行生物處理的方法研究主要集中在細(xì)菌和降解環(huán)境參數(shù)的研究上。但是，由于細(xì)菌產(chǎn)生的降解酶的種類(lèi)有限，因此對(duì)底物的專(zhuān)一性要求高，而且染料降解后還容易產(chǎn)生新的有毒物質(zhì)，極大限制了有些方法的應(yīng)用。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)有些真菌也具有降解有機(jī)染料的能力，如白腐真菌、曲霉、根霉的一些種類(lèi)，對(duì)有些染料的吸收、降解脫色效率很高。由于有色污水的產(chǎn)生條件復(fù)雜，含有染料的污水環(huán)境因子復(fù)雜多樣，需要研究開(kāi)發(fā)新的真菌進(jìn)行有色污水處理。
[0004]水生真菌是水體環(huán)境中有機(jī)物的主要初始分解者，在水體環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)中起到非常重要的作用。這類(lèi)真菌的重要特點(diǎn)就是可以產(chǎn)生多種細(xì)胞內(nèi)和/或細(xì)胞外的非特異性的降解酶，對(duì)水 體環(huán)境中的復(fù)雜多樣的有污染機(jī)物進(jìn)行有效的分解利用。因此，水生真菌是重要的處理污水的資源微生物，但是目前研究的還很少，需要進(jìn)一步篩選對(duì)染料有降解作用的真菌，明確其處理染料的范圍。
[0005]狀頂生孢菌(Acrogenospora)屬的真菌是腐生菌，目前對(duì)其在生物降解染料方面還沒(méi)有研究報(bào)導(dǎo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種頭球狀頂生孢菌，該菌株能降解合成染料。
[0007]為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供一種頭球狀頂生孢菌菌株:保藏名稱(chēng)為:Acrogenospora sphaerocephala HZ-4,保藏單位:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)；保藏日期:2013年5月26，保藏號(hào):CCTCC NO:M2013230。
[0008]本發(fā)明的頭球狀頂生抱菌菌株HZ-4 (即Acrogenospora sphaerocephalaHZ-4CCTCC NO:M2013230)具有如下特性:在PDA上，菌落灰黑色，生長(zhǎng)緩慢，氣生菌絲發(fā)達(dá)。在顯微鏡下可觀察到菌絲灰褐色至淺褐色，光滑，有隔膜。菌絲直徑2 - 4 μ m。分生孢子梗深褐色，粗大，單生，不分枝，直立或膝狀彎曲，表面光滑，中間往往有膨大，有隔膜，圓柱狀，基部黑褐色，中間深褐色，頂端色淺。100-750X4.2-7.5μπι ;產(chǎn)孢細(xì)胞單芽生，有限生長(zhǎng)，圓柱形，淺褐色，項(xiàng)生。分生孢子頂生，全壁芽生，近球形，無(wú)隔膜，淺褐色至深褐色，厚壁，連續(xù)產(chǎn)孢，孢子斷裂式分離17-30 X 15.5-30 μ m,孢子基部3.6-5.4 μ m。
[0009]本發(fā)明還同時(shí)提供了上述頭球狀頂生孢菌菌株的用途，降解合成染料，合成染料包括酸性藍(lán)40、活性紅11、酸性藍(lán)193、酸性藍(lán)62、酸性藍(lán)113和酸性紅73。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0010]下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0011]圖1為HZ-4菌株的形態(tài):其中I為分生孢子在分生孢子梗上的著生狀態(tài)；2為分生孢子梗和未成熟的分生孢子；3為分生孢子梗的整體形態(tài)；4-6為分生孢子形態(tài)。
[0012]圖2為HZ-4菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)10天的形態(tài):其中A為培養(yǎng)皿的背面特征；B為培養(yǎng)皿的正面特征。
[0013]圖3為HZ-4菌株在MEA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天對(duì)6種染料的降解情況?？梢悦黠@觀察到在菌落周?chē)玖系念伾黠@變淺(箭頭所指位置)。其中染料分別是:A是酸性藍(lán)113 ；B是活性紅11 ；C是酸性藍(lán)40 ；D是酸性藍(lán)62 ；E是酸性藍(lán)193 ；F是酸性紅73。
[0014]圖4為HZ-4菌株對(duì)6種染料的脫色率和降解率對(duì)比圖。
【具體實(shí)施方式】
[0015]實(shí)施例1、菌株HZ-4的分離: [0016]馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(potato dextrose agar, PDA):在馬鈴薯200g、葡萄糖20g、瓊脂20g中加蒸餾水定容至1000mL ;然后進(jìn)行常規(guī)的高溫滅菌(1.1個(gè)大氣壓，121°C下滅菌20min)。
[0017]2%水瓊脂(WA)培養(yǎng)基:瓊脂粉20g、水1000mL,進(jìn)行常規(guī)的高溫滅菌(1.1個(gè)大氣壓，121°C下滅菌 20min)。
[0018]氯霉素儲(chǔ)備液:將340mg氯霉素溶解在IOmL的無(wú)水乙醇中備用。
[0019]鏈霉素儲(chǔ)備液:將IOOmg鏈霉素溶解在IOmL的滅囷水中備用。
[0020]在實(shí)驗(yàn)室中按下列條件分離培養(yǎng)，即可獲得本發(fā)明所述的頭球狀頂生孢菌。
[0021]HZ-4菌株是從我國(guó)浙江杭州溪流(東經(jīng)80° 12’13.68’’，北緯120。7，11.28，，)的腐木上分離獲得的。將長(zhǎng)時(shí)間浸泡在溪流中的腐木收集帶回實(shí)驗(yàn)室，用自來(lái)水漂洗干凈，放在用浸過(guò)水的脫脂棉保濕的塑料袋中，密封培養(yǎng)3個(gè)月(培養(yǎng)溫度為20~30°C)。每隔10天檢查I次，發(fā)現(xiàn)有菌體產(chǎn)孢后，用尖頭小鑷子取少量孢子，置于含有0.5毫升無(wú)菌水的1.5毫升離心管中，用移液器上下吹打幾次，使之分散均勻。取100 μ L孢子液滴在血球計(jì)數(shù)板上，顯微鏡下計(jì)數(shù)。根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果，在原來(lái)的孢子液中加入適量的無(wú)菌水，配成濃度為100個(gè)孢子/mL的孢子液。將IOOmL的2%水瓊脂(WA)培養(yǎng)基融化后，室溫冷卻至50°C，再加入氯霉素儲(chǔ)備液和鏈霉素儲(chǔ)備液各IOOmL,混勻后倒平板。取10微升調(diào)好濃度的孢子液滴在上述含氯霉素和鏈霉素水瓊脂(WA)平皿上，每皿滴20滴，滴5個(gè)培養(yǎng)皿。25°C暗培養(yǎng)2天后，將培養(yǎng)皿背面向上放在40倍顯微鏡下觀察滴有孢子液的位置，將確認(rèn)為單孢子萌發(fā)形成菌絲的位置用記號(hào)筆標(biāo)記，然后在無(wú)菌操作臺(tái)上移接到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天，獲得純培養(yǎng)物。
[0022]該菌為頭球狀頂生孢菌菌株，進(jìn)行了如下保藏:保藏名稱(chēng)為Acrogenosporasphaerocephala HZ-4,保藏單位:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心,保藏地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)；保藏日期:2013年5月26，保藏號(hào)=CCTCC NO:M2013230。
[0023]實(shí)施例2、菌株HZ-4的鑒定:
[0024]2.1形態(tài)鑒定:將純化的HZ-4菌株轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，25°C培養(yǎng)10天。用挑針挑取少量菌體，制成玻片，在顯微鏡下觀察，測(cè)量，拍照。其形態(tài)特征為:
[0025]在PDA上，菌落灰黑色，生長(zhǎng)緩慢，氣生菌絲發(fā)達(dá)?；液稚翜\褐色，光滑，有隔膜。菌絲直徑2-4 μ m。分生孢子梗深褐色，粗大，單生，不分枝，直立或膝狀彎曲，表面光滑，中間往往有膨大，有隔膜，圓柱狀，基部黑褐色，中間深褐色，頂端色淺。100-750X4.2-7.5 μ m;產(chǎn)孢細(xì)胞單芽生，有限生長(zhǎng)，圓柱形，淺褐色，項(xiàng)生。分生孢子頂生，全壁芽生，近球形，無(wú)隔膜，淺褐色至深褐色，厚壁，連續(xù)產(chǎn)孢，孢子斷裂式分離17-30X 15.5-30 μ m，孢子基部3.6-5.4 μ m。分生孢子和分生孢子梗形態(tài)如圖1所示，菌落生長(zhǎng)狀態(tài)如圖2所示。
[0026]2.2分子鑒定:
[0027]2.2.1真菌基因組DNA的小量提取
[0028]2.2.1.1 提取緩沖液:含有 IM KCl, I=1OOmM Tris-HCl, I=1OmM EDTA, ρΗ=8.0。
[0029]2.2.1.2 提取方法:
[0030](1)ΗΖ-4菌株在PDA平板上生長(zhǎng)14天后，用牙簽刮取平板上的菌絲，放入已滅菌的含有500 μ L提取緩沖液1.5mL離心管中；
[0031](2)用電磨機(jī)將挑取的菌絲搗碎，9000rpm離心I=1Omin ；
[0032](3)吸取上清至另一離心管中，棄沉淀；
[0033](4)加入等體積的異丙醇(分析純)，沉淀核酸，輕輕顛倒混勻數(shù)次后，12000rpm離心 IOmin ；
[0034](5)輕輕倒去上清液，在吸水紙上排干水分；
[0035](6)加入800 μ L70%乙醇，輕輕顛倒混勻數(shù)次后，12000rpm離心2min ；
[0036](7)輕輕倒去上清液，在吸水紙上排干水分，置于37°C下15min，使乙醇充分揮發(fā)；
[0037](8)用50 μ L ddH20重懸沉淀，得到HZ-4基因組DNA，濃度達(dá)到30ng/ μ L。
[0038]2.2.2.真菌 18s rDNA 基因的 PCR 擴(kuò)增
[0039]采用50 μ L反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系中含有:上下游引物各2 μ M，dNTPs200 μ M, Mg2+L 5mM, 10XPCR buffer5 μ L，模版 DNA2 μ L, Taq 酶 2U。
[0040]上游引物NSl 序列為 5' -GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'，
[0041]下游引物NS4 序列為 5' -CTTCCGTCAATTCCTTTAAG-3'。
[0042]PCR擴(kuò)增反應(yīng)在朗基MG96G型PCR儀上進(jìn)行。反應(yīng)條件:94°C預(yù)變性2min，然后35個(gè)循環(huán)包括:94°C變性30sec，57°C退火40sec，72°C延伸lmin。最后72°C后延伸lOmin。
[0043]2.2.2.3PCR產(chǎn)物的回收純化:
[0044]PCR反應(yīng)結(jié)束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，采用愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)公司的DNA凝膠純化試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行。
[0045]步驟如下:
[0046](I=1)電泳結(jié)束后，在紫外燈下用刀片切取含目的DNA片段的凝膠，置于2mL離心管中,稱(chēng)重；
[0047](2)加入3倍體積的DE-A緩沖液，75°C保溫lOmin，期間振蕩數(shù)次，至完全融化。[0048](3 )加入0.5個(gè)倍體積的DE-B緩沖液，混合均勻。
[0049](4)將DNA制備管放入2mL離心管中，將混合液轉(zhuǎn)移到DNA制備管中，12000rpm離心lmin,棄上清。
[0050](5)將DNA制備管放回2mL離心管中，加50(^1^緩沖液11，12000rpm離心30s。
[0051](6)將DNA制備管放回2mL離心管中，加70(^1^緩沖液12，12000rpm離心30s。
[0052](7)重復(fù)步驟(6)—次。
[0053](8)將DNA制備管放回2mL離心管中，12000rpm離心2min。以排干膜上洗滌液；
[0054](9)將DNA制備管放回2mL離心管中，加50 μ L的ddH20, 1000Orpm離心lmin,洗脫DNA置-20°C下保存。
[0055]2.2.2.4基因的測(cè)序和序列分析
[0056]將純化回收的目的DNA片段經(jīng)電泳檢測(cè)后送至上海生工用ABIPRISMA377型自動(dòng)測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果經(jīng)過(guò)嚴(yán)格核對(duì)后，得到序列表中981bp的DNA片段序列。
[0057]將測(cè)得的核苷酸序列用BLAST在GenBank中查找和比對(duì)同源或相似的核苷酸序列。根據(jù)同源序列的 數(shù)據(jù)庫(kù)注釋?zhuān)俳Y(jié)合菌株的形態(tài)結(jié)構(gòu)來(lái)判斷所研究菌株的種屬。經(jīng)過(guò)BLAST比對(duì)，該序列與登錄號(hào)為⑶296129和AY541482的序列覆蓋率100%，相似度達(dá)到99%。這兩個(gè)序列都是來(lái)自頭球狀頂生抱菌(Acrogenospora sphaerocephala)的18s rDNA,其有形態(tài)為Farlowiella carmichaeliana。這些結(jié)果表明分子鑒定與形態(tài)鑒定結(jié)果相符。
[0058]實(shí)施例3、
[0059]3.1所需培養(yǎng)基和染料:
[0060]2%麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(malt extract agar, MEA):在麥芽浸出粉20g、瓊脂20g中加蒸餾水定容至1000mL ;然后進(jìn)行常規(guī)的高溫滅菌(1.1個(gè)大氣壓，121°C下滅菌20min)。
[0061]將待測(cè)的11種染料各自溶解于水中，配成lOOmg/mL的儲(chǔ)備液，過(guò)濾(過(guò)濾膜的孔徑是0.22 μ m)除菌，得過(guò)濾除菌染料(11種)。
[0062]含染料固體培養(yǎng)基:在已滅菌的IOOmL的2%麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基(MEA培養(yǎng)基)中加入50 μ L的過(guò)濾除菌染料。
[0063]含染料液體培養(yǎng)基:麥芽浸出粉20g加蒸餾水定容至1000mL,分裝在三角瓶中，每瓶100mL。然后進(jìn)行常規(guī)的高溫滅菌(1.1個(gè)大氣壓，121°C下滅菌20min)。在已滅菌的IOOmL麥芽汁培養(yǎng)基中加入50 μ L的過(guò)濾除菌染料。
[0064]供試染料有11種:酸性藍(lán)40，活性紅11，酸性藍(lán)193，酸性藍(lán)62，酸性藍(lán)113，活性藍(lán)194，酸性紅73，活性紅24，活性黃2，活性黃18，活性藍(lán)74。
[0065]3.2、菌種活化:將純化保存的ΗΖ-4菌株接種到固體PDA培養(yǎng)基平板上，28°C培養(yǎng)10天。
[0066]3.3、菌種脫色降解能力，即降解合成染料能力的檢測(cè)
[0067]3.3.1固體平板上篩選可降解的染料種類(lèi):
[0068]用直徑Icm的打孔器從活化菌株培養(yǎng)基上打孔接種到上述含染料的培養(yǎng)基平板上，28°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5d。.結(jié)果發(fā)現(xiàn)在菌落的底部和/或邊緣出現(xiàn)明顯的褪色環(huán)的染料有6種，分別是酸性藍(lán)40，活性紅11，酸性藍(lán)193，酸性藍(lán)62，酸性藍(lán)113和酸性紅73。如圖3所示。
[0069]對(duì)上述6種染料繼續(xù)進(jìn)行如下檢測(cè)。[0070]3.3.2液體培養(yǎng)基中檢測(cè)HZ-4菌株對(duì)染料的降解作用:
[0071]為了確定各個(gè)染料的最大吸收波長(zhǎng)，我們首先對(duì)添加染料的液體培養(yǎng)基在300nm-900nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，分別確定每種染料的最大吸收波長(zhǎng)。然后將HZ-4菌株接種到含有染料的液體培養(yǎng)基中，測(cè)定菌株對(duì)每種染料的降解情況。
[0072]將HZ-4菌株接種到內(nèi)裝300mL麥芽汁培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，在28°C條件下150rpm搖床培養(yǎng)5d。然后吸取ImL培養(yǎng)物(約為100個(gè)菌落/ml)分別接種于含染料液體培養(yǎng)基50mL的三角瓶中，28°C振蕩培養(yǎng)3d。隨后4800rpm離心IOmin取上清，為了檢測(cè)HZ-4菌株對(duì)各種染料在液體中的去除情況，我們?cè)谌玖系淖畲笪詹ㄩL(zhǎng)處測(cè)定菌液OD值，計(jì)算染料脫色率。
[0073]脫色率=(A-B)/AX100% (I)
[0074]式中，A-表示接種前培養(yǎng)基的OD值；
[0075]B-表示脫色后培養(yǎng)液的OD值。
[0076]為了檢測(cè)HZ-4菌株對(duì)各種染料在液體中的去除作用是由于將染料降解還是由于菌體對(duì)染料的吸附作用 ，我們測(cè)定了 HZ-4菌株對(duì)每種染料的降解率:用乙醇抽提法將被菌體吸附的染料洗脫下來(lái)(培養(yǎng)基:乙醇抽提液=1:1)，同樣離心取上清，以未加染料只加乙醇的培養(yǎng)基為空白，以染料培養(yǎng)基為對(duì)照，在各染料的最大吸收波長(zhǎng)處用Lambda45型分光光度計(jì)測(cè)定被洗脫下的染料培養(yǎng)液的OD值，計(jì)算染料降解率，以降解表示菌株的降解能力:
[0077]降解率=(C-D)/CX 100% (2)
[0078]式中，C-表示加入等體積乙醇的不接種培養(yǎng)基的OD值；
[0079]D-用乙醇洗脫后的培養(yǎng)液的OD值。
[0080]表1可以被HZ-4菌株降解的6種染料的最大吸收波長(zhǎng)、脫色率和降解率
【權(quán)利要求】
1.頭球狀頂生孢菌，其特征是:保藏名稱(chēng)為:Acrogenosporasphaerocephala HZ-4,保藏單位:中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)；保藏日期:2013年5月26，保藏號(hào):CCTCC NO:M2013230o
2.如權(quán)利要求1所述的頭球狀頂生孢菌的用途，其特征是:降解合成染料。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的頭球狀頂生孢菌的用途，其特征是:所述合成染料為酸性藍(lán).40、活性紅11、酸性藍(lán)193、酸性藍(lán)62、酸性藍(lán)113和酸性紅73中的至少一種。
【文檔編號(hào)】C02F3/34GK103614300SQ201310551746
【公開(kāi)日】2014年3月5日 申請(qǐng)日期:2013年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2013年11月8日
【發(fā)明者】王洪凱, 林福呈 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)